专利名称：在改进的常规分批反应器中使用稳定的酵母结晶生产乙醇的方法几十年来，乙醇都是生物技术生产的最大量的化学物质之一。其需求的不断增长主要归因于其作为溶剂、杀菌剂、防冻剂以及生产各种有机化合物的原料的作用，这类有机化合物例如乙醛、乙酸、丁二烯和乙烯等等。此外，其作为有价值的替代运输燃料来源的重要性，重新激发了对于开发更高乙醇产率的改进发酵方法的兴趣。即使今天，乙醇生产仍通过使用酵母菌(Saccharomyces cereviceae)培养物的常规分批发酵技术进行。这种使用酵母的乙醇发酵方法需要维持酵母培养物，以及预发酵来得到主发酵所需的酵母生物体数量。至今，已经多次尝试用游离的或固定的酵母细胞来强化乙醇生产。游离细胞发酵通常在分批反应器中使用加入到稀释糖蜜溶液中的酵母菌进行24-48小时，并且对每一批均需要发育酵母[S.V.Ramakrishna，V.P.Sreedharanand P.Prema.InBioreactor Immobilized Enzymes and CellsFundamentalsand Applications(Ed MoodYoung)，Elsevier Appl.Sci.，Amsterdam，1988，251-260]。该分批方法的一些主要缺点是生产力低、发酵时间长、操作和总投资高[D.Das，R.G.Nandkishor，K.Murali and P.S.Gupta J.Ferment.Bioengg.1993，75，132-137；D.Weuster-Botz Appl.Microbiol.Biotechnol，1993，39，679-684]。已经尝试了多种替代的发酵策略来增加系统中单位体积的生产力，所述替代策略如Boinot发酵法[J.M.Lagomasino，InternationlSugar Journal，1949，51，338-342]，连续流动发酵[J.L.McCarthy，InIndustrial fermentations(Ed.L.A.Underkofler and R.J.Hickey)，1954，Vol.1，p95；Chem.Pub.Co.，New York]，在发酵器中使用较高细胞密度、通过使用细胞循环的连续操作方式实现更大的生产量[C.W.Lee and H.N.Chang Biotehcnol.Bioengg，1987，29，1105-1112]，提取发酵[M.Minier andG.Goma，Biotehcnol.Bioengg.1982，24，1565-1579]以及通过各种技术的全细胞固定化[S.V.Ramakrishna and R.S.Prakasham Current Science，1999，77，87-100]。但这些方法都存在缺陷，即每一批中都需要加入酵母细胞。使用细胞再循环[E.J.DelRosario，K.J.Lee and P.L.Rogers，BiotechnologyBioengineering，1979，21，1477；T.K.Ghosh and R.D.Tyagi Biotechnol.Bioengg，1979，21；1387；GH.Gil，W.J.Jones and T.G.Tornabene EnzymeMicrob.Technol.，1991，13；390]和真空发酵[GR.Cysewski and C.R.WilkeBiotechnol.Bioengg，1977，19；1125]的连续发酵可使生产能力显著提高。然而，所述细胞再循环系统使用相当的成本投入来从所述发酵培养液中分离酵母细胞。一种受到广泛关注的替代方法是高细胞密度发酵法。在这点上，许多研究者试图采用固定的酵母细胞替代游离细胞[R.Jamuna andS.V.Ramakrishna Biomass Bioenergy，1992，3，117-119]。试图用多种类型的反应器配置通过包被细胞来生产乙醇[F.Godia，C.Casad，and C.SolaProcess Biochem，1987，43-48]。使用包被细胞的一个主要局限是发酵过程中产生的气体被包围在凝胶粒子中，从而降低了颗粒的密度并使其碎裂[S.V.Ramakrishna，V.P.Sreedharan and P.Prema.InBioreactor ImmobilizedEnzymes and CellsFundamentals and Applications(Ed MoodYoung)，Elsevier Appl.Sci.，Amsterdam，1988，251-260]。近来，S.V.Ramakrishna等人(1999)开发了稳定的酵母结晶，并证明其可循环多次[S.V.Ramakrishna，R.S.Prakasham and P.Komariah，印度专利申请第186/DEL/2000号；美国申请第09/538181号]。使用酵母结晶的主要局限是发酵过程中其倾向于漂浮在发酵培养液表面，从而降低乙醇的生产速度。本发明的新颖性在于使用活化的酵母结晶在改进的常规分批反应器中进行发酵，从而大幅减少了发酵时间，并提高了乙醇的生产速度。发明目的本发明的主要目的是提供在改进的常规分批反应器中使用新型活化的成簇酵母结晶(yeast crystal)来生产乙醇的方法。本发明的另一目的是提高乙醇的生产速度。本发明的再一目的是在不扩展和影响乙醇产率的前提下使现有的酿酒生产能力提高超过250％。本发明的再一目的是提供成本高效的生产乙醇的方法。本发明的再一目的是缩短发酵时间。发明概述除其它外，本发明的新颖性在于通过在改进的常规分批反应器中使用活化的稳定酵母结晶将发酵时间从28-36小时缩短为8-16小时，并显著提高了乙醇生产速度。与常规游离细胞发酵相比，本发明还可使现有酿酒能力增加到250％而无需太大的机械扩张，并且提高每吨所用糖蜜的酒精产率。
因此，本发明提供在改进的常规分批反应器中使用活化的稳定酵母结晶生产乙醇的方法，所述方法包括将稳定的酵母结晶混入比重为1.030-1.060的低张力糖蜜溶液中，并对其中的稳定酵母结晶进行培养，得到活化的稳定酵母结晶；分离所述活化的稳定酵母结晶；在装配有低速机械搅拌的改进发酵容器中将所述低张力的糖蜜溶液转化为比重1.09-1.1的糖蜜发酵培养液，估计发酵培养液中的初始糖浓度；以0.5-2.0％W/V比例将所述活化的稳定酵母结晶加入上述发酵培养液中，并对所得混合物进行发酵；当发酵培养液的比重达到1.014-1.045时终止发酵，从发酵培养液中分离所述活化的酵母结晶，并从发酵培养液中回收乙醇。
在本发明一优选实施方案中，在24-36℃的温度下将所述稳定的酵母结晶在所述低张力糖蜜溶液中培养4-48小时。
在本发明另一实施方案中，通过将糖蜜与水混合得到所述低张力糖蜜溶液。
在本发明另一实施方案中，所述发酵在28-40℃的温度下进行8-16小时。
在本发明另一实施方案中，优选向所述发酵培养液中加入0.5-1.5％(W/V)的所述活化的稳定酵母结晶。
在本发明另一实施方案中，通过排出所述溶液或通过网或带孔底部(perforated bottom)过滤来从所述糖蜜溶液中分离出所述活化的稳定酵母结晶。
在本发明另一实施方案中，通过稀释或机械混合将糖蜜与水混合来制备所述比重1.030-1.060的低张力糖蜜溶液。
本发明中，根据我们早期的专利中所述的方法制备稳定的酵母结晶[S.V.Ramakrishna，R.S.Prakasham and P.Komariah，印度专利申请第186/DEL/2000号；美国申请第09/538181号]。
发明的详细说明参照以下实施例对本发明在改进的常规分批反应器中使用活化的稳定酵母结晶生产乙醇的改进方法进行描述，这些实施例仅以示例方式进行说明，因此不应理解为对本发明范围的限制。
实施例1在常规分批反应器中使用活化的酵母结晶生产乙醇从当地糖厂购进甘蔗糖蜜，并贮藏在4℃直到进一步使用。如早期专利[印度专利申请第186/DEL/2000号；美国申请第09/538181号]中所述制备稳定的酵母结晶，并通过在28℃在比重1.060的糖蜜溶液中培养8小时来活化。
通过将所述糖蜜用水稀释至比重1.090的溶液来制备发酵培养液(100升)，并使用常规方法检测所述发酵培养液中的初始糖浓度。
从活化溶液中分离出所述活化的稳定酵母结晶，并向常规的发酵容器中加入1％的这些结晶。在30℃继续发酵，直至发酵培养液的比重达到1.024。然后分离出所述活化的稳定酵母结晶，而滤液用于回收乙醇。在常规反应器中使用活化的稳定酵母结晶进行的乙醇生产如下。
表1
实施例2在改进的常规反应器中使用活化的酵母结晶生产乙醇在本实验中再循环利用所述活化的稳定酵母结晶。将转速90rpm的带水翼叶轮的低速机械搅拌器装配在常规1000升发酵容器上。通过将所述糖蜜用水稀释至比重1.090的溶液来制备发酵培养液(100升)，并使用常规方法检测所述发酵培养液中的初始糖浓度。
向改进的发酵容器中加入所述活化的稳定酵母结晶(1％)。在所述改进的发酵容器中在30℃和恒定的混合条件下连续发酵，直至发酵培养液的比重达到1.024。然后分离出所述活化的稳定酵母结晶，而滤液用于回收乙醇。在改进的常规反应器中使用活化的稳定酵母结晶进行的乙醇生产如下。
表2
实施例3在常规分批反应器中使用活化的酵母结晶生产乙醇如试验2中进行相同的实验。在本实验中再利用先前实验中的所述活化的稳定酵母结晶。在常规发酵容器中，通过将所述糖蜜用水稀释至比重1.090的溶液来制备发酵培养液(75升)，并使用常规方法检测所述发酵培养液中的初始糖浓度。
向发酵培养液中加入1％活化的稳定酵母结晶。在30℃连续发酵30小时。然后分离出所述活化的稳定酵母结晶，而滤液用于回收乙醇。在常规反应器中使用活化的稳定酵母结晶进行的乙醇生产如下。
表3
实施例4在改进的常规反应器中使用活化的酵母结晶生产乙醇如试验2中进行相同的实验。在本实验中使用所制备的活化的稳定酵母结晶和改进的常规发酵容器。向该改进的常规发酵容器中加入75升比重1.090、初始糖浓度为14.90％的发酵培养液。向该发酵培养液中加入1％(W/V)活化的酵母结晶。在所述改进的发酵容器中在30℃和恒定的混合条件下连续发酵11小时。然后分离出所述活化的稳定酵母结晶，而滤液用于回收乙醇。在改进的常规反应器中使用活化的稳定酵母结晶进行的乙醇生产如下。
表4
实施例5在常规分批反应器中使用活化的酵母结晶生产乙醇类似实施例3使用高比重发酵溶液进行相同的实验。在本实验中再利用先前实验中的活化的稳定酵母结晶。在常规发酵容器中，通过将所述糖蜜用水稀释得到100升比重1.098的发酵培养液，并使用常规方法检测所述发酵培养液中的初始糖浓度。向发酵容器中加入1％的活化的稳定酵母结晶。在30℃连续发酵，直至发酵培养液的比重达到1.038。然后分离出所述活化的稳定酵母结晶，而滤液用于回收乙醇。在常规反应器中使用活化的稳定酵母结晶进行的乙醇生产如下。
表5
实施例6在改进的常规反应器中使用活化的酵母结晶生产乙醇使用高比重发酵溶液进行相同的实验。在本实验中使用所制备的活化的稳定酵母结晶和改进的常规发酵容器。向该改进的常规发酵容器中加入100升比重1.098、初始糖浓度为16.71％的发酵培养液。向该发酵培养液中加入1％(W/V)的活化的酵母结晶。在所述改进的发酵容器中在30℃和恒定的混合条件下继续发酵，直至发酵培养液的比重达到1.034。然后分离出所述活化的稳定酵母结晶，而滤液用于回收乙醇。在改进的常规反应器中使用活化的稳定酵母结晶进行的乙醇生产如下。
表6
实施例7在常规的和改进的分批反应器中使用活化的酵母结晶进行的乙醇发酵过程的对比评价将实施例1和2中的在常规的和改进的分批反应器中使用活化的酵母结晶进行的乙醇发酵进行对比，来评价本发明的优点。
表7
实施例8在常规的和改进的分批反应器中使用活化的酵母结晶和高密度发酵培养液进行的乙醇发酵过程的对比评价将实施例5和6中的在常规的和改进的分批反应器中使用活化的酵母结晶和高密度发酵培养液(所述发酵培养液的比重超过1.097)进行的乙醇发酵进行对比，来评价本发明的优点。
表8
本发明的优点1.本发明的主要优点是根据发酵培养液的初始比重将分批发酵时间从28-44小时缩短至8-16小时。
2.本发明的另一优点是增加了分批发酵过程中每吨所用糖蜜的乙醇产率。
3.本发明的另一优点是提高了乙醇生产速度。
4.本发明的再一优点是在最少改变现有基本发酵器结构的条件下将设备能力提高至超过250％。
5.本发明的再一优点是减少产物抑制。
6.本发明的再一优点是提供了成本高效的乙醇发酵方法。


乙醇需求的不断上升是因为其可用作有机溶剂或者生产多种有机溶剂的起始化合物。此外，其可替代天然石油作为供能燃料。常规的乙醇生产方法主要是通过分批发酵来进行的，其每批都需要加入新鲜酵母作为种子培养物，并且需要维持酵母培养物，因此该方法成本高且需要特别专业的微生物学技术。在这种背景下，近期开发的酵母结晶解决了上述某些问题。然而，通过发酵开发的生物催化结晶在发酵过程中倾向于漂浮在发酵培养液的表面，因此延长了发酵时间并降低了乙醇发酵速度。本发明的新颖性在于使用活化的酵母结晶在改进的常规分批反应器中进行发酵，从而大幅减少了发酵时间，并提高了乙醇的生产速度。