专利名称：山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法本发明涉及基因敲除载体，尤其涉及一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法。肌肉生长抑制素，即MSTN，也被称为“生长分化因子8”，是TGF- β超蛋白家族成员之一，具有抑制骨骼肌分化的作用。MSTN与动物骨骼肌总量的调节有关，其功能的缺失会造成骨骼肌异常肥大。在牛中，MSTN基因保守功能区的一个突变与产肉量密切相关，该突变纯合体及杂合体肉牛均表出肌肉发达、初生重增加和生长速度快的优势。采用基因打靶制备的MSTN基因敲除小鼠，其骨骼肌重量是普通小鼠的2倍以上，而脂肪比例并未随之增加， 表明MSTN基因的缺失或突变将引起其骨骼肌重量的显著增加。因此，生产MSTN基因敲除山羊，可望提高山羊胴体瘦肉率，达到提高饲料利用率、降低饲养成本的目的。基因打靶也被称为“位点特异性同源重组”或“基因敲除”，是20世纪80年代后半期兴起的一种以基因同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础的遗传操作技术。该项技术利用外源DNA与细胞基因组DNA同源序列发生同源重组对细胞基因组进行定点修饰，可实现外源基因的定点整合，使人类定向改造生物遗传信息的期望付诸现实。目前，小鼠等啮齿动物的基因打靶技术已经比较成熟，众多学者利用基因定点敲除小鼠研究哺乳动物的基因功能。由于缺乏成熟的胚胎干细胞系，猪、牛、羊等大型哺乳动物的胚胎干细胞基因打靶一直未能实现。近年来，体细胞克隆技术的发展为基因敲除大型动物的生产提供了有效的技术支撑。若对体细胞进行基因敲除，再以靶细胞为核供体进行体细胞克隆，可获得基因敲除动物，采用此技术途径生产的的基因敲除猪、牛、羊已相继诞生。在体细胞中进行基因打靶已获得成功，但体细胞发生同源重组的机率偏低，通常只有10_6 10_7。已有的研究发现同源序列的同源性及同源序列的长度是影响同源重组效率的主要因素，即当载体中采用与打靶目的细胞系完全相同的同源序列时，可获得5 20倍提升的同源重组效率性；另外，当载体同源序列从4kb增加至9kb时，基因靶位操作效率增加10倍。因此，在获得同源序列时，不但要保证其具有相当的长度，还要保证其具备高度同源性。本发明要解决的技术问题是提供一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法，包括如下步骤(I)设计4对引物，2对引物用于山羊胎儿成纤维细胞基因组DNA中扩增片段，即扩增出MSTN基因同源长臂的引物LAF和LAR和扩增出MSTN基因同源短臂的引物SAF和 SAR ;另2对引物用于鉴定pLOXP-MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞获得抗性克隆细胞，即用于从pLOXP-MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞中扩增同源短臂的引物SAFl和SARl ;用于从 pLOXP-MSTN转染山羊胎儿成纤维细胞中扩增基因neo部分序列的引物NF和NR ；(2)采取分步克隆策略构建最终打靶载体；pL0XP载体包含正向选择基因neo表达元件、负向选择基因HSV-tk表达元件以及质粒骨架；将pLOXP和pMD18-T-SA分别用Sail、 BamHI双酶切，凝胶电泳回收相应的片段，其中pLOXP酶切回收约为8. Okb的载体大片段， PMD18-T-SA酶切回收的是约I. 9kb的SA片段，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经鉴定后得到含有重组载体pLOXP-SA的克隆；将载体pLOXP-SA和pMD18_T_LA 分别用Notl、XhoI双酶切，凝胶电泳回收相应片段(pLOXP-SA酶切回收约为9. 9kb的载体大片段，PMD18-T-LA酶切回收约4. 6kb的LA片段)后，用T4DNA连接酶连接，转化转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后筛选重组子，提取质粒后经酶切鉴定最后得到山羊成纤维细胞 MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN ；(3)将打靶载体的线性化后，转染山羊胎儿成纤维细胞系，利用含G418的培养液对转染细胞筛选5至10天后，获得抗性细胞，提取抗性细胞克隆DNA进行PCR鉴定，并进行基因序列测序以进一步验证，获得MNST基因敲除的山羊胎儿成纤维细胞。本发明的有益效果是用Long-PCR方法等构建Myostatin基因敲除载体,并对山羊胎儿成纤维细胞进行转染，获得基因敲除细胞。运用此项技术，可以获得高瘦肉率动物，构建MNST基因敲除的山羊模型，为进一步研究该基因在山羊中的功能具有重要的意义。一、材料安徽白山羊胎儿成纤维细胞由本校实验室提供；打靶载体pLOXP由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供；pMD18-T载体、高保真长片段Tap聚合酶和DNA Marker标准、 限制性内切酶，即Xhol，SaLI，NotI和BamHI以及T4DNA连接酶等均购自大连宝生物工程有限公司；质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司；大肠杆菌DH5a、细胞基因组DNA提取试剂盒、凝胶纯化回收试剂盒购自北京天根科技生化有限公司。无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒购自 QIAGEN 公司；转染试剂 Basic Nucleofector kit 购自 LONZA 公司。二、方法(I)引物设计与合成由于目前尚无山羊MSTN基因的序列报道，所以根据GenBank中绵羊⑶F_8基因的序列设计山羊MSTN基因PCR扩增引物。所设计引物序列见表I。表I引物序列本发明公开了一种山羊Myostatin基因敲除载体的构建方法。该方法根据绵羊Myostatin基因序列，设计了两对PCR引物，以山羊胎儿成纤维细胞中提取的基因组DNA为模板，采用高保真长片段Taq酶，通过Long-PCR方法来扩增获得同源臂，同源长短臂分别为4.6kb和1.9kb。为验证所得到的同源臂序列是否可用，将扩增片段分别克隆到pMD18-T载体上，酶切、PCR鉴定后进行序列测定及同源性比较。再将同源长、短臂分别克隆到载体pLOXP，后用酶切、PCR方法进行鉴定。筛选得到构建含有neo和HSV-tk正负筛选标记基因的MNST基因打靶载体pLOXP-MSTN。本发明用Long-PCR方法等构建Myostatin基因敲除载体，并对山羊胎儿成纤维细胞进行转染，获得基因敲除细胞。运用此项技术，可以获得高瘦肉率动物，构建MNST基因敲除的山羊模型，为进一步研究该基因在山羊中的功能具有重要的意义。