专利名称：一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株及其制备方法一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株及其制备方法本发明涉及一种人小细胞肺癌细胞株及其制备方法，尤其是一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株及其制备方法。肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，因此，深入研究肿瘤发生、发展和转移的分子机制，寻找更为有效的肿瘤治疗方案，成为当今医学研究的前沿课题。随着肿瘤生物学研究的不断深入，肿瘤的早期诊断及预防水平有了较大的提高，但是肿瘤治疗后的高转移及高复发仍是肿瘤临床治疗中一个亟待解决的难题。近年来，“肿瘤干细胞”学说的提出及其研究进展，从一个全新的角度去认识肿瘤。该学说认为，肿瘤中存在一部分独特的具有自我更新和分化功能的干细胞样亚群并将之称为肿瘤干细胞，这一亚群细胞正是肿瘤的起源细胞并维持肿瘤的生长。因此，肿瘤细胞株是研究细胞癌变机理、肿瘤转移、肿瘤放疗和化疗敏感性分子基础等生物医学问题的重要材料，建立和鉴定不同的肿瘤细胞株是一项很有意义的工作。
本发明的目的是提供一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株，所述细胞株具有典型的肿瘤细胞生物学特性；同时，还提供一种所述细胞株的制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株，命名为人小细胞肺癌细胞株0225-llScac，保藏号为CCTCC NO C201025。所述细胞株在倒置显微镜下观察细胞体积小，核大，胞浆少，细胞与平皿之间贴附生长，贴附不紧密，细胞可成团半悬浮生长。所述细胞株的体外倍增时间为30. 75h。所述细胞株的蛋白表达特征为NSE阳性表达。本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-1 IScac，是一株有神经内分泌表达的中国南方人肺小细胞癌细胞系，是原始病人来源的肺癌组织经NOD-SCID鼠体内生长形成移植瘤后在体外培养成功的一株细胞系，原始肺癌组织来源于一位54岁男性肺癌病人的左肺门肿瘤病灶。病人在手术前一年接受了放疗和化疗，药物疗程和射线剂量如下VP16+DDP 2 疗程，放疗56gy (28天)，紫杉醇+DDP 3疗程，肺门和纵隔淋巴结变小。手术前3个月又出现肺门肿物增大，痰中找到肿瘤细胞，即行拓扑替康+DDP 3疗程，肺门肿物见缩小后即实行手术。本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-llScac，是发明人从病理类型为小细胞肺癌的肺癌病人经历过VP-16、卡钼和紫杉醇化疗和肺局部放疗后肺部复发肿块切除物中培养成功所得，经病理鉴定为小细胞肺癌放化疗后，所述细胞株为上皮样细胞，具有典型的肿瘤细胞生物学特性，能在体外连续长期传代，在体外培养一年，传100多代，细胞仍然生长增殖活跃。一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株的制备方法，包括以下步骤(1)组织块 机械解离将切除的人小细胞肺癌放化疗后复发病灶组织解离，清洗去除杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；(2)胶原酶消化将步骤(1)得到的剩余的组织切成组织片，清洗，然后向组织片加入胶原酶，孵育，过滤，然后收集肿瘤细胞，进行接种培养，得到存活细胞；(3)对步骤(2)得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法包括以下步骤(1)组织块机械解离将切除的人小细胞肺癌放化疗后复发病灶组织解离，清洗去除粘液和红细胞等杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；
(2)胶原酶消化将步骤(1)得到的剩余的组织切成Imm3的组织片，清洗组织片，让组织片沉淀，去除上清液，把剩余组织再细切，清洗组织碎片，然后向组织片加入胶原酶，在 37°C下孵育4-18小时；过滤，然后收集肿瘤细胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞；
(3)对步骤(2)得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)为将切除的人小细胞肺癌放化疗后复发病灶组织解离成0. 5cm3，用100%的青-链霉素双抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质，再浸泡于培养基中移至解剖显微镜下，用两个10号注射器针头分离肺癌实质组织，去除夹杂的正常肺泡及支气管组织和间质组织，得到剩余的组织。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(2)为使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)得到的剩余的组织切成Imm3的组织片，用PBS缓冲液清洗组织片，让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200单位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小时，通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，然后收集肿瘤细胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞。更优选地，步骤(2)中，加入胶原酶的同时还加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高胶原酶对组织的解离效率。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(3)中纯化后的肺癌细胞的培养温度为37°C，气体环境为5%C02/95%空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每5天传代一次。采用本发明所述制备方法得到的来源人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株， 是从病理类型为小细胞肺癌的肺癌病人经历过VP-16、卡钼和紫杉醇化疗和肺局部放疗后肺部复发肿块切除物中培养成功所得，经病理鉴定为小细胞肺癌放化疗。所得细胞株为上皮样细胞，具有典型的肿瘤细胞生物学特性，它能在体外连续长期传代，在体外培养一年，传100多代，细胞仍然生长增殖活跃。所得细胞株经检测，其一般生物学特性表明，所述细胞株为上皮样细胞，细胞小，胞浆较少，可成团悬浮生长，也可贴壁生长，贴壁松散，接触性生长抑制消失。



图1为本发明所述细胞株在倒置显微镜下的形态图。图2为本发明所述细胞株种植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤组织的形态图。

本发明一种来源于人肺未分化癌的细胞株，按照以下制备方法所得
(1)组织块机械解离将手术切除的人小细胞肺癌放化疗后复发病灶组织以消毒小剪刀迅速解离到0. 5cm3大小，用100%青-链霉素双抗溶液浸泡移至生物安全柜，消毒PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质，再浸泡于培养基中移至解剖显微镜下，用两个10号注射器针头细心分离肺癌实质组织，尽量去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；
(2)胶原酶消化在解剖显微镜下去除肺癌标本中的间质组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)所得的剩余的组织切成Imm3组织片，用PBS缓冲液清洗组织片。让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200单位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小时后。在胶乳胶原酶的同时可加入3mM CaCl2,以提高胶原酶对组织的解离效率。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片；对较大的组织碎片可以加入新鲜的胶原酶进行进一步的解离。消化完全后，收集肿瘤细胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM 培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞；
(3)对步骤(2)所得存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质细胞，纯化后的肺癌细胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养温度为37°C，气体环境为5% C02/95%空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每3-5天传代一次，连续培养并传代超过12 个月，得细胞株。步骤(1)所述的人小细胞肺癌放化疗后复发病灶组织，来源于一位54岁男性肺癌病人的左肺门肿瘤病灶。病人在手术前一年接受了放疗和化疗，药物疗程和射线剂量如下 VP16+DDP 2疗程，放疗56gy(28天)，紫杉醇+DDP 3疗程，肺门和纵隔淋巴结变小。手术前 3个月又出现肺门肿物增大，痰中找到肿瘤细胞，即行拓扑替康+DDP 3疗程，肺门肿物见缩小后即实行手术。步骤(3)得到的细胞株，于2010年4月1日送达中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为CCTCC NO :C201025，命名为人小细胞肺癌细胞株0225_llScac。实施例2
本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-llScac的检测鉴定1、G6PD同工酶检测物种来源(由中国典型培养物保藏中心检测)。本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-1 IScac，是一株有神经内分泌表达的中国南方人肺小细胞癌细胞系，是原始病人来源的肺癌组织经NOD-SCID鼠体内生长形成移植瘤后在体外培养成功的一株细胞系，原始肺癌组织来源于一位54岁男性肺癌病人的左肺门肿瘤病灶。病人在手术前一年接受了放疗和化疗，药物疗程和射线剂量如下VP16+DDP 2 疗程，放疗56gy (28天)，紫杉醇+DDP 3疗程，肺门和纵隔淋巴结变小。手术前3个月又出现肺门肿物增大，痰中找到肿瘤细胞，即行拓扑替康+DDP 3疗程，肺门肿物见缩小后即实行手术。2、形态观察
主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等，以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。2. 1倒置光学显微镜
主要在正常生长状态下观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、粘附特性等。

在放大倍数为400x的倒置光学相差显微镜下观察本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-llScac，如附图1所示，可见细胞体积小，核大，胞浆少，细胞与平皿之间贴附生长， 贴附不紧密，细胞可成团半悬浮生长。2.2免疫组化检测细胞标记蛋白
采用S-P法进行免疫组化染色，免疫组化染色S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。所用的抗体为CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF 和 NSE。具体步骤为
(1)待检测细胞株提前24小时爬片于消毒载玻片上，24小时后，用PBS缓冲液冲洗2 次，冷丙酮固定15分钟，浸泡于PBS中备用；
(2)取所需玻片加1滴或50μ 1过氧化物酶阻断溶液(试剂Α)室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗三次，每次3分钟；
(3)除去PBS液，每张切片加1滴或50μ 1正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育 10分钟；
(4)除去血清，每张切片加1滴或50μ 1的第一抗体，室温下孵育60分钟；
(5)PBS冲洗三次，每次3-5分钟；除去PBS液，每张切片加一滴或50μ 1生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟；
(6)除去PBS液，每张切片加1滴或50μ 1链霉菌抗生物素过氧化酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟；
(7)除去PBS液，每张切片加2滴或100μ 1新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察 3-10分钟；
(8)自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；
(9)DAB显色，切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。免疫组化检测结果判断方法按细胞着色评分棕褐色3分；棕黄色2分；淡黄色 1分；无着色0分。同样物镜下计数阳性细胞数，按阳性细胞的数量评分一个视野内着色细胞>70%为4分；51%-75%为3分；11%_50%为2分；1%_10%为1分；阴性为0分。两项得分相乘，满3分为“ + ” ；4分为“++” ；5分以上为“+++”。“+ +++”为阳性表达。
本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-llScac的免疫组织化学染色显示，其与来源的转移灶肿瘤组织有着相似的蛋白表达，其突出的表达特征为NSE阳性表达。3、细胞生长增殖
检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。3.1 MTT法测定细胞生长增殖和对药物的敏感性
(1)取96孔细胞制备板，每孔中加0.Iml含2X IO4 IOXlO4靶细胞的制备液(含10% 小牛血清的DMEM制备液)，在37°C 5% C02的饱和水汽二氧化碳制备箱中制备2_3小时，让细胞贴壁；
(2)用DMEM制备液0.1 100倍递次配置药物，每孔加0. Iml稀释的药物和待检细胞， 每个稀释 度3个重复孔。对照孔9个3个阳性对照孔，每孔加0. Iml含1000倍药物的DMEM 制备液和细胞，3个阴性对照孔，每孔加不含药物的0. Iml DMEM制备液和细胞，3个空白对照孔，每孔加0.1ml DMEM制备液，不加细胞。在37°C 5% CO2的饱和水汽二氧化碳制备箱中制备24 48小时或预定的时间；
(3)吸去制备液，用PBS洗涤一次(如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心制备板)；
(4)每孔加0.Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的饱和水汽二氧化碳制备箱中制备4 6小时；
(5)每孔加0.Iml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化异丙醇， 在振荡器上振荡混勻，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度(OD)值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。3. 2细胞流式细胞仪检测细胞周期与凋亡
流式细胞仪是美国BECKMAN-COULTER(贝克曼-库尔特)公司生产。机器型号ELITE， 激光波长488nm，功率15丽。取IO6已固定的细胞，用PBS洗两遍，去上清后加入300 μ 1 DNA染液(内含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20单位/ml)，室温30min。上机激光管预热30min后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的 HCV值<2%，收集12000个细胞，DNA周期分析用美国ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE软件，最后计算出细胞各期的百分数。另外，细胞凋亡是用仪器自带软件处理，直接得出细胞的凋亡率。本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-llScac的体外倍增时间为30. 75h。4、异体动物接种
向异体动物体内接种细胞悬液，观察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下进行注射。IO6个本发明所述人小细胞肺癌细胞株0225-1 IScac种植在5只4周龄的 NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第2周种植部位均出现直径约2mm的移植瘤，2个月后，瘤体增大到1. 2cm，麻醉后处死动物，移植瘤组织经包埋切片HE染色，形态如附图2所示，细胞体积小，核大，核仁明显，与来源的病人组织相似。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改 或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。


本发明公开一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株，所述细胞株命名为人小细胞肺癌细胞株0225-11Scac，保藏号为CCTCCNOC201025。所述细胞株是从病理类型为小细胞肺癌的肺癌病人经历过VP-16、卡铂和紫杉醇化疗和肺局部放疗后的肺部复发肿块切除物中培养成功所得，所述的细胞株具有典型的肿瘤细胞生物学特性，能在体外连续长期传代。同时，本发明还公开了所述细胞株的制备方法。