专利名称：Pcr结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中禽贫血病病毒感染的制作方法目前，在规模化养禽业和养猪业，病毒的多重感染是普遍性的问题，也是临床发病的真正原因。但是，对多种病毒的病原学检测对养殖场来说是一个困难问题。这是因为，很难对多个个体的不同病料同时做不同病毒的分离培养。现代分子生物学技术PCR和核酸探针斑点分子杂交技术有助于解决这一问题。在一切条件完美时，PCR的灵敏度非常高。但在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题。如，有时PCR产生的DNA条带虽染大小与预期的一样，但测序结果表明，却是一种无关核酸。此外，由于技术性原因，PCR的可重复性也较差，特别是其灵敏度的可重复性较差，常常PCR产物在电泳时看不到核酸条带。这是因为， PCR产物电泳时，如果加入的DNA量小于50pg，则很难看到条带。用特异性核酸探针做斑点分子杂交，其特异性较稳定，其检测灵敏度可达Ipg的同源核酸。但如果病毒感染量小时， 在I μ g病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足lpg，因而也检测不出来。如过将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要Ipg就可显现阳性了。而且，电泳显示的条带，并不代表是特异的。
本发明的目的是为克服PCR在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题；用特异性核酸探针做斑点分子杂交，但如果病毒感染量小时，在I μ g病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足lpg，因而也检测不出来这些不足，而将PCR和斑点杂交结合起来， 则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交， 则只要Ipg就可显现阳性了。先将疑是病毒感染的肉鸡样品DNA用针对可疑病毒的特异性引物PCR扩增后，再对PCR的产物用该病毒的特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR 产物的特异性，也大大提高了检出率。发明的详细描述I本发明主要步骤(I)病料的收集及样品DNA的制备取因患病引起不同临床表现的动物、病死动物的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。按常规方法提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液制备成为样品DNA。(2)扩增样品中可疑病毒的特异性核酸片段设计可疑病毒特异性引物(F2/R2)扩增出样品DNA可疑病毒特异性核酸片段(样品PCR扩增的片段大小长于探针)，如图I所示。用于扩增样品的引物(F2/R2)序列必须在探针标记用引物(F1/R1)序列之外，即被标记探针DNA序列之外；其扩增的产物长于标记探针DNA序列。(3)地高辛PCR法标记病毒核酸探针制备及特异性及敏感性的测定利用已知病毒基因组DNA克隆用于标记病毒核酸探针。设计引物(F1/R1)采用地高辛PCR法标记技术，进行地高辛标记制备探针，将纯化的病毒的特异性DNA片段作为标记 DNA探针的模板，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行。(4)各样品及其相应PCR产物用标记的病毒核酸探针进行斑点杂交检测。2本发明的具体描述(以鸡贫血病病毒为例)(I)病料的收集及样品DNA的制备取疑似鸡贫血病病毒(CAV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提缓冲液 (IOOmmoI/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl, pH 8. 0,0. 25mmol/L EDTA，pH 8. 0,0. 5% SDS)和终浓度为lOOyg/mL的蛋白酶K，55°C消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社， 1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。(2)样品DNA针对CAV的特异性核酸片段的扩增利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物CAV-vpl_F2和CAV_vpl-R2扩增出样品DNA的特异性核酸片段(样品1-12)，片段长度及引物序列如表I所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图I所示。表I :样品PCR所用的弓I物序列(序列4，序列5)本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中禽贫血病病毒感染的方法。本发明将疑是禽贫血病病毒感染的动物(已死亡动物)组织样品DNA用针对禽贫血病病毒的特异性引物PCR扩增后，对PCR产物再用禽贫血病病毒特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。本发明试验结果表明，PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中禽贫血病病毒感染，可显著提高禽贫血病病毒感染检测的灵敏度和特异性。