专利名称：一种中药组合物在制备抗心肌细胞缺氧损伤药物中的应用的制作方法心肌缺血属中医胸痹的范畴，《中医内科学》将胸痹分为六种证型，分别为心血瘀阻、痰浊壅塞、阴寒凝滞、心肾阴虚、气阴两虚和阳气虚衰。通脉养心丸是一种治疗缺血性心脏病的中成药，由生脉散与炙甘草汤加减而成， 有养心补血、通脉止痛的功效。临床主要用于治疗胸痹心痛、心悸怔忡等证。临床试验证实通脉养心丸治疗气阴两虚型冠心病疗效显著，但其药理作用机制尚不明确。研究证实心肌细胞长时间缺氧可引起心肌组织损伤和坏死，受损的心肌细胞炎性因子过度表达，其中IL-I β可刺激细胞产生应激性氧分子，使心肌细胞膜通透性增加，产生脂质过氧化物使 ATP合成受阻，从而直接损害心脏的电生理功能和泵血功能，最终使心肌细胞变性、坏死。因此本文将从氧化应激以及炎性因子的表达两个方面对其可能的作用机制进行探讨。
本发明目的在于提供一种中药组合物在制备抗心肌细胞缺氧损伤药物中的应用。本发明另一目的在于提供一种中药组合物在制备治疗心肌细胞缺氧引起的心脏病药物中的应用。所述心肌细胞缺氧引起的心脏病包括，但不限于冠心病，心绞痛以及其它由于心肌细胞缺氧引起的心脏疾病。本发明中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄1 10份，鸡血藤1 10份，麦冬1 7份，甘草1 7份，制何首乌1 7 份，阿胶1 7份，五味子1 7份，党参1 7份，龟甲1 5份，大枣1 5份，桂枝0. 1 2份。优选地，本发明中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄3 8份，鸡血藤3 8份，麦冬2 5份，甘草2 5份，制何首乌2 5份， 阿胶2 5份，五味子2 5份，党参2 5份，龟甲1 3份，大枣1 3份，桂枝0. 5 1.5 份。最优选地，本发明中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄5份，鸡血藤5份，麦冬3份，甘草3份，制何首乌3份，阿胶3份，五味子3份， 党参3份，龟甲2份，大枣2份，桂枝1份。其中，为了达到更好的治疗效果，所述的龟甲为醋制龟甲。因此，本发明中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄1 10份，鸡血藤1 10份，麦冬1 7份，甘草1 7份，制何首乌1 7 份，阿胶1 7份，五味子1 7份，党参1 7份，龟甲(醋制)1 5份，大枣1 5份， 桂枝0. 1 2份。CN 102526461 A优选地，本发明中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄3 8份，鸡血藤3 8份，麦冬2 5份，甘草2 5份，制何首乌2 5份， 阿胶2 5份，五味子2 5份，党参2 5份，龟甲(醋制)1 3份，大枣1 3份，桂枝 0. 5 1. 5 份。最优选地，本发明中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄5份，鸡血藤5份，麦冬3份，甘草3份，制何首乌3份，阿胶3份，五味子3份， 党参3份，龟甲(醋制)2份，大枣2份，桂枝1份。前述中药组合物可以按照现有技术中任一常规的方法加工，得到的提取物皆具有抗心肌细胞缺氧损伤的作用。为了便于理解，现举例如下，但对于本发明保护范围不构成影响。方法一、本发明中药组合物按照下述方法制备而成，包括步骤1、按照上述重量配比取11味药材；步骤2、取龟甲加水煎煮后，加入鸡血藤、党参、大枣继续煎煮，滤过，滤液浓缩后， 加入乙醇进行沉淀，取适量上清液，加入阿胶后加热使溶解，并入上述乙醇溶液中，混勻，静置，滤过，滤液备用；步骤3、其余6味药材，加入乙醇浸渍后，渗漉，收集渗滤液与步骤2中得到的提取液合并，静置，滤过，滤液减压回收乙醇，得到终产品。其中，在步骤2中，所述龟甲加水煎煮2小时后加入鸡血藤等药材；加入鸡血藤、党参和大枣等药材后继续煎煮2次，第一次4小时，第二次2小时；所述滤液浓缩至相对密度为1.05 1. 15 (500C )；加入80%乙醇进行沉淀，使乙醇含量达到60%;取适量上清液(以能够完全溶解阿胶药材为限)；静置M小时。步骤3中，采用80%的乙醇浸渍48小时；静置M小时。优选地，本发明中药组合物按照下述方法制备而成包括步骤1、按照上述重量配比取11味药材；步骤2、取龟甲加水煎煮2小时后，加入鸡血藤、党参、大枣继续煎煮2次，第一次 4小时，第二次2小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05 1. 15 (500C )后，加入80%乙醇进行沉淀使含醇量达到60%，取适量上清液，加入阿胶后加热使溶解，并入上述乙醇溶液中，混勻，静置M小时，滤过，滤液备用；步骤3、其余6味药材，加入80%乙醇浸渍48小时后，渗漉，收集渗滤液与步骤2 中得到的提取液合并，静置M小时，滤过，滤液减压回收乙醇，得到终产品。方法二、本发明中药组合物按照下述方法制备而成，包括步骤1、按照上述重量配比取11味药材；步骤2、鸡血藤、党参、五味子、大枣、龟甲加水煎煮，合并滤液，滤过，浓缩成稠膏；步骤3、其余药材6味药分碎成细粉，加入步骤1得到的稠膏，均勻，干燥，分碎成细粉，得到终产品。其中，步骤2中，药材煎煮2次，每次3小时。优选地，本发明中药组合物按照下述方法制备而成包括步骤1、按照上述重量配比取11味药材；步骤2、鸡血藤、党参、五味子、大枣、龟甲加水煎煮2次，每次3小时，合并滤液，滤过，浓缩成稠膏；步骤3、其余药材6味药分碎成细粉，加入步骤1得到的稠膏，均勻，干燥，分碎成细粉，得到终产品。本发明药物组合物针对胸痹本虚标实的病理状态重用生地黄滋阴养血为君，《名医别录》谓地黄“补五脏内伤不足，通血脉，益气力”。方中炙甘草、党参、大枣益气，健脾；生地黄、阿胶、麦冬甘润滋补心阴心血；桂枝、鸡血藤温通血脉，与益气养阴药相配，亦可使气血流通，脉道通利。诸药相合可达阴血足而血脉充，阳气复而心脉通，气血充沛，血脉畅通则悸可定，脉可复。现代药理学研究证实，地黄水提液具有降压、抗炎等作用；其浸膏具有强心、利尿等作用。党参具有抗氧化作用。麦冬、桂枝具有改善心肌收缩力的作用。鸡血藤具有抗动脉粥样硬化等药理作用。现代药理学实验表明，本发明药物组合物可能通过抗炎、抗氧化发挥心肌保护作用。试验例对缺氧诱导心肌细胞炎症因子及氧化应激的影响以下对于本发明药物组合物从氧化应激以及炎性因子的表达两个方面对其可能的作用机制进行探讨。1材料与方法1. 1 动物Wistar大鼠50只，体重300 士 20g，雄性，购于中国医学科学院协和动物研究所，合格证编号SCXK(京)2005-0013。饲养于天津中医药大学实验动物中心，环境设施符合《中华人民共和国卫生部实验动物环境设施标准》二级标准。新生l-3d Wistar大鼠，雌雄不拘，购于中国医学科学院协和医科大学放射研究所。1. 2主要药品与试剂本发明药物组合物(下称“通脉养心丸”，天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂提供，按照本发明实施例1的方法制备，每10丸重lg，批号C107074) ；DMEM/F12培养液(Hyclone)；胰蛋白酶(1 250，sigma) ；II型胶原酶(Gibco公司)；5_溴脱氧尿苷 (brdu，sigma公司)；S0D、MDA、GSH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠IL-I β、 IL-6试剂盒(R&D)；其他试剂为国产分析纯。1. 3主要仪器37°C 5% CO2 培养箱(THERMO，F0RMA3111 型，美国)；37°C 94% N2-5% CO2-I % O2 培养箱(THERMO，F0RMA3131型，美国)；倒置相差显微镜(LEICA DMIL，德国)；台式高速低温离心机(Biofuge primo R，美国)；酶标仪(Multiskan Ascent, THERMO LABSYSTEMS，美国)；300型半自动生化分析仪(荷兰威图)。1. 4实验方法1.4. 1含药血清的制备将50只Wistar大鼠随机分为空白对照组、通脉养心丸lg/kg、2g/kg、4g/kg、8g/ kg(日给药量)剂量组，每组10只，空白对照组灌服等量蒸馏水，给药组临用前用蒸馏水配制成0. 05,0. 1,0.2,0. 4g/ml药液，供大鼠灌胃，给药体积为lml/100g灌服给药，每日两次， 连续给药三天。末次给药Ih后，腹主动脉取血，3000rpm离心15min后取血清，56°C水浴箱中孵育30min灭活补体，无菌条件下过滤分装入冻存管中，-20°C冰箱保存备用。1. 4. 2体外培养心肌细胞缺氧损伤模型的制备1. 4. 2. 1心肌细胞原代培养参照文献方法加以改良进行心肌细胞的原代培养无菌条件下取出心室组织，用 37°C预温的0. 1 %胶原酶和0. 06%胰蛋白酶1 1混合液消化4-5次，每次5min，取消化液上清部分滤过200目网筛，离心收集除第一次以外各次消化所得细胞，悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中(内含100 μ g/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)，接种于75cm2培养瓶中，差速贴壁培养Ih后收集未贴壁的心肌细胞重新悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，调整细胞浓度至3 X IO5 5 X 105/ml，接种于96孔板中，每孔100 μ 1，隔天换液，前 3天加用0. Immol/LBrdu以抑制非心肌细胞生长。1.4. 2.2 分组方法第4天取成功培养的单层心肌细胞，用无血清DMEM/F12培养液培养48h，使细胞生长同步化。实验分6组⑴空白对照组(2)缺氧损伤组(3)通脉养心丸lg/kg、2g/kg、 4g/kg、8g/kg各剂量含药血清+缺氧损伤组。1. 4. 2. 3 干预措施(1)空白对照组心肌细胞中加入10%空白对照组大鼠血清(DMEM/F12培养液 90μ 1+空白对照组大鼠血清 ομ 1)，置于37°C，5% CO2培养箱内孵育Mh。(2)缺氧损伤组心肌细胞中加入10%空白对照组大鼠血清(DMEM/F12培养液90 μ 1+空白对照组大鼠血清10μ 1)后，将细胞置于缺氧环境中(37°C，94% N2，l% O2，5% CO2)孵育24h。(3)通脉养心丸lg/kg、2g/kg、4g/kg、8g/kg各剂量含药血清+缺氧损伤组心肌细胞中加入通脉养心丸各剂量组的10%含药血清(DMEM/F12培养液90 μ 1+通脉养心丸各剂量组含药血清 10μ 1)，其余操作同缺氧损伤组。1. 4. 3ELISA 法测定 IL-6、IL-I β 的浓度取细胞培养上清液，按照试剂盒说明书操作，酶标仪上于450nm处读取吸光值，计算 IL-6、IL-10 浓度。1. 5统计学处理采用SPSS 11. 0软件进行统计分析，计量资料采用均数士标准差± s )表示，组间比较采用单因素方差分析。2 结果2. 1通脉养心丸含药血清对缺氧损伤心肌细胞SOD、MDA、GSH的影响表1示，心肌细胞缺氧损伤后细胞上清液中SOD含量明显降低(P < 0. 01)，MDA含量明显升高(P <0.01)；通脉养心丸各剂量组能够不同程度提高SOD和GSH活性、降低MDA 含量，与缺氧损伤组比较有显著差异(P < 0. 05-0. 01)。2. 2通脉养心丸含药血清对缺氧损伤心肌细胞IL-6、IL-I β浓度的影响表1示，心肌细胞缺氧损伤后细胞上清液中IL-I β浓度升高(P < 0. 05)，IL_6浓度显著升高(P <0.01)；通脉养心丸4g/kg剂量组含药血清能降低细胞上清液中IL-6浓度(P < 0. 05)及 IL-I β 浓度(P < 0. 01)。表1通脉养心丸含药血清对缺氧心肌细胞氧自由基释放的影响一±。本发明公开了一种中药组合物在制备抗心肌细胞缺氧损伤药物中的应用，所述中药组合物按照下述重量配比的中药制备而成地黄1～10份，鸡血藤1～10份，麦冬1～7份，甘草1～7份，制何首乌1～7份，阿胶1～7份，五味子1～7份，党参1～7份，龟甲1～5份，大枣1～5份，桂枝0.1～2份。本发明还公开了所述中药组合物的制备方法。