专利名称：一种从源头上降低发酵抑制物的方法木质纤维素的结构与组成复杂，其中，主要以葡萄糖基组成的纤维素结构致密， 较难水解，而以多种杂糖基组成的半纤维素，结构比较松散，预处理可以被水解成单糖。 目前正在研究的有多种木质纤维素原料预处理方法，例如酸水解、蒸汽爆破、氨纤维爆破及湿氧化法等。各种不同的预处理过程都产生多种化合物，其种类及含量随纤维素原料性质及预处理条件的不同而不同，主要形成3类微生物生长抑制物1)弱酸乙酸、甲酸、乙酰丙酸等。乙酸由半纤维素脱乙酰生成，甲酸和乙酰丙酸是5-羟甲基糠醛(HMF， 5-Hydroxymethylfurfural)的降解产物，同时甲酸也可由糠醒在酸性环境下降解产生；2) 呋喃醛类主要是糠醛(Furfural)和HMF，分别由戊糖和己糖在酸性环境下脱水生成；3) 酚类化合物主要由木素降解形成。蒸汽爆破技术被认为是植物纤维预处理的一项最具前景和最经济高效的技术。原料用蒸汽加热至180-235°C，维压一定时间，在突然减压喷放时，体积猛增，受机械力的作用，其固体物料结构被破坏。蒸汽爆碎的几个优点可归纳如下(I)可应用于各种植物生物质，预处理条件容易调节控制。(2)半纤维素、木质素和纤维素三种组分会在三个不同的流程中分离，分别为水溶组分、碱溶组分和碱不溶组分。(3)纤维素的酶解转化率可达到理论最大值。(4)经过蒸汽处理后的木质素仍能够用于其他化学产品的转化。(5)半纤维素产生的糖可以被全利用，转化为液体燃料。(6)汽爆过程中产生的发酵抑制物可通过控制汽爆条件而大大降低。该预处理方法适用于硬木、软木、农业废弃物，如蔗渣、麦草、稻草、玉米秸杆和其他非纤维素原料等各种植物生物质，而且正在这方面发挥越来越大的作用。但是，蒸汽爆破预处理技术最大的缺点就是仍会产生一些含量相对其他预处理技术少的发酵抑制物。这些抑制物对随后发酵微生物的抑制，已成为木质纤维素生物加工过程的主要瓶颈之一。须采取必要的应对抑制物的措施以减少或消除其抑制作用。人们尝试了多种方法对木质纤维素水解液进行发酵前的脱毒处理，包括生物学、物理及化学方法等及不同措施组合使用。生物学方法包括利用特定酶(例如漆酶laccase)或微生物对水解液进行脱毒处理。漆酶是一类含铜氧化还原酶，专一性地对酚类底物分子进行单电子氧化，生成相应的活性自由基，活性的中间物随后转变为二聚体、寡聚体和高聚物。在这一过程中小分子量酚类化合物发生了氧化聚合反应，生成了毒性较低的高分子量化合物，从而减少了木质纤维素预处理液中酚类物质的毒性。Mussatto等用只能利用乙酸生长的酿酒酵母突变株处理水解液，使其中的乙酸浓度由6. 8g/L降低至O. 4g/L。物理方法有真空干燥浓缩、蒸煮、活性炭吸附、离子交换吸附及溶剂萃取等，真空浓缩及蒸煮可以使挥发性抑制物大量减少，离子交换及溶剂萃取可有效降低乙酸、呋喃醛及酚类化合物含量；化学方法包括利用各种碱 (NH40H、NaOH, Ca (OH) 2等)及过量石灰法等对水解液处理，其中NH40H能有效去除呋喃醛类物质，过量石灰处理可以有效提高水解液中单糖利用率。另外，水洗预处理原料也是一种简单的脱毒过程。将2种或多种方法联合使用可以达到更好的脱毒效果。但是，脱毒步骤无疑增加了生物基产品的发酵成本，使工艺过程更为复杂，同时也导致一部分可发酵性糖的损失，所以在发酵过程中须尽量减少发酵前的脱毒环节。可行的方法有选育高抗性菌株，提高其自身内在的耐受能力，或者从源头上优化水解工艺控制抑制物的产生，降低其含量。木质纤维素原料具有复杂的、不均一的多级结构。从化学成分上看，木质纤维原料的化学成分包括纤维素、半纤维素和木质素。从细胞组成上看，包括纤维状的纤维细胞和杂细胞(包括导管、薄壁细胞、表皮细胞等)。纤维细胞是植物纤维原料中最主要、最基本的细胞，是植物原料的支持组织，纤维细胞一般具有发达的次生壁(即厚度较大)。植物原料中另一类比较重要的细胞是薄壁细胞，在植物生长中起着储存营养的作用，薄壁细胞腔大、壁薄、长度短的特点。鉴于2类细胞的结构和形态上的差异，可知这2类细胞所要求的预处理条件不一样。纤维细胞，细胞壁木质化程度高，结构致密，受热过程中其传质传热阻力大，且不易被撕裂；薄壁细胞，壁薄而腔大，即利于传质传热，又利于水蒸汽闪蒸对其物理撕裂。不同原料中，这两类细胞的含量、结构各不相同，这就从本质上决定了其所需的处理条件的差异。因此，可以针对不同组织细胞分别优化处理条件，从而达到各自最好的水解效果并且副反应程度控制在最小。本发明开发的二段汽爆分梳工艺，不同于传统所指的二段汽爆工艺，这里是指采用较温和的汽爆条件进行第一段汽爆，通过气流分级装置将第一段物料分级，得到薄壁组织和纤维组织，再将纤维组织在合适的条件下进行第二段汽爆。二段汽爆分梳工艺有效的针对其各组织的特征要求选择性的进行预处理，既能保证纤维组织达到较好的预处理效果，又能避免薄壁组织的过度降解，从而提高纤维原料的酶解率的同时，又能有效控制副反应的发生，即降低抑制物含量，省去了脱毒单元操作的引入，简化了工艺。另外，该工艺中， 纤维细胞和薄壁细胞的分离和选择性预处理，为木质纤维原料的分层多级转化和生物量权利用提供了新途径，且二段汽爆分梳工艺还有助于纤维原料的复水均匀，降低了第二段物料的汽爆条件且减少了生料含量，提高了原料的利用率。
本发明的目的是针对目前木质纤维素预处理过程中产生发酵抑制物已成为木质纤维素生物加工过程的主要瓶颈之一，而常采用的脱毒工序不仅增加了生物基产品的发酵成本，使工艺过程更为复杂，而且也导致一部分可发酵性糖的损失等问题，开发了新型的二段汽爆分梳工艺。这里的二段汽爆分梳工艺，不同于传统所指的二段汽爆工艺，是指采用较温和的汽爆条件进行第一段汽爆，通过气流分级装置将第一段物料分级，得到薄壁组织和纤维组织，再将纤维组织在合适的条件下进行第二段汽爆。本发明的技术方案如下本发明提供的从源头上降低木质纤维素来源的发酵抑制物含量的新型二段汽爆分梳工艺，其包括以下步骤1)在压力为O. 5 I. 5MPa,时间为I IOmin的汽爆条件进行对秸杆原料进行第一段蒸汽爆破处理；2)通过气流分级装置将第一段汽爆物料进行分级，得到薄壁组织和纤维组织；3)将分梳得到的纤维组织在压力为O. 5 I. 5MPa，时间为I IOmin的条件下进行第二段蒸汽爆破处理；4)分别对第一段汽爆、分梳以及第二段汽爆后的物料进行酶解和发酵；5)分别测定秸杆原料、第一段汽爆物料、分梳后的薄壁组织和纤维组织以及第二段汽爆物料的含水率、水洗液中的抑制物含量、酶解率以及发酵产物的转化率。 本发明中，酶解条件为汽爆稻杆与pH 4. 850mM朽1檬酸缓冲液的固液比为 I 10-1 30，加酶量为15IU/g-110/g底物，在50°C，150rpm的水浴摇床中酶解24-120h。 然后，离心过滤得酶解液。本发明的有益效果为(I) 二段汽爆分梳工艺有效的针对其各组织的特征要求选择性的进行预处理，既能保证纤维组织达到较好的预处理效果，又能避免薄壁组织的过度降解，从而提高纤维原料的酶解率的同时，又能有效控制副反应的发生，即降低抑制物含量，省去了脱毒单元操作的引入，简化了工艺。(2)该工艺中，纤维细胞和薄壁细胞的分离和选择性预处理，为木质纤维原料的分层多级转化和生物量权利用提供了新途径。(3) 二段汽爆分梳工艺有助于纤维原料的复水均匀，降低了第二段物料的汽爆条件且减少了生料含量，提高了原料的利用率。3-丁二醇含量比只以糖为碳源的2，3-丁二醇发酵对照组低66. 5%。实施例3 :称取200g干玉米秸杆放入汽爆罐中，密闭后通入水蒸气，使罐压迅速升至I. IMPa，在此压力下维持4min后，迅速放压，从而制得第一段汽爆秸杆。取适量第一段汽爆秸杆，在离心式气流分级装置上进行分梳，分别得到薄壁组织和纤维组织。称取适量分梳后的纤维组织，放入汽爆罐中，密闭后通入水蒸气，使罐压迅速升至I. 2MPa，在此压力下维持4min后，迅速放压，从而制得第二段汽爆秸杆。预处理条件为1.2MPa、8min、不分梳为预处理对照组。分别称取第一段汽爆秸杆、分梳后的汽爆秸杆、第二段汽爆秸杆以及对照组汽爆稻杆lg(dry base),溶入20ml水于70°C浸提2h,取上清液，采用高效液相(Agilent 1200HPLC，美国)测定水解液中的糠醛和羟甲基糠醛(HMF)含量，采用紫外分光光度计在 280nm测定水解液中的可溶性木质素含量。糠醛、羟甲基糠醛(HMF)以及可溶性木质素含量之和即为水解液中抑制物含量。分别称取第一段汽爆秸杆、分梳后的汽爆秸杆以及第二段汽爆秸杆以及预处理对照组汽爆秸杆10g，加入200ml pH 4. 850mM柠檬酸缓冲液中，加入O. 5ml纤维素酶，在50°C， 150rpm的水浴摇床中酶解48h。采用DNS法测酶解液中还原糖含量。然后，离心过滤得酶解液。取40ml酶解液，加入O. 2g磷酸二氢钾、O. 08g硫酸铵、O. 016g硫酸镁、O. 008g氯化钙、O. 08g酵母粉。补加葡萄糖至酶解液中初始糖浓为25g/L，加入2mL安琪酵母种子液，调6节pH为5.5，在32°C厌氧发酵48h。只以葡萄糖为碳源的发酵对照组。采用HPLC测定乙醇含量。最终折合抑制物含量为分梳后的薄壁组织中的含量与第二段汽爆后的物料的含量之和，乙醇含量同理可算。结果表明实验组的抑制物含量比预处理对照组的抑制物含量低33%。实验组的乙醇含量比预处理对照组的乙醇含量高13. 8%，且分别比只以糖为碳源的乙醇发酵对照组低 22. 4%和 33%。
本发明公开了一种从源头上降低木质纤维素来源的发酵抑制物的方法，该方法将蒸汽爆破技术和气流分级技术组合起来应用于木质纤维原料的预处理。二段汽爆分梳工艺有效的针对纤维原料各组织的特征选择性的进行预处理，既能保证纤维组织达到较好的预处理效果，又能避免薄壁组织的过度降解，从而提高纤维原料的酶解率的同时，又能有效控制副反应的发生，即降低抑制物含量，省去了脱毒单元操作的引入，简化了工艺。另外，该工艺中，纤维细胞和薄壁细胞的分离和选择性预处理，为木质纤维原料的分层多级转化和生物量权利用提供了新途径，且二段汽爆分梳工艺还有助于纤维原料的复水均匀，降低了第二段物料的汽爆条件且减少了生料含量，提高了原料的利用率。