专利名称：一种水稻耐低温相关转录因子及其编码基因与应用的制作方法 冷害和冻害等非生物逆境胁迫因素，不仅对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，并且影响作物优良品种的推广，因此培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。由于植物本身耐逆性的限制和远缘杂交的不亲和性，利用传统的育种方法提高作物的耐逆性受到一定的限制。植物耐逆性分子机制的研究进展和植物转化系统的日臻完善使应用转基因手段提高植物耐逆性成为可能。转录因子在植物对逆境的应答中起着“承上启下”的作用。逆境下，植物细胞将环境中物理参数的变化变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到转录因子，再经转录因子调控相关的功能基因，启动或者抑制它们的表达，使细胞的内环境达到平衡，从而提高植物的耐逆性。因此耐逆相关转录因子的高表达与植物的耐逆性是息息相关的。水稻作为最重要的粮食作物之一，阐明其应答低温的转录因子及其功能，对应用基因工程技术培育耐低温植物品种具有重要的理论和现实意义。发明创造内容本发明的目的是提供与植物耐低温特性相关的一种转录因子及其编码基因。本发明所提供的耐低温转录因子来源于水稻，名称为OsbHLH1，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。序列表中序列2蛋白质序列由265个氨基酸残基组成，在氨基端有一个富含碱性氨基酸如赖氨酸的短基元LysLysCysAspLysLysAlaProLysArg，如图1A所示，为序列2中自氨基端到羧基端的第28-37位氨基酸残基；其可能是定位于细胞核的信号。此外含有保守的bHLH结构域序列，包括54个氨基酸残基，构成了典型的单环—可变环—单环结构(bHLH)，在bHLH结构域序列右侧是富亮氨酸的拉链结构(ZIP)，于是构成了bHLH-ZIP结构域。其中，bHLH结构域序列为序列2中自氨基端到羧基端的第32-85位氨基酸残基，即图1A中划细线部分的氨基酸残基；富亮氨酸的拉链结构(ZIP)序列为序列2中自氨基端到羧基端的第86-127位氨基酸残基，即图1A中划粗线部分的氨基酸残基；bHLH-ZIP结构域序列为序列2中自氨基端到羧基端的第32-127位氨基酸残基，即图1A中划细线和划粗线部分的氨基酸残基。耐低温相关转录因子OsbHLH1的编码基因OsbHLH1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由1137个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第121到第918位碱基，其表达主要受低温的诱导。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码耐低温的转录因子的基因导入植物细胞，可获得对低温逆境胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带有任何标记基因，直接用低温筛选。本发明OsbHLH1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的基因对培育抗低温植物品种，扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。


图1A为OsbHLH1的核苷酸及氨基酸序列图1B为OsbHLH1与其它bHLH类因子蛋白保守区的相似性比较图2为OsbHLH1基因在染色体中的拷贝数图3为OsbHLH1蛋白在细胞核中的定位图4为酵母系统实验说明OsbHLH1是一个转录因子图5A显示不同处理对OsbHLH1表达的影响图5B显示低温处理对籼稻和粳稻根和叶中OsbHLH1基因表达的影响

实施例1、水稻耐低温转录因子OsbHLH1的筛选及其cDNA的克隆水稻(Oryza sativa var.Lansheng)种子种在培养皿中在培养室中生长至两叶一心期时进行低温胁迫处理后取样。收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水。应用常规方法构建cDNA文库。
从水稻cDNA文库中根据CBF/DREB1的序列按照AP2/EREBP结构域和载体的序列设计了一对引物5’-引物为5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’；3’-引物为5’-(ATGC)GT(CT)TG(AG)AA(ATGC)GT(ATGC)CC(ATGC)AGCCA-3’(括号中的碱基表示此位碱基可是其中的任一个)用常规PCR方法扩增了一段DNA序列。将这一DNA片段进行序列分析发现其为一个全长的cDNA，如图1A所示，它含有1137bp，包括一个798bp的阅读框、120bp5’-非翻译区和219bp 3’-非翻译区，推定的蛋白质含265个氨基酸，为42kD。
根据该cDNA的核苷酸序列推断的氨基酸序列画出其蛋白质结构，再与NCBI数据库比较，结果如图1B所示，表明该蛋白含有典型的单环—可变环—单环结构(bHLH)，在HLH结构右侧是富亮氨酸的拉链结构(ZIP)，于是构成了bHLH-ZIP结构域，但在该蛋白中未发现有AP2/EREBP结构，因此获得的cDNA片段是一个bHLH类的蛋白，命名为OsbHLH1。
实施例2、OsbHLH1基因在染色体中的拷贝数将水稻总DNA分别用限制性内切酶BamH I，Xho I，EcoR I，Xba I完全水解后，以OsbHLH1为探针进行Southern分析(常规方法)。Southern杂交结果如图2所示，表明EcoR I酶切时可见3条杂交带而其它3个酶切时仅显示1条杂交带。在OsbHLH1cDNA中没有此3个酶的酶切位点，而仅有一个EcoR I的酶切位点。当将OsbHLH1序列与已公布的水稻全基因组序列比较时发现OsbHLH1基因含有5个外显子，分别为108bp，81bp，119bp，130bp，699bp，4个内含子，分别为……。在第2个内含子中发现存在1个EcoR I切点。因此当水稻总DNA用EcoR I酶切时的杂交带为3条。至此，可以判明OsbHLH1基因在水稻基因组中仅含1个拷贝，对水稻9311基因组全序列的检索也证实了上述结果。
实施例3、OsbHLH1蛋白在细胞核中的定位由于OsbHLH1蛋白含有LysLysCysAspLysLysAlaProLysArg基元，富含亮氨酸(K)和精氨酸(R)，推断这一结构可能是位于细胞核的信号(NLS)。因此进行了OsbHLH1蛋白的核定位实验。
OsbHLH基因的编码序列用引物
5’-引物5’-TAGGGATCCGAGGTCGAGATGGTGCCCAG-3’3’-引物3’-GTGGTCGACAGATCTACCTATACGGTCTTC-3’以水稻总DNA为模板经常规PCR方法扩增得到。该序列与pUC18质粒中的绿色荧光蛋白(GFP)基因融合并经测序验证。以仅含GFP基因的载体为对照，所用启动子均为35S启动子。然后导入洋葱表皮细胞中，转化细胞在MS培养基中于28℃下培养2天，然后在Confocal显微镜(Olympus FV500)下观察。如图3所示，结果表明OsbHLH1位于细胞核中。
实施例4、酵母双杂交系统实验证明OsbHLH1是一个转录因子含有HIS3和LacZ报告基因的酵母YRG-2作为本实验系统。用与实施例3相同的引物经常规PCR方法扩增得到OsHLH1基因的编码序列，分别与GAL4 DNA结合域载体和GAL4活化域载体连接产生2个载体pBD-OsbHLH1和pAD-OsbHLH1。根据Stratagene的操作程序将pGAL4(正对照)，pBD(负对照)，pBD-OsbHLH1和pAD-WT加pBD-WT(WT是内对照，表示λcI阻抑蛋白中的C片段)分别转化酵母YRG-2，转化子分别在含YAPD或SD-His平板上生长。酵母YRG-2含有上游活化序列(UAS)，能调控报告基因HIS3的表达。如果含有pBD-OsbHLH1的酵母转化子能够在无组氨酸(SD-His)的培养基上生长，说明报告基因HIS3被激活了证明在OsbHLH1基因中存在转录活化域。图4显示所有含有pGAL4(正对照)，pBD(负对照)，pBD-OsHLH1和pAD-WT加pBD-WT的转化子均能在YAPD培养基中正常生长，但在SD-His培养基中含pGAL4(正对照)，pBD-OsbHLH1和pAD-WT加pBD-WT的转化子仍正常生长而含pBD(负对照)的转化子不能生长。证明在OsbHLH1蛋白中含有转录因子活性的片段。
实施例5、水稻OsbHLH1基因转录活性与低温胁迫的关系及其组织表达特异性水稻(Oryza sativa var.)籼稻9311和粳稻JX17的种子种在水中，37℃2天，然后在培养皿的水和营养液中，25℃生长10天后进行下述各种胁迫处理盐处理将水稻苗移入250mM NaCl溶液中。
旱处理将水稻苗移入25％PEG 6000溶液中。
冷处理将水稻苗移入4°下。
ABA处理将水稻苗移入100μM ABA溶液中。
分别在各种处理后0、0.5、1、3、5、8、10、24小时收集9311全株各1克，组织特异性实验中低温处理后分别于0、1、3、5、12小时收集9311和JX17的新鲜叶片和根各1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水，得到总RNA。以OsbHLH1 DNA为探针，常规方法进行Northern杂交分析。
结果如图5A所示，表明在各种处理中只有低温处理诱导OsbHLH1基因的表达，并在胁迫0.5-1小时即达到高峰，之后逐渐下降，而ABA，NaCl和PEG的处理均不诱导OsbHLH1基因的表达；图5B表明无论是9311还是JX17，在常规条件下，其叶中均没有检测到OsbHLH1的转录，而在根中却有较强的表达。当用4℃处理时在9311和JX17中OsbHLH1基因的转录均受低温诱导，诱导的水平在2个品种中未见区别。
序列表<160>2<210>1<211>1137<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>
tgcagccagc cacgagccga ggaagccgag gccgaggagg aagacgacga agacaagtag 60cgcaaggaac cctcgaaccg ggaggccgcc gcggctccga tctgggaggg ggaggtcgag120atggtgccca gggacagggt gaatgccgct gccgctggtg gcggcggcga ggggaggctg180gtccagagcg gtatagtgaa caagaagtgt gataagaagg ctccaaagag aatccataaa240tcagagaggg agaaacttaa gcgggacaag cagaatgacc tctttaatga gctgggaaac300ttgctagaac ctgacaggca gaacaatggg aaggcatgtg tactgggtga aactacacga360atactaaaag atttactttc acaagtggaa tctctccgga aggagaatag ttcactgaag420aatgaatctc attatgttgc attggagaga aatgaactgc acgacgatta cagcatgctt480cgtactgaaa tcttggagct tcaaaacgag cttaggacgc ggatggaagg caatcctgtt540tggagtcatg taaacaccag accagctctc agggtacctt atccgacaac cggagtgttc600ccagtacagc acctgccaca tttaccagtc accacgacgg cagcatttcc tcagaagcta660ccggttatca tcgagcagca ctatgccgcc acgccaagag aacttcagct cttccctgag720tctgcgacca gcgaagacag cgaaccgtca caagaacacg ggatttctga ccatgtaaca780cggcctcagc caaggtaccc aacaccaacg gccactttgc cagtaaacct gtttccagtg840tttccaggaa gacaagatca acaatgtagc agtggtactt ctggcactaa cgaggaagac900cgtataggta gatcttaggt acactacata acgagaggtc cacacaatga tttgagaatt960cctttagttt caacgtttaa ctttgcaagt ttagcaaatg tgaaacagag atctgcgact 1020gtgctcatgg gtagcaccta atctgtatat ctgaatctca gttttaagtg gtcaaatagg 1080tgacattcag aaaagtttga aatgctttga ttattctgta aaaaaaaaaa aaaaaaa 1137<210>2<211>265<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>2Met Val Pro Arg Asp Arg Val Asn Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Glu Gly Arg Leu Val Gln Ser Gly Ile Val Asn Lys Lys Cys20 25 30Asp Lys Lys Ala Pro Lys Arg Ile His Lys Ser Glu Arg Glu Lys35 40 45Leu Lys Arg Asp Lys Gln Asn Asp Leu Phe Asn Glu Leu Gly Asn50 55 60Leu Leu Glu Pro Asp Arg Gln Asn Asn Gly Lys Ala Cys Val Leu65 70 75Gly Glu Thr Thr Arg Ile Leu Lys Asp Leu Leu Ser Gln Val Glu80 85 90Ser Leu Arg Lys Glu Asn Ser Ser Leu Lys Asn Glu Ser His Tyr95 100 105Val Ala Leu Glu Arg Asn Glu Leu His Asp Asp Tyr Ser Met Leu110 115 120Arg Thr Glu Ile Leu Glu Leu Gln Asn Glu Leu Arg Thr Arg Met125 130 135Glu Gly Asn Pro Val Trp Ser His Val Asn Thr Arg Pro Ala Leu140 145 150Arg Val Pro Tyr Pro Thr Thr Gly Val Phe Pro Val Gln His Leu155 160 165Pro His Leu Pro Val Thr Thr Thr Ala Ala Phe Pro Gln Lys Leu170 175 180Pro Val Ile Ile Glu Gln His Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Glu Leu185 190 195Gln Leu Phe Pro Glu Ser Ala Thr Ser Glu Asp Ser Glu Pro Ser200 205 210Gln Glu His Gly Ile Ser Asp His Val Thr Arg Pro Gln Pro Arg215 220 225Tyr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Leu Pro Val Asn Leu Phe Pro Val
230 235 240Phe Pro Gly Arg Gln Asp Gln Gln Cys Ser Ser Gly Thr Ser Gly245 250 255Thr Asn Glu Glu Asp Arg Ile Gly Arg Ser260 26

本发明公开了来源于水稻的耐低温相关转录因子及其编码基因与应用，目的是提供具有较强耐低温特性的转录因子及其编码基因。本发明所提供的耐低温相关转录因子名称为OsbHLH1，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID№2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。耐低温相关转录因子OsbHLH1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育耐低温胁迫植物品种，提高农作物产量，扩大种植面积具有重要意义。