专利名称：迷迭香酸的新用途的制作方法迷迭香酸(Rosmarinic acid)的化学名为R(+) 2-〔〔 3_ (3，4_ 二羟基苯基-(-氧 代-2-丙烯基)氧基〕3,4- 二羟基苯丙酸〕，是一种水溶性的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧 化活性、免疫抑制、抗血栓和抗血小板聚集作用等多种活性[刘鹰翔，计志忠.迷迭香酸药 理作用的研究进展，国外医药 植物分册，1993，8(6) :248 251 ；陈淑珍，付阳平，等.迷迭 香酸对大鼠中性粒细胞自由基生成和溶酶体释放的影响，药学学报，1999,34(12) 881 885. ；Peake P. W. Pussell B. A, MartynP, etal.The, inhibiton effect of Rosmarinic acid on complement in volves the C5convertase. Int J Immuno Pharmacol 13:853 857，1997.；邹正午，徐理纳，田金英.迷迭香酸抗血栓和血小板聚集作用，药学学报，1993， 28(4) :241 245.]。但未有文献报道其在治疗病毒性肝炎方面的应用，本发明人通过大量 的实验研究，提供了迷迭香酸在制备治疗或预防乙型肝炎和丙型肝炎的药物中的应用。
本发明提供了迷迭香酸在制备治疗或与预防病毒性肝炎的药物中的应用。本发明提供了迷迭香酸在制备治疗或预防乙型肝炎的药物中的应用。本发明提供了迷迭香酸在制备治疗或预防丙型肝炎的药物中的应用。本发明提供的迷迭香酸在用于上述任一用途时，其注射使用剂量范围为20mg lOOOmg，优选剂量范围为20 500mg ；其口服使用剂量范围为50mg 2000mg，优选剂量范 围为50 IOOOmg0本发明提供了以迷迭香酸为活性成分的药物，其可以以药学常规方法制备成片 剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆、滴丸剂、注射液、冻干粉针或注射用乳剂，优选为片剂、滴丸或冻 干粉针。本发明进行了下列试验，证实了迷迭香酸的抗乙肝病毒和丙肝病毒的药理作用。 DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司。II细胞培养及药物细胞毒性检测本研究采用的细胞为IfepG 2. 2. 15细胞株，该细胞株是由!fepG2细胞衍生而来 的稳定支持HBV复制、组装和分泌的细胞系，是一个研究HBV生命活动的良好细胞系H印G 2. 2. 15不仅表现H印G2的生物学特性，同时又可以分泌HBeAg及HBsAg。HepG 2. 2. 15细胞生长于DMEM中，包含100mL/L胎牛血清，100mg/L青霉素， 100mg/L 链霉素和 380ug/mLG418，于 37°C，50mL/L CO2 培养箱培养。HepG 2. 2. 15细胞用胰蛋白酶消化后，以5 X IO4个/mL铺板，24h后加入不同浓 度迷迭香酸(5mg/mL, 2mg/mL, lmg/mL, 500 μ g/mL, 200 μ g/mL, 100 μ g/mL, 50 μ g/mL, 20 μ g/ mL)培养48h后，SRB法检测细胞存活。实验结果表明当迷迭香酸浓度低于500 μ g/mL时， 对H印G 2. 2. 15细胞基本无细胞毒性。表1.迷迭香酸对H印G 2. 2. 15细胞毒性的影响4 111迷迭香酸对HBsAg和HBeAg的抑制率检测胰蛋白酶消化H印G 2. 2. 15细胞后，以5X IO4个细胞/mL铺板，24h后加入不同浓 度的迷迭香酸，37 0C，50mL/L CO2孵箱培养48h后收集上清液，用HBsAg和HBeAg诊断试剂 盒(ELISA)检测HBsAg和HBeAg (潍坊三维生物工程集团有限公司)。抑制率(％)=(未 加药OD值-加药0D) /未加药OD值X 100 %实验结果表明迷迭香酸对H印G 2. 2. 15分泌的HBsAg和HBeAg有明显的抑制作 用，随着迷迭香酸浓度的增加，抑制作用增强。表2.迷迭香酸对H印G 2. 2. 15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率影响 *P < 0. 05 VS 不加药组；**P < 0. 01 VS 不加药组试验例2迷迭香酸抗乙肝病毒体内实验I试验材料迷迭香酸原料按制备例1方法制备；鸭乙型肝炎病毒DNA (DHBV-DNA)阳性鸭血清，采自新鲜分离的麻鸭血清，-70°C保 存；32P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司；缺口翻译药盒购自普洛麦格公司(Primega Co)。试验动物1日龄北京雏鸭，购自北京金星鸭业中心。II试验方法与结果i鸭乙型肝炎病毒感染1日龄北京雏鸭，每只腿静脉注射0. 2mL含DHBV-DNA阳性鸭血清，感染7天后取 血，第7天取血分离血清DHBV-DNA检测结果，去除未感染DHBV-DNA的阴性鸭。 药物治疗试验感染鸭170只，血清检测123只血清DHBV-DNA阳性，感染率为72. 3%。DHBV感染雏鸭随机分组，每组10只，分模型组，静脉给药组(2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、 50mg/kg、100mg/kg)，灌胃给药组(5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)，每日 1 次，连续给药1月，分别于用药1月和停药7天后颈外静脉取血，分离血清。摘取肝脏，各组 取肝右叶同一部位0. 5cmX0. 5cm大小的肝组织用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片， HE染色光镜观察。另取一块肝脏勻浆，提取肝组织DNA，测肝组织中DHBV-DNA。iii 检测取上述待测血清和肝组织DNA溶液，每批同时点膜，测定鸭血清及组织中 DHBV-DNA水平的动态。按缺口翻译试剂盒说明方法，用32p标记DHBV-DNA探针，作斑点杂 交，放射自显影膜片斑点，在490nm处测定OD值，计算DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作 为标本DHBV-DNA水平值。 iv试验结果试验结果表明给药30天和停药7天后测定鸭血请DHBV-DNA结果显示，静脉注射 组，随着给药剂量的增大，血清DHBV-DNA抑制率明显增加，20mg/kg组与模型组相比差异显 著，50mg/kg、100mg/kg组与模型组相比差异特别显著，对鸭血清DHBV-DNA有明显的抑制作 用。灌胃给药组，随着给药剂量的增大，血清DHBV-DNA抑制率明显增加，100mg/kg组与模型 组相比差异显著，200mg/kg组与模型组相比差异特别显著，对鸭血清DHBV-DNA有明显的抑 制作用。停药7天后，DHBV-DNA抑制率有一定的降低。实验结果见表3。停药7天后测定鸭肝脏DHBV-DNA结果显示，静脉注射组，随着给药剂量的增大，肝 脏中DHBV-DNA抑制率明显增加，20mg/kg组与模型组相比差异显著，50mg/kg、100mg/kg组 与模型组相比差异特别显著，对鸭肝脏中DHBV-DNA有明显的抑制作用。灌胃给药组，随着 给药剂量的增大，鸭肝脏DHBV-DNA抑制率明显增加，100mg/kg组与模型组相比差异显著， 200mg/kg组与模型组相比差异特别显著，对鸭肝脏中DHBV-DNA有明显的抑制作用。试验结 果见表4。鸭肝组织病理学检查模型组实验鸭光镜下可见汇管区的炎性细胞浸润，胆小管 增生；肝细胞轻、中度变性(气球样变、脂肪变)，点灶状及碎屑样坏死，但无纤维增生。门管 区均见有炎症细胞侵润；肝实质组织有不同程度的淋巴细胞侵润，胆管轻度增生，肝窦轻度 扩张。给药组肝脏组织可见炎症有不同程度的减轻，小灶状坏死区减少，变性肝细胞减少。 静脉注射50mg/kg，100mg/kg组和灌胃100mg/kg，200mg/kg组肝脏组织病理改善效果好。光 镜观察结果见表5。表3.迷迭香酸对DHBV感染鸭体内血清DHBV-DNA的影响 *P < 0. 05 VS 模型；**P < 0. 01 VS 模型表4.迷迭香酸对DHBV感染鸭体内鸭肝脏DHBV-DNA的影响 *P < 0. 05 VS 模型；**P < 0. 01 VS 模型表5.各实验组肝组织损伤变化情况模型102mg/kg (iv)10
5mg/kg (iv)10
lOmg/kg (iv)10
20mg/kg (iv)1050mg/kg (iv)10
100 mg/kg (iv)10
5mg/kg (ig)10
10 mg/kg (ig)10
50 mg/kg (ig)10
lOOmg/k (ig)10
200 mg/kg(ig)10
7 试验例3迷迭香酸抗丙肝病毒实验I试验材料迷迭香酸原料按制备例1方法制备；人肝细胞系PH5CH购自美国ATCC细胞库；科华抗-HCV检测试剂盒(ELISA)；DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司。II细胞培养及试验结果本研究采用的细胞为非肿瘤形成的人肝细胞系PH5CH细胞，细胞在含100mL/L胎 牛血清，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素的DMEM培养基中，37°C，50mL/L CO2培养箱培养。IHig^^i [Kato N, Ikeda Μ, Mizutani Τ, et al. Replication of hepatitis C viru s in cultrued Non-noplastichuman hepatocytes. J Cancer Res,1996,87(8) 787]，PH5CH细胞用胰蛋白酶消化后，以5 X IO4个/mL铺板，24h后，加入HCV阳性血清，培养 48h后去掉上清液，加入新鲜培养基，然后加入不同浓度迷迭香酸(500 μ g/mL，200 μ g/mL， 100 μ g/mL, 50 μ g/mL, 20 μ g/mL)，培养48h后，取上清液，按ELISA试剂盒说明书，于492nm 处测定OD值。试验结果表明随着迷迭香酸浓度的增加，对HCV病毒的抑制率也增大。当迷迭香 酸浓度达100 μ g/mL，200 μ g/mL时，跟不加药组相比，对HCV病毒抑制率明显增大。表6.迷迭香酸对丙肝病毒的抑制


迷迭香酸的新用途，提供了迷迭香酸在制备治疗或预防肝炎的药物中的应用，具体涉及迷迭香酸在制备治疗或预防乙型肝炎、丙型肝炎的药物中的应用。迷迭香酸对HBsAg和HbeAg有明显的抑制作用，对HCV病毒也具有显著的抑制率。