专利名称：通过发酵制造玉米黄质的方法类胡萝卜素是可用作饲料添加物、食品添加物、药物等的天然色素。类胡萝卜素例如包含玉米黄质、￠-胡萝卜素、￠-隐黄素、虾青素、角黄素、番茄红素、芬尼黄质(phoenicoxanthin)、金盖花黄质(adonixanthin)、海胆酮、asteroidenone 和 3_ 轻基海胆酮等。 类胡萝卜素中，已知玉米黄质作为在玉米等各种植物中含有的天然的黄色色素，添加于饲料中改善鸡等家禽类的卵黄、肉、表皮色调的用途以及作为食品的着色剂的用途。还有报道指出玉米黄质具有強力的抗氧化作用(非专利文献I)和抗肿瘤效果(非专利文献2)。并且还已知玉米黄质与叶黄素一起存在于视网膜和水晶体中，与保持眼的健康有关(非专利文献3)。基于这些生理学效果，玉米黄质可用作健康食品原材料、化妆品原材料和药物原材料。^ -隐黄素含于柑橘类中，已知具有抗肿瘤效果(非专利文献2)，还报道对于预防骨质疏松症具有效果(非专利文献4)，还有作为健康食品原材料和饲料配合剂的用途。^ -胡萝卜素具有前维生素A作用和抗氧化作用，作为饲料添加物、食品添加物、天然着色剂等广泛应用。玉米黄质、^ -隐黄素或P -胡萝卜素添加于鸡等家禽类的饲料中、将该饲料给予家禽类，则会蓄积在卵黄中。由于具有上述的有效的生理作用，因此，蓄积了这些类胡萝卜素的卵黄可用作功能性卵。另ー方面，玉米黄质的制造方法例如已知有使用由氧代异佛尔酮的不对称还原得到的光学活性的羟基酮作为原料的化学合成法(非专利文献5)、以及由玉米种子提取的方法。还已知由万寿菊提取玉米黄质的方法(专利文献I)，来自万寿菊的类胡萝卜素的主要成分为叶黄素，玉米黄质的含量低。生产玉米黄质的微生物的例子已知有螺旋藻类(专利文献2)、微绿球藻属(Nannochloris)微藻类(专利文献3)、屈挠杆菌属(Flexibacter)细菌(专利文献4)、交替单胞菌属(Alteromonas)细菌(专利文献5)、黄杆菌属(Flavobacterium)细菌以及细菌橙黄土壤杆菌(Agrobacterium aurantiacum)(非专利文献6)。另外,在作为类胡萝卜素生产菌而已知的副球菌属(Paracoccus)细菌中，例如已知产玉米黄质副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens) ATCC 21588株(非专利文献7)、细菌产类胡萝卜素副球菌(Paracoccus carotinifaciens) E-396株的变异菌株(专利文献6)、副球菌属细菌A-581-1株的变异菌株(专利文献6)以及副球菌属细菌的变异菌株(专利文献7)生产玉米黄质。但是，上述玉米黄质化学合成法使用有机溶剤，因此在安全性以及近年来的天然物趋势方面存在问题。另外，通过藻类培养生产玉米黄质时，生产率低，因此并不实用。并且由植物提取玉米黄质时，由于玉米黄质的含量低，成本过大，并且受到气候的左右，因此具有难以稳定供给的缺点。另ー方面，副球菌属细菌虽然具有増殖速度快、生产率高、提取容易等有点，但是在培养液中大量生产葡糖酸，致碳源被浪费使用，并且蓄积的葡糖酸抑制玉米黄质的生产，在制造成本方面无法累积生产足够浓度的玉米黄质。因此，人们需求以以往的玉米黄质的低成本可稳定供给的、安全性高的制造方法。现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开平8-92205号公报 专利文献2 :日本特开平10-155430号公报 专利文献3 :日本特开平7-59558号公报 专利文献4 :日本特开平5-328978号公报 专利文献5 :日本特开平5-49497号公报 专利文献6 :日本特开2005-87097号公报 专利文献7 :日本特开2007-151475号公报 非专利文献 非专利文献1:Nobuyoshi Shidzu 等人，“Fisheries Science”, 1996 年，第 62 卷，第I号，134-137页 非专利文献 2 :Tsushima M.等人，“Biol. Pharm. Bull. v, 1995 年，第 18 卷，第2号，227-233 页 非专利文献3 :“F00D Style 21”，1999年，第3卷，第3号，50-53页非专利文献 4 :Yamaguchi M 等人，“ACS Symp Ser (Am Chem Soc) ”, 2008 年，第 993号，408-418 页 非专利文献5 Paust J等人，“Pure Appl. Chem. ” , 1991年，第63卷，第I号，45-58 页 非专利文献 6 :Akihiro Yokoyama 和 Wataru Miki, “FEMS Microbiology Letters”,1995 年，第 128 卷，139-144 页
非专利文献 7:Alan Berry 等人，“International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology，，，2003 年，第 53 卷，231-238 页。


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本发明鉴于上述实际情况而完成，其目的在于提供可以抑制葡糖酸的生产、微生物学制造高浓度且低成本的玉米黄质的方法。本发明人为解决上述课题进行了各种研究，结果发现在产生玉米黄质的细菌的培养中，通过在培养基中添加生物素，可保持低的葡糖酸的生产浓度，同时可生产高浓度的玉米黄质，从而完成了本发明。本发明包含以下内容。(I)制造含有玉米黄质的类胡萝卜素的方法，其特征在于包括将生产含有玉米黄质的类胡萝卜素的细菌在含有生物素的培养基中培养的步骤，与在不含有生物素的培养基中培养结束后的培养液比较，培养结束后的培养液中，葡糖酸生产浓度低，且玉米黄质生产浓度高。(2) (I)的方法，其特征在于培养结束后的培养液中，葡糖酸生产浓度为80g/L以下。(3) (I)的方法，其特征在于培养结束后的培养液中，葡糖酸生产量消耗了碳源的30%(w/w)以下。(4) (I)的方法，其特征在于生产的类胡萝卜素含有￠-隐黄素。(5)⑴的方法，其特征在于生产的类胡萝卜素含有胡萝卜素。(6) (I)的方法，其特征在于单位培养基的生物素的浓度为0. 001mg/L-50mg/L。(7)(1)的方法，其特征在于培养结束后的培养液中，单位干燥菌体的玉米黄质含量为2mg/g以上。(8) (I)的方法，其特征在于培养结束后的培养液中，単位干燥细胞的聚-￠-羟基丁酸(PHB)含量为30%(w/w)以下。(9)(1)的方法,其特征在于细菌为属于副球菌属(Paracoccus)的细菌。(10) (I)的方法，其特征在于细菌是将产生虾青素的副球菌属细菌进行变异处理、使其产生玉米黄质的变异菌株。(11)⑴的方法 ，其特征在于细菌与亲代菌株比较，是使葡糖酸生产能力降低的变异菌株。(12)⑴的方法，其特征在于细菌与亲代菌株比较，是使PHB生产能力降低的变异菌株。(13) (I)的方法，其特征在于细菌是对应于16S核糖体RNA的DNA的碱基序列与SEQ ID NO:1的碱基序列实质上同源的细菌。(14) (I)的方法，其特征在于细菌是来自E-396株(FERM BP-4283)或A-581-1株(FERM BP-4671)的变异菌株。(15)类胡萝卜素组合物，该组合物含有按照(I)的方法制造的含玉米黄质的类胡萝卜素，其特征在于培养结束后的培养液中，単位干燥细胞的PHB含量为30%(w/w)以下。(16)含有含玉米黄质的类胡萝卜素的干燥菌体组合物，该组合物通过将按照(I)的方法得到的培养液干燥来制造，其特征在于単位该组合物的玉米黄质含量为2mg/g以上。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国特许出愿2010-079415号说明书所载的内容。根据本发明，在微生物学生产中，可以将葡糖酸的浓度抑制为低浓度，同时以低成本制造高浓度的玉米黄质。本发明制造的含玉米黄质的类胡萝卜素可用作饲料用和食品用的原材料。实施发明的方案
以下进ー步详细说明本发明。本发明的范围并不限于这些说明，对于以下例举之外，在不损害本发明宗g的范围内也可适当变更后实施。本发明涉及在含有生物素的培养基中培养生产含玉米黄质的类胡萝卜素的细菌(以下有时称为“类胡萝卜素产生细菌”或“玉米黄质产生细菌”)，来制造含玉米黄质的类胡萝卜素的方法(以下称为“本方法”)。本方法中，与在不含生物素的培养基中培养结束后的同样的类胡萝卜素产生细菌的培养液相比，培养结束后的培养液中，葡糖酸生产浓度低，并且玉米黄质生产浓度高。本方法中，通过在培养基中添加生物素，可抑制葡糖酸的生产浓度，同时可以以低成本制造高浓度的玉米黄质。本方法中使用的细菌只要是产生玉米黄质的细菌即可，没有任何限定，优选使用属于副球菌属的细菌。在属于副球菌属的细菌中，优选使用产类胡萝卜素副球菌、马氏副球菌(Paracoccus marcusii)、Paracoccus haeundaensis、产玉米黄质副球菌,特别优选使用产类胡萝卜素副球菌。属于副球菌属的细菌的具体菌株的例子可举出产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)和副球菌属细菌A-581-1株(FERM BP-4671)，另外，使这些菌株变异、与亲代菌株比较、优先产生玉米黄质的变异菌株也在本方法中优选使用。作为其它的玉米黄质产生细菌的具体菌株的例子，还可举出产玉米黄质副球菌ATCC21588株(非专利文献7)。作为玉米黄质产生细菌，优选使用对应于16S核糖体RNA的DNA的碱基序列与SEQID NO:1的E-396株的碱基序列实质上同源的细菌。这里，“实质上同源”是指考虑了 DNA碱基序列确定时的错误频率等，碱基序列优选95%以上、更优选96%以上、进ー步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源。同源性例如可通过基因分析软件ClustalW来确定。“对应于16S核糖体RNA的DNA的碱基序列”是指将16S核糖体RNA的碱基序列中的U (尿嘧啶)置换为T (胸腺嘧啶)的碱基序列。该基于16S核糖体RNA的碱基序列同源性的微生物分类法近年成为主流。以往的微生物分类法是基于以往的运动性、营养要求性、糖的同化性等的微生物学性质，因此，在发生自然突变导致的性状变化等时，可能将微生物误分类。与此相対，16S核糖体RNA的碱基序列在遗传上极为稳定，因此，基于其同源性的分类法与以往的分类法相比，分类的可靠度显著提高。

产类胡萝卜素副球菌E-396株的16S核糖体RNA的碱基序列，与其它类胡萝卜素产生细菌马氏副球菌DSM11574株(International Journal of Systematic Bacteriology(1998)，48，543-548)、副球菌属细菌N-81106株(日本特开2007-244205号公报)、Paracoccus haeundaensis BC 74171 株(Jae Hyung Lee 等人,International Journa丄of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004 年，第 54 卷，第 1699-1702 页)、苜Ij球菌属细菌A-581-1株、产玉米黄质副球菌ATCC21588株和副球菌属种PC-1株(国际公开第2005/118812号小册子)的16S核糖体RNA的碱基序列之间的同源性，分别为99. 7%、99. 7%,99. 6%,99. 4%,95. 7%和95. 4%，可知它们是在分类学上极为近缘的菌株。因此可以说，这些菌株作为产生类胡萝卜素的细菌，形成了ー个群。本方法中，也可以使用将虾青素生产细菌进行变异处理，使得与亲代菌株比较，优先产生玉米黄质的变异菌株。上述变异菌株例如可举出专利文献6公开的变异菌株、专利文献7公开的变异菌株等。将虾青素产生细菌进行变异处理以获得优先产生玉米黄质的变异菌株的方法如以下所例示。变异的亲代菌株只要是生产虾青素的细菌即可，可以是任何细菌，优选使用属于副球菌属的细菌。产生虾青素的属于副球菌属的细菌中，优选使用产类胡萝卜素副球菌、马氏副球菌、Paracoccus haeundaensis,特别优选使用产类胡萝卜素副球菌。属于副球菌属的细菌的具体的菌株例子可举出产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)和副球菌属细菌A-581-1株(FERM BP-4671)，将这些菌株变异而虾青素生产率提高的变异菌株也作为亲代菌株优选使用。另外，作为变异的亲代菌株使用的虾青素产生细菌，优选使用对应于16S核糖体RNA的DNA的碱基序列与SEQ ID NO:1的E-396株的碱基序列实质上同源的细菌。这至，“实质上同源”是指考虑了 DNA的喊基序列确定时的错误频率等，喊基序列优选95%以上、更优选96%以上、进ー步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源。将虾青素生产细菌进行变异处理的方法只要是诱发突变的方法即可，没有特别限定。例如可以采用利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸こ酯(EMS)等诱变剂的化学方法、紫外线照射和X射线照射等的物理方法、利用基因重组以及转座子等的生物学方法等。或者也可以是自然发生的自发性突变。该变异处理可以进行I次，还可以是例如通过该突变处理获得高生产虾青素的变异体、再将其进一步进行突变处理的2次以上的变异处理。本发明中，变异处理后，使其在固体培养基上形成菌落，可随机挑取菌落，但为了提高筛选效率，与亲代菌株的红色-红橙色的菌落相比，可以选择呈现黄色-橙色的菌落。从将虾青素生产细菌进行变异处理得到的变异菌株中筛选所生产的玉米黄质相对于总类胡萝卜素量的比例特别高的变异菌株的方法可通过培养变异菌株、对所得培养液中的类胡萝卜素化合物进行分析来实现。该培养方法例如如下所示。即，在含有生产菌的生长所必需的成分、生成类胡萝卜素化合物的成分的培养基中进行培养。培养方法可以是试管、烧瓶等中的振荡培养、通气搅拌培养等任 意方法。类胡萝卜素化合物的分析方法只要是可以分离检出类胡萝卜素化合物的方法即可，可以是任何方法，例如可以使用高效液相色谱、薄层色谱、纸色谱等。本发明中，玉米黄质生产细菌的获得是通过筛选玉米黄质相对于总类胡萝卜素量的比例高的变异菌株来进行。这里所述的总类胡萝卜素量表示虾青素、角黄素、金盏花黄质、￠-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄质、￠-隐黄素、3_羟基海胆酮、asteroidenone、金盖花红素(Adonirubin)等的类胡萝卜素化合物的总量。作为其筛选基准的玉米黄质的比例比变异前的亲代菌株的玉米黄质生产比例高，这是最低限的条件，相对于所生产的总类胡萝卜素量，可筛选玉米黄质显示优选为20%(w/w)以上、更优选40%(w/w)以上、进ー步优选60%(w/w)以上的玉米黄质比例的变异菌株。本方法中，也可以将玉米黄质产生细菌进行变异处理，选择与亲代菌株比较、玉米黄质的生产率提高的变异菌株，使用该变异菌株。玉米黄质生产率提高的变异菌株的具体获得方法可举出以下方法在进行了与上述同样的变异处理后，例如在琼脂培养基上选择呈现深橙色的菌落，将各个变异菌株在试管、烧瓶等中培养，对玉米黄质进行定量，筛选玉米黄质产生浓度高的变异菌株。本方法中可使用与亲代菌株比较、PHB(聚-￠-羟基丁酸)的生产能力降低的变异菌株。例如，可以由上述的属于副球菌属的细菌诱导该变异菌株。己知生产玉米黄质的细菌在细胞内蓄积PHB作为储存碳源。如果蓄积了 PHB，则相应部分的培养基碳源被浪费，因此，为了降低制造成本，要使其尽量不蓄积PHB。因此，通过变异处理以及筛选来获得PHB蓄积少或者完全不蓄积的变异菌株，这是有效的。获得PHB低生产株的具体方法可举出以下方法进行与上述同样的变异处理，然后例如将各个变异菌株在试管、烧瓶、琼脂培养基等中培养，对PHB进行定量，筛选PHB生成量少的变异菌株。本方法中也可以使用与亲代菌株比较、葡糖酸生产能力降低的变异菌株。例如可由上述属于副球菌属的细菌诱导该变异菌株。如果生成葡糖酸，则相应部分的培养基碳源被浪费，另外，如果蓄积显著量的葡糖酸，则会抑制生长或类胡萝卜素的生产。因此，尽量减少葡糖酸的生成，这对于类胡萝卜素的生产有效。获得葡糖酸低生产株的具体方法可举出以下方法进行与上述同样的变异处理，然后例如将各个变异菌株在试管、烧瓶等中培养，測定培养液的PH，筛选pH降低少的变异菌株，然后进一步测定培养液的葡糖酸，筛选葡糖酸生成量少的变异菌株。上述的玉米黄质生产率得到改良的变异菌株、PHB的生产能力降低的变异菌株、葡糖酸的生产能力降低的变异菌株等的被赋予优选的性质的变异菌株可以分别获得，也可以反复进行变异处理和筛选，使同时具有这些中2种以上的性质。还可以进行I次变异处理，组合2种以上的筛选，获得同时被赋予2种以上的性质的变异菌株。本方法中可使用具有这些中2种以上的优选性质的变异菌株。作为本方法中使用的类胡萝卜素产生细菌的例子所举出的E-396株如下国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。国际保藏単位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心 (旧名称通商产业省エ业技术院生命工学エ业技术研究所)
〒 305-8566
日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6
识别标记E~396
保藏号FERM BP-4283
原保藏日平成5年(1993年)4月27日
作为本方法中使用的类胡萝卜素生产细菌的其它例子举出的A-581-1株如下国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。国际保藏単位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心 (旧名称通商产业省エ业技术院生命工学エ业技术研究所)
〒 305-8566
日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6
识别标记A-581~1
保藏号FERM BP-4671
原保藏日平成6年(1994年)5月20日
需要说明的是，除玉米黄质以外，由本方法产生的类胡萝卜素没有特别限定，例如可举出￠-胡萝卜素、￠-隐黄素、虾青素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质、海胆酮、asteroidenone、3_轻基海胆酮和番爺红素,优选举出P _胡萝卜素和P _隐黄素。由本方法制造的类胡萝卜素可以是ー种，也可以是多种的组合。以下说明本方法中培养上述细菌的方法。本方法中，用于培养的玉米黄质生产用培养基只要是添加了生物素的培养基、且使玉米黄质产生细菌生长、生产玉米黄质即可，可以是任何培养基，优选使用含有碳源、氮源、无机盐类以及根据需要含有维生素类等的培养基。即，本方法中，生物素添加于可使玉米黄质产生细菌生长、产生玉米黄质的培养基中。碳源例如可举出葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和麦芽糖等糖类，こ酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙ニ酸和丙酮酸等有机酸，こ醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和甘油等醇类，豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和亚麻籽油等油脂类等，其中优选使用葡萄糖或蔗糖。这些碳源中，可以使用I种或2种以上。添加于培养前的培养基(起始培养基)中的碳源的量根据碳源种类而不同，适当调节即可满足，通常IL培养基为l-100g，优选2-50g。另外，碳源不仅添加于起始培养基中，也优选在培养期间依次或连续追加供给。无机氮源例如可举出硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐类，硝酸钾等硝酸盐类，氨和尿素等，其中可使用I种或2种以上。添加量根据氮源的种类而不同，适当调整即可满足，通常相对于IL培养基为0. lg_20g，优选0. 2-10g。有机氮源例如可举出玉米浆(包含过滤处理物)、Pharmamedia、豆柏、豆粉、花生柏、谷氨酸钠、烧酒糟残液和干燥酵母等，其中可使用I种或2种以上。添加浓度根据氮源的种类而不同，适当调整即可满足，通常在培养基中为0-80g/L，优选0-30g/L。无机氮源和有机氮源通常添加于起始培养基中，也优选依次或连续追加供给。无机盐类例如可举出磷酸ニ氢钾、磷酸氢ニ钾、磷酸氢ニ钠等磷酸盐类，硫酸镁、氯化镁等镁盐类，硫酸鉄、氯化铁等铁盐类，氯化钙、碳酸钙等钙盐类，碳酸钠、氯化钠等钠盐类，硫酸锰等锰盐类，氯化钴等钴盐类，硫酸铜等铜盐类，硫酸锌等锌盐类，钥酸钠等钥盐类，硫酸镍等镍盐类，硒酸钠等硒盐类，硼酸和碘化钾等，其中可使用I种或2种以上。添加量根据无机盐的种类而不同，适当调整即可满足，通常相对于IL培养基为0. 0001-15g。对于磷酸盐类、镁盐类、钙 盐类、钠盐类和铁盐类，在培养基中的浓度优选为0. 02-15g/L，加入锰盐类、钴盐类、铜盐类、锌盐类、钥盐类、镍盐类、硒盐类、硼酸、碘化钾等时，优选0. l-15mg/L的浓度。无机盐类通常添加于起始培养基中，也可以依次或连续追加供给。生物素以外的维生素类例如可使用维生素B12、核黄素、泛酸、吡哆醇、硫胺、抗坏血酸、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、肌醇、胆碱等。添加比例根据维生素类的种类而不同，适当调整即可满足，通常相对于IL培养基为0. OOl-lOOOmg，优选0. Ol-1OOmgo维生素类通常添加于起始培养基中，也可以依次或连续追加供给。本方法的特征是在添加了生物素的培养基中培养玉米黄质产生细菌。通过在添加了生物素的培养基中培养玉米黄质产生细菌，可以将葡糖酸浓度抑制为低浓度，同时可高浓度制造玉米黄质。本方法中使用的生物素可以是DL构型也可以是D构型，优选使用D构型。生物素通常添加于起始培养基中，也可以在培养期间间歇或连续添加，还可以在添加于起始培养基中的基础上进一歩在培养期间间歇或连续追加添加。生物素可以与主培养基混合后杀菌，也可以另行杀菌后添加。生物素的杀菌方法没有特别限定，可以是加热杀菌也可以是过滤灭菌。単位培养基中添加的生物素的浓度没有特别下限，优选0.001mg/L以上，更优选
0.005mg/L以上，进ー步优选0. 01mg/L以上，特别优选0. 02mg/L以上。另外，生物素的添加浓度也没有特别上限，优选50mg/L以下,更优选20mg/L以下,进ー步优选10mg/L以下,特别优选5mg/L以下,最优选2mg/L以下。本方法中，为了抑制培养液的发泡，优选使用消泡剂。消泡剂的种类只要是可以抑制泡沫发生或者具有消除所产生的泡沫的作用，且对于生产菌的抑制作用小即可，可以是任何ー种。例如可例举醇类消泡剂、聚醚类消泡剂、酯类消泡剂、脂肪酸类消泡剂、硅酮类消泡剂、磺酸类消泡剂等。消泡剂的添加量根据消泡剂的种类而不同，适当调整即可满足，通常相对于IL培养基为0. Olg-1Og0消泡剂通常是添加于杀菌前的起始培养基中。也可以进一歩在培养期间连续或间歇追加添加消泡剂。在培养期间添加消泡剂的方法例如可举出通过传感器感知泡沫，自动添加的方法；通过程序定时器，每间隔一定时间添加的方法；与生长速度关联、与添加用碳源、氮源或PH调节剂等混合添加的方法等。添加于起始培养基中的消泡剂和在培养期间添加到培养液中的消泡剂可以是同一种，也可以结合其作用使用不同的种类。本方法中，培养开 始时的培养基的pH可调节为2-12，优选6-9，更优选6. 5-8. O。优选培养中也保持上述范围的pH。保持pH的方法优选用设置于发酵槽内的pH电极在线测定培养液的pH、自动供给碱的方法。pH调节剂例如可举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、氨水、氨气、硫酸水溶液或它们的混合物。本方法中，培养基是在杀菌处理后用于细菌的培养。杀菌处理可由本领域技术人员适当进行。例如可以是通过高压釜将适当容器中的培养基加热灭菌。或者通过灭菌滤器过滤灭菌。或者通过加热套加热以及吹入水蒸汽进行灭菌。葡萄糖等碳源如果与其它培养基成分一起加热杀菌则发生褐变，因此可以另行杀菌。维生素类或微量的金属类可以与主培养基一起加热杀菌，但为防止失活或沉淀，可以另行杀菌。本方法中，玉米黄质产生细菌是将其接种到上述制备的添加了生物素的培养基中，在规定的条件下培养。接种可通过使用试管、烧瓶或发酵槽等的种菌培养，使菌株适当増加，将所得培养液加入到玉米黄质生产用的添加了生物素的培养基中进行。种菌培养所使用的培养基可以是添加了生物素的培养基，也可以是未加添加生物素的培养基，只要是可以使玉米黄质产生细菌良好増殖的培养基即可，没有特别限定。培养可在适当的培养容器中进行。培养容器可根据培养容量适当选择，例如可举出试管、烧瓶、发酵槽等。培养温度例如为15_40°C，优选20-35 °C，更优选25 V -32で。培养时间通常为I天-20天，优选2-12天，更优选3-9天，特别优选4-7天，可在好氧条件下培养。好氧条件例如可举出振荡培养或通气搅拌培养等，如果氧不足，则对于玉米黄质产生细菌的生长或类胡萝卜素生产有不良影响，因此，优选连续通过溶解氧电极监测溶解氧浓度。优选控制溶解氧浓度，使氧不枯竭。溶解氧浓度的控制例如可通过改变搅拌转数、通气量、内压、通气气体中的氧浓度等进行。培养液中溶解氧浓度优选控制为0. 5ppm以上，更优选Ippm以上，进ー步优选1.5ppm以上。培养液中的溶解氧浓度的控制范围上限没有特别限定，优选Sppm以下，更优选7ppm以下，进ー步优选6ppm以下，特别优选5ppm以下。本方法中使用的细菌在培养液中生成葡糖酸。如果生成葡糖酸，则浪费了相应部分的培养基碳源，另外，如果蓄积显著量的葡糖酸，则抑制生长或类胡萝卜素生产。因此，尽量减少葡糖酸的生成，这对于类胡萝卜素的生产有效。本方法中，通过在培养基中添加生物素，可以减少葡糖酸的生成量。最终得到的培养结束后的培养液中，葡糖酸生产浓度优选为80g/L以下，更优选60g/L以下，进ー步优选40g/L以下，特别优选20g/L以下，非常优选10g/L以下，下限为Og/L。培养结束后，消耗単位碳源带来的葡糖酸生产量优选为30%(w/w)以下，更优选20%(w/w)以下，进ー步优选10%(w/w)以下，特别优选5%(w/w)以下，没有下限。本方法中，在培养基中添加生物素，则可以抑制PHB(聚-￠-羟基丁酸)的生成。最終得到的培养结束后的培养液中，単位干燥细胞的PHB的含量优选为30%(w/w)以下，更优选20%(w/w)以下，进ー步优选10%(w/w)以下，特别优选5%(w/w)以下，下限为0%(w/w)。特别是培养结束后的培养液中，単位干燥细胞的PHB的含量为30%(w/w)以下的培养液适合用作饲料添加用。本方法中，培养玉米黄质产生细菌得到的培养液中的类胡萝卜素、或者由培养液中收集的类胡萝卜素的定量例如可通过高效液相色谱进行。如上所述，培养玉米黄质产生细菌得到的培养液可以直接作为类胡萝卜素使用，或者也可以从培养液中制备例如培养上清、菌体浓缩物(菌体浓缩液)、湿菌体、干燥菌体、菌体溶解物等，使用这些制备物。还可进一歩通过提取、纯化等，由这些培养液或制备物中收集类胡萝卜素。培养上清可以是将培养液进行离心处理或过滤处理，从培养液中除去菌体来制备。菌体浓缩物(菌体浓缩液)可通过将培养液离心、膜过滤浓缩或倾析获得。湿菌体可通过将培养液离心或过滤获得。干燥菌体可按照常规干燥方法将培养液、湿菌体或菌体浓缩物(菌体浓缩液)干燥获得。在获得菌体浓缩物的步骤中，培养液的pH没有特别限定，为了使类胡萝卜素容易沉淀，可以使培养液为酸性。酸性条件只要是在酸性区域即可，可以是任何PH，优选pH6. 5以下，更优选PH5. 5以下，进ー步优选pH5.0以下。

菌体浓缩物相对于培养液的浓缩率没有特别限定，优选1. 5倍-10倍，进ー步优选2倍_6倍。这里的浓缩率，例如浓缩率为2倍是指菌体浓缩物的体积为培养液体积的二分之一。在浓缩步骤中，为了提高不需要的成分的除去效果，还优选用水将培养液稀释，然后进行浓缩。还可以在离心、过滤分离或倾析等浓缩操作期间加入水。也可以在浓缩后加入水，再次浓缩。为了稀释而加入的水量没有限定，优选为培养液体积的0-10倍，更优选0. 2-6倍，进ー步优选0. 3-3倍。离心所使用的离心机可以是连续式也可以是间歇式，优选使用连续式。离心机的类型例如举出筐式、多室式、倾析式、碟片式(喷嘴式、排渣式)、管式、转子式的离心机。过滤分离中使用的膜过滤装置可以是静态式也可以是交叉流动式，优选使用容易防止堵塞的交叉流动式。膜的材质例如可例举滤纸、滤布、化学纤维、陶瓷等。干燥方法没有特别限定，例如可举出喷雾干燥、流化干燥、喷雾流化制粒干燥、转鼓干燥、冷冻干燥等。干燥后为了制成微粉末，优选将干燥菌体进行粉碎。粉碎的方法没有特别限定，例如可举出打浆磨、锤磨机、球磨机、珠磨机等。这样得到的含类胡萝卜素的干燥菌体组合物可以直接作为饲料用或食品用的添加物使用。
单位干燥菌体组合物的玉米黄质含量优选2mg/g以上,更优选4mg/g以上,进ー步优选6mg/g以上。上限没有特别限定,优选50mg/g以下，更优选40mg/g以下,进ー步优选30mg/g 以下。本方法中，从上述培养液或制备物中收集类胡萝卜素的方法没有特别限定，可以是可稳定、高效率回收类胡萝卜素的任意方法。这些方法可由本领域技术人员从公知的提取或纯化技术中适当选择进行。另外，进行提取之前，可以将培养液或制备物进行下述处理中的I种或2种以上的处理使用碱试剂或表面活性剂等的化学处理；使用溶菌酶、脂质分解酶和蛋白质分解酶等的生物化学处理；或者超声波或粉碎等物理性处理。例如，从培养液或制备物中提取类胡萝卜素时，提取和洗涤所使用的溶剂没有特别限定，例如可举出甲醇、こ醇、异丙醇等低级醇类，丙酮、四氢呋喃、甲基こ基酮、甲基异丁基酮、ニ氯甲烷、氯仿、ニ甲基甲酰胺、ニ甲基亚砜等。在希望尽量防止提取操作中类胡萝卜素的氧化的情况下，可以在氮气等惰性气体气氛下进行处理。还可以选择在药物或食品中使用的抗氧化剂，加入到适当的提取容剂中。或者将这些处理组合进行。为了尽量防止光导致的类胡萝卜素的分解，可以在无光照的条件下进行提取。这样得到的提取物可以作为类胡萝卜素直接使用，也可以进ー步纯化后使用。从提取操作后的提取液等的提取物中分离细菌等的方法没有特别限定，例如可举出膜过滤、离心、倾析等。 从提取物中获得类胡萝卜素沉淀物的方法通常可举出加热和/或减压浓缩或结晶。除此之外，还可通过低温下类胡萝卜素色素的析出、利用酸 碱试剂或各种盐类的析出，而不浓缩类胡萝卜素色素地进行分离。エ业应用时优选結晶。为了洗涤所得类胡萝卜素沉淀物，可根据需要使用少量的低级醇类等溶剂，悬浮搅拌。洗涤的方法没有特别限定，实际应用中优选的方法例如可举出悬浮搅拌后滤取的方法，或者从沉淀物上方通入液体的方法等。上述得到的培养液、制备物、提取物或纯化物可分别作为类胡萝卜素単独使用，或者可将它们以任意比例混合使用。
实施例以下给出实施例，具体说明本发明，但本发明的范围并不限定为以下的实施例。实施例中的类胡萝卜素类的定量可使用高效液相色谱(HPLC)如下进行。柱是将2根 Inertsil SIL-100A, 5 U m(4. 6 X 250mm) (GL Sciences 制造)连接使用。洗脱是在室温附近一定的温度下、以每分钟流动1. OmL作为流动相的正己烷/四氢呋喃/甲醇混合液(40:20:1)进行。測定中，将样品用四氢呋喃溶解，用流动相稀释100倍，将20 y L稀释的液体作为注入量，柱洗脱液的检测在波长470nm下进行。定量用的标准品是使用EXTRASYNTHESE公司制造的玉米黄质(Cat. No. 0307 S)。标准液玉米黄质浓度的设定是在标准液的453nm的吸光度(A)以及上述条件下进行HPLC分析时，測定玉米黄质峰的面积百分率％(B)，然后采用下式进行。
玉米黄质的浓度(mg/L)=A +2327XBX 100 [实施例1]
将产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)用N-甲基_N’_硝基-N-亚硝基胍进行变异处理，选择黄色-橙色的菌落。測定所选择的菌株的培养液中的类胡萝卜素浓度，选择玉米黄质生产能力高的变异菌株ZX-3株。将IOOml以下组成的培养基(30g/L蔗糖、30g/L玉米浆、1.5g/L磷酸ニ氢钾、3. 8g/L磷酸氢ニ钠12水合物、5. Og/L氯化钙2水合物、0. 7g/L硫酸镁7水合物、0. 3g/L硫酸铁7水合物，pH7. 2)加入到500ml容量的具棉塞的三角烧瓶中，在121°C下高压釜杀菌20分钟，制备7支种菌用烧瓶培养基。接着，将2. OL以下组成的培养基(20g/L葡萄糖、30g/L玉米浆、0.5g/L硫酸铵、
2.25g/L硫酸ニ氢钾、5. 7g/L磷酸氢ニ钠12水合物、0. lg/L氯化钙2水合物、0. 5g/L硫酸镁7水合物、5g/L硫酸铁7水合物、0. 5g/L醇类消泡剂)加入到5L容量的发酵槽中，准备7个。在该发酵槽中分别添加D-生物素，使其浓度分别为0、0. 001,0. 01,0. l、1.0、l(^P50mg/L，在121°C下高压釜杀菌40分钟。在上述种菌用烧瓶培养基中接种ー钼环上述副球菌属玉米黄质产生细菌ZX-3株，在29°C下、以IOOrpm旋转振荡培养2天，然后将80ml该培养液接种于上述各发酵槽中。在29°C下进行120小时通气量Iwm的好氧培养。用15%氨水连续地进行pH控制，使培养中的PH保持7.1。连续添加葡萄糖，使其不枯竭。另外，使搅拌转数变化，最低搅拌转数为lOOrpm，使培养中期(微生物耗氧最活跃时期)的培养液中的溶解氧浓度保持2ppm。通过气泡传感器感知发泡，自动添加醇类消泡剂，抑制发泡。測定培养结束时培养液的类胡萝卜素浓度、葡糖酸浓度以及単位干燥细胞的PHB含量，结果如表I所示。在添加了 0. 001-50mg/L生物素的试验区中，与未添加生物素的区比较，可知玉米黄质浓度高，葡糖酸浓度低。表I中的“葡糖酸相对于糖的收率％(w/w)”是指培养结束时的葡糖酸生成量相对于消耗的葡萄糖总量的比例。[表 I]


本发明的目的在于提供可以抑制葡糖酸的生产、同时高浓度且低成本地微生物学制造玉米黄质的方法，具体来说，涉及制造含玉米黄质的类胡萝卜素的方法，其特征在于包括将生产含有玉米黄质的类胡萝卜素的细菌在含生物素的培养基中培养的步骤，与不含生物素的培养基中培养结束后的培养液比较，培养结束后的培养液中，葡糖酸的生产浓度低，且玉米黄质生产浓度高。