专利名称：一种卷烟烟气体外细胞毒性测试方法卷烟烟气的体外毒理学研究已经成为评价吸烟对健康危害的重要手段之一，目前，有关卷烟烟气的体外毒理学研究大多集中于烟气冷凝物的细胞毒性和基因毒性方面。如何科学准确地评价低危害卷烟产品以及烟草添加剂的危害性，目前国际上还没有统一的方法和程序。在生物学实验研究中，进行细胞存活率的测定是一项关键的试验技术。目前进行卷烟烟气细胞毒性评价时采用的方法大多基于细胞存活率测定的原理，但相关的试验操作步骤较为烦琐、周期较长。发展新的测试方法满足具有敏感性、可靠性、快速、简便等特点是一种需求。WST-I (一种水溶性四唑盐)染料是一种广泛应用于细胞增殖和细胞存活率的快速高灵敏度检测试剂，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。细胞增殖越多，则颜色越深；细胞存活率越低，则颜色越浅。WST-I产生的甲臜是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤，同时WST-I染料稳定性强，其颜色反应时线性范围宽，灵敏度高，且对细胞无明显毒性。卷烟烟气是一种复杂的混合物体系，且毒性较低，在进行烟气的细胞毒性评价时，需要灵敏度高的试验方法；同时在进行批量卷烟样品的毒性测试时也要求测试方法快速、简便。
本发明的目的正是针对上述存在的问题，并基于WST-I染料颜色反应的原理以及其自身的优点，根据卷烟烟气细胞毒性的特点，建立的一种卷烟烟气体外细胞毒性的测定方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 I)配制实验试剂有以下几种 (I)生长培养液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU/ml青霉素+ 100 μ g/ml链霉素。(2) 样品稀释培养液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100IU/ml青霉素+ 100 μ g/ml链霉素。(3) WST-I染液-20 °C保存，临用前37 1温育融化，避免发生沉淀。(4)阳性对照十二烷基硫酸钠(SDS) (200 μ g/ml，100%细胞致死率浓度)。(5)阴性对照2% (v/v) 二甲基亚砜(DMS0)。 2)细胞接种培养经扩增培养的中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞进行消化以后，制备细胞悬液(IXlO5个/ml)。96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h。 3)卷烟烟气染毒使用样品稀释培养液将烟气总粒相物样品调整到不同浓度，设置8个非零浓度。细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为阴性对照、8个不同剂量的烟气总粒相物染毒和阳性对照处理，每孔加入100 μ I的含有阴性对照、烟气总粒相物或阳性对照的稀释培养液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I稀释培养液作为空白对照，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h。
4)WST-I染色烟气染毒24 h后，每孔加入10 μ I经温育的WST-I染液，细胞于37°C、5% CO2条件下孵育2 h，室温下快速振荡I min，使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光值，参考波长为630 nm。


一种卷烟烟气体外细胞毒性测试方法，其特征在于包括以下步骤1)配制实验试剂，2)细胞接种培养，3)卷烟烟气染毒，4)WST-1染色，5)结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点在整个试验过程中减少了多次洗涤细胞的试验步骤，操作更为简便；WST-1染色时无需进行更换培养液的步骤，可直接加入稀释培养液进行反应；WST-1产生的甲臜是水溶性的，省去了后续的溶解步骤，WST-1染色后2h内即可完成吸光值检测，相对于以往的测试方法缩短了测试周期，更加快速。本测定方法还具有操作更快速简便、灵敏性更高、结果更稳定的优点，同时此方法可以适用于多种细胞系的烟气细胞毒性测试。