Etfb在细胞异常增殖中的应用方法以及异常增殖抑制剂的制作方法[0002]成纤维细胞的异常增殖与例如创伤中产生的增生性疤痕、肺中的纤维症、肝硬化、肾硬化症等各种疾病相关。在诱发这些异常增殖的过程中，TGF-β被认为参与其中(参照例如专利文献1、专利文献2、专利文献3)，但TGF-β是多任务生物物质，因而从很多方面来看，不能以单纯的抑制来应对，正是由于上述原因，尚不存在副作用少的有效的TGF-β阻碍剂。即，在TGF-β的下游找到与该疾病直接相关的成纤维细胞异常增殖的因子，并对其进行选择性地抑制，被认为是所述成纤维细胞异常增殖症的有效的抑制手段。[0003]另一方面，ETFB是涉及电子转移的蛋白质(参照例如专利文献4、专利文献5、专利文献6、专利文献7)，时而还被用作生物标志物，但对于其实际状态并不是特别了解。有报告称在脂质潴留性肌肉疾病中可见ETFB的突变(参照例如非专利文献I)，并有暗示其是II型糖尿病的原因之一(例如参照非专利文献2)、以及多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency ；MADD)的一个因素(参照例如非专利文献3)等，但全 然不知其与皮肤等的相关性、以及与成纤维细胞的关系。此外，ETFB与TGF- β的关联也是全然不知的。[0004]另一方面，已经有报告称，在将成纤维细胞在胶原凝胶中施加张力进行培养的情况下，细胞增殖亢进，胶原表达等上升，观察到近似纤维化的现象；在其中存在TGF-β的情况下，还观察到成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化(参照例如非专利文献4)。然而，这样的现象中的细胞增殖因子尚不明确。[0005]现有技术文献[0006]专利文献[0007]专利文献1:日本特开2010-222351号公报[0008]专利文献2:日本特开2010-59124号公报
[0009]专利文献3:日本特开2009-40796号公报
[0010]专利文献4:日本特表2010-508014号公报
[0011]专利文献5:国际公开W02006/054722号小册子
[0012]专利文献6:日本特表2010-514441号公报
[0013]专利文献7:日本特开2010-107461号公报
[0014]非专利文献
[0015]非专利文献1:Wen B.et.al., J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry.2010 ；81 (2):231-6
[0016]非专利文献2:Lu H.et.al., J.Mol.Cell Proteomics.2008 ；7(8):1434-51[0017]非专利文献3 =Schiff M.et.al.，Mol.Genet.Metab.2006 ；88 (2): 153-8
[0018]非专利文献4:Au K.et.al., Exp.Mol.Pathol.2010 ；89 (3):236-240


[0019]本发明正是在这样的情况下完成的，其课题是，提供对成纤维细胞的异常增殖进行早期鉴别、抑制其的手段。
[0020]鉴于这样的情况，本发明人为寻求对成纤维细胞的异常增殖进行早期鉴别、抑制其的手段而进行了深入研究，结果通过对将成纤维细胞在存在张力的条件下于胶原凝胶中进行培养的情况、与在不存在张力的条件下于胶原凝胶中进行培养的情况的表达蛋白质进行比较，发现了 ETFB的表达在前一条件下亢进，凸显出其是成纤维细胞的异常增殖的因子，从而完成了发明。
[0021]即，本发明如下所示。
[0022]<1> 一种成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法，该成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法以ETFB(电子转移黄素蛋白β亚基)的表达的程度作为指标，其中，
[0023]该ETFB的表达的程度高的情况下，判定为发生成纤维细胞的异常增殖的盖然性闻，
[0024]ETFB的表达的程度低的情况下，判定为成纤维细胞的增殖保持正常的盖然性高。
[0025]〈2X1〉所述的鉴别方法，其中，
[0026]所述ETFB的表达的程度高的情况是被检试样的成纤维细胞中的表达量相对于对照的成纤维细胞中的表达量高的情况，
[0027]所述ETFB的表达的程度低的情况是被检试样的成纤维细胞中的表达量相对于对照的成纤维细胞中的表达量相同或低的情况。
[0028]〈3>〈1>所述的鉴别方法，其中，所述成纤维细胞的异常增殖是纤维化。
[0029]〈4>〈3>所述的鉴别方法，其中，所述纤维化归因于成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。
[0030]〈5>〈1>所述的鉴别方法，其中，成纤维细胞的异常增殖是增生性疤痕的形成。
[0031]〈6>—种脏器中的纤维化的鉴别方法，该脏器中的纤维化的鉴别方法以被怀疑纤维化的脏器的成纤维细胞中的、ETFB的表达程度为指标，其中，
[0032]在ETFB的表达程度高的情况下，判定为该脏器中发生纤维化的盖然性高，
[0033]在未确认到ETFB的亢进的情况下，判定未发生纤维化的盖然性低。
[0034]<7><6>所述的脏器中的纤维化的鉴别方法，其中，
[0035]ETFB的表达的程度高的情况是指被检试样在脏器中的表达量相对于对照中的表达量闻的情况，
[0036]未确认到ETFB的允进的情况是被检试样在脏器中的表达量相对于对照中的表达量相同或低的情况。
[0037]<8><7>所述的脏器中的纤维化的鉴别方法，其中，所述脏器为皮肤。
[0038]〈9> 一种纤维化抑制剂 的鉴别方法，其中，将成纤维细胞在张力存在下的胶原凝胶中、于存在和不存在被检物质的条件下进行培养，
[0039]在存在被检物质的条件下进行培养时，ETFB的表达量与在不存在被检物质的条件下进行培养时相比低的情况下，将该被检物质作为纤维化抑制剂。
[0040]〈10>〈9>所述的异常纤维化抑制剂的鉴别方法，其中，所述纤维化是增生性疤痕的形成。
[0041]〈11X10〉所述的纤维化抑制剂的鉴别方法，其中，所述纤维化是皮肤的增生性疤痕。
[0042]<12><1>~〈11>中任一项所述的鉴别方法，其中，所述ETFB的表达是蛋白质的表达。
[0043]〈13X1〉~〈I 1>中任一项所述的鉴别方法，其中，所述ETFB的表达是RNA的表达。
[0044]〈14X13〉所述的鉴别方法，其中，通过聚合酶链式反应(PCR)来测定ETFB的表达的程度。
[0045]〈15X14〉所述的鉴别方法，其中，用于所述PCR的引物是:
[0046]SEQ ID NO:1所述的寡核苷酸或具有其作为部分序列、且能够扩增编码ETFB的碱基序列的寡核苷酸；以及
[0047]SEQ ID NO:2所述的寡核苷酸或具有其作为部分序列、且能够扩增编码ETFB的碱基序列的寡核苷酸。
[0048]<16> 一种纤 维化抑制剂，其由下述被检物质组成:
[0049]将成纤维细胞在张力存在下的胶原凝胶中、于存在和不存在被检物质的条件下进行培养，在存在被检物质的条件下进行培养时，ETFB的表达量与在不存在被检物质的条件下进行培养时相比低。
[0050]〈17X16〉所述的纤维化抑制剂，其中，所述纤维化是增生性疤痕的形成。
[0051]<18> 一种增生性疤痕处置药物，其以〈16>所述的纤维化抑制剂作为有效成分。
[0052]〈19X18〉所述的增生性疤痕处置药物，其用于已发生的增生性疤痕的治疗。
[0053]〈20X18〉所述的增生性疤痕处置药物，其用于预防，使得已发生的增生性疤痕不恶化。
[0054]〈21X18〉所述的增生性疤痕处置药物，其用于预防，以防止产生发生盖然性高的疤痕。
[0055]〈22>能够扩增编码ETFB的碱基序列的、与SEQ ID NO:1或2所示的寡核苷酸基本相同的寡核苷酸。
[0056]根据本发明，能够提供早期鉴别、抑制成纤维细胞的异常增殖的手段。



[0057][图1]显示实施例1的胶原凝胶内培养的结果的图。
[0058][图2]显示实施例1的ETFB对成纤维细胞的增殖的影响的图。
[0059][图3]显示实施例1的ETFBsiRNA对TGF-β诱导的应力纤维形成的影响的图(照片)。对于导入了 ETFB或阴性对照(Negative control) siRNA的CCD_1113sk细胞添加TGF-β (llng/ml)后，培养3日，然后实施了鬼笔环肽染色。
[0060][图4]显示实施例1的ETFBsiRNA对胶原凝胶收缩的影响的图。导入ETFB或阴性对照SiRNA，实施胶原凝胶内培养，对凝胶收缩进行了观察(η = 6)。
[0061][图5]显示实施例1的ETFBsiRNA对编码α -平滑肌肌动蛋白(SMA)的RNA的产生量的影响(Negative control)的图。导入ETFB或阴性对照siRNA,实施胶原凝胶内培养，每培养I日收集RNA，通过qRT-PCR确认了胶原IAl (COLlAl)⑶以及SMA (C)的mRNA表达。A显示导入阴性对照siRNA的情况下，附着状态以及游离状态中的ETFB的表达量；B显示导入阴性对照siRNA的情况下，附着状态以及游离状态中的COLlAl的表达量；C显示导入阴性对照siRNA的情况下，附着状态以及游离状态中的SMA的表达量。
[0062][图6]显示实施例1的ETFBsiRNA对胶原产生、SMA产生的影响的图。导入ETFB或阴性对照siRNA，在添加或不添加TGF-β (300ng/ml)的状态下实施胶原凝胶内培养，收集培养I日后的RNA，通过qRT-PCR确认了 COLlAl (A) ,SMA⑶以及ETFB (C)的mRNA表达。A显示TGF-β存在或不存在下、阴性对照siRNA或ETFB siRNA的导入引起的COLlAl的表达量的变化显示TGF-β存在或不存在下、阴性对照siRNA或ETFB siRNA的导入引起的SMA的表达量的变化；C显示TGF- β存在或不存在下、阴性对照siRNA或ETFB siRNA的导入引起的ETFB的表达量的变化。
[0063]发明的
[0064](ETFB)
[0065]作为本发明的主要素的ETFB也称为电子转移黄素蛋白β亚基，其具体碱基序列、氨基酸序列已经在基因银行等基因数据库中登录。例如，人型的ETFB在基因银行中登录为CAG33108.1。其经由以下程序被鉴定为成纤维细胞的增殖因子。
[0066]在成纤维细胞的增殖因子的鉴定中采用的、胶原凝胶中的张力负荷条件下的培养中，成纤维细胞发生细胞增殖、胶原表达上升等，在该增殖中细胞的形态、液性因子的表达近似纤维化的状态。另一方面，在没有张力负荷的情况下，观察不到这样的增殖现象。即，如果获得将成纤维细胞在胶原凝胶中、张力负荷下进行培养时，与在无张力负荷的条件下进行培养时的表达蛋白质或者表达RNA相比，仅在张力负荷的条件下表达或在张力负荷的条件下表达亢进的蛋白质、RNA，则其是成纤维细胞的增殖的因子、纤维化的因子的盖然性高。对于这样鉴定出的蛋白质或RNA，使用siRNA等进行敲低实验，其结果如果是抑制成纤维细胞的增殖或者纤维化，则可以说是成纤维细胞的增殖因子或者纤维化的因子。
[0067]因此，本发明中可以以RNA等基因作为靶标，也可以以蛋白质作为靶标。
[0068]在以蛋白质作为靶标的情况下，对于成纤维细胞的培养物和/或培养产物，可以进行基于例如DD法(差异显示法)的蛋白质组解析等。即，利用二维电泳进行展开、DD，对所得斑点用MALD1-T0F-MS进行鉴定。针对鉴定出的蛋白质实施功能抑制，确认病态是否改善或是否存在其可能性。然后，调查该成为靶标的蛋白质的立体结构，探求其活性中心，设计对该活性中心以高亲和性结合的化合物。蛋白质组解析中的基于DD、siRNA等的功能抑制技术、利用计算机进行的靶标蛋白结构解析以及基于生物学实验的活性中心研究是常规技术。
[0069]作为用于这样的解析的成纤维细胞，只要是树立的细胞均可无限制地使用，因最终实施方式是人的成纤维细胞，故可以使用人的成纤维细胞。作为人的成纤维细胞，优选可以示例出(XD-1113Sk细胞(ATCC N0.CRL2439、人皮肤真皮正常成纤维细胞、39岁黑人女性来源)、CXD-1109Sk (ATCC N0.CRL2361、人皮肤真皮正常成纤维细胞、白人21岁男性来源)、或CXD-1032Sk(ATCC N0.CRL2439、人皮肤真皮正常成纤维细胞、白人新生儿来源)等，这些可以通过从ATCC等有偿分让来加以利用。它们的培养可以使用加FBS的DMEM培养基、RPMI培养基等来进行培养。
[0070] 此外，通过这样利用蛋白质组解析来对蛋白质进行鉴定，利用基因银行等的基因信息，能够推定对应的基因的碱基序列。由此，能够利用PCR扩增出对应的c-DNA、RNA。进一步，还能够制作siRNA、进行敲除实验。通过敲除实验，能够验证该靶标蛋白质实际上是否对成纤维细胞的增殖、纤维化做出贡献。
[0071](成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法)
[0072]经过这样的过程，本发明人发现在成纤维细胞的胶原凝胶中的张力负荷培养、具体是在细胞附着于培养器的壁面或底面的状态下进行培养的条件下，特异性地产生ETFB。即，在成纤维细胞的胶原凝胶中的培养中，以ETFB的产生量作为指标，能够鉴别是否促进纤维化等成纤维细胞的异常增殖。
[0073]即，本发明的一个实施方式是:在成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法中，以ETFB (电子转移黄素蛋白β亚基)的表达的程度作为指标的增殖状态的鉴别方法，该成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法中，
[0074]在ETFB的表达的程度高的情况下，判定为发生成纤维细胞的异常增殖的盖然性闻，
[0075]在ETFB的表达的程度低的情况下，判定为成纤维细胞的增殖保持正常的盖然性闻。
[0076]这里，“以ETFB的表达的程度作为指标”也可以说成“测定ETFB的表达的程度作为标志”。
[0077]“发生成纤维细胞的异常增殖的盖然性高”也可以说成“发生成纤维细胞的异常增殖的风险高”。“成纤维细胞的增殖保持正常的盖然性高”也可以说成“发生成纤维细胞的异常增殖的风险低”。“成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法”也可以说成是“成纤维细胞的异常增殖的风险的预测方法”。
[0078]ETFB的表达的程度高的情况可以是指，被检试样的成纤维细胞中的表达量相对于对照的成纤维细胞中的表达量高的情况，
[0079]ETFB的表达的程度低的情况可以是指，被检试样的成纤维细胞中的表达量相对于对照的成纤维细胞中的表达量相同或低的情况。
[0080]对于ETFB的表达的程度高的情况没有限制，可以是例如，在被检试样的成纤维细胞中表达，但在对照的成纤维细胞中不表达；或者，在被检试样的成纤维细胞中的表达量相对于对照的成纤维细胞中的表达量为150%以上、300%以上、500%以上；
[0081]对于ETFB的表达的程度低的情况没有限制，可以是例如，在被检试样的成纤维细胞中的表达量相对于对照的成纤维细胞中的表达量为相同或70%以下、50%以下、10%以下。
[0082]被检试样的成纤维细胞是有对成纤维细胞的增殖状态进行鉴别的必要的对象的细胞，对其没有特殊限制，可以是人、猪、猴、大猩猩、犬、牛、兔、大鼠、小鼠等哺乳动物等来源的细胞。
[0083]对照的成纤维细胞可以是对象的正常成纤维细胞或与对象同一或类似的生物种的正常成纤维细胞或树立的正常成纤维细胞。作为树立的正常成纤维细胞，可以使用与上述一样的树立的细胞。[0084]ETFB的表达的程度如后述，可以测定ETFB蛋白质的表达，也可以测定编码ETFB的RNA等基因的表达。对于成纤维细胞中的ETFB蛋白质或编码ETFB的基因的测定方法没有特殊限制，例如可以这样来进行，按照常规方法破碎细胞，得到包含ETFB蛋白质或编码ETFB的基因的细胞提取液，采用如后述的通常的测定方法测定细胞提取液中所含的ETFB蛋白质或编码ETFB的基因。
[0085]在本发明中，“成纤维细胞的异常增殖”可以是指成纤维细胞的异常增殖引起的疾病状态。对于成纤维细胞的异常增殖引起的疾病状态没有特殊限制，可以是例如纤维化(具体有增生性疤痕、瘢痕瘤、硬皮病、粉刺疤痕、肺纤维症、肝纤维症等)、成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化引起的纤维化等。
[0086]本发明的其他方面提供一种脏器中的纤维化的鉴别方法，该脏器中的纤维化的鉴别方法以被怀疑纤维化的脏器的成纤维细胞中的、ETFB的表达的程度作为指标，其中，在ETFB的表达的程度高的情况下，判定为在该脏器中发生纤维化的盖然性高，在未确认到ETFB的亢进的情况下，判定为发生纤维化的盖然性低。
[0087]这里，“在脏器中发生纤维化的盖然性高”也可以说成“在脏器中发生纤维化风险高”。“发生纤维化的盖然性低”也可以说成“发生纤维化的风险低”。“脏器中的纤维化的鉴别方法”也可 以说成“脏器中的纤维化的风险的预测方法”。
[0088]ETFB的表达的程度高的情况可以是指，被检试样在脏器中的表达量相对于对照中的表达量高的情况，
[0089]未确认到ETFB的亢进的的情况可以是指，被检试样在脏器中的表达量相对于对照中的表达量相同或低的情况。
[0090]对于ETFB的表达的程度高的情况没有限制，可以是例如，在被检试样的脏器中表达，而在对照中不表达；或者，在被检试样在脏器中的表达量相对于对照中的表达量为150%以上、300%以上、500%以上；
[0091]对于ETFB的表达的程度低的情况没有限制，可以是例如，在被检试样在脏器中的表达量相对于对照中的表达量为相同或70%以下、50%以下、10%以下。
[0092]被检试样的脏器是有对脏器中的纤维化进行鉴别的必要的对象的脏器，对其没有特殊限制，可以是人、猪、猴、大猩猩、犬、牛、兔、大鼠、小鼠等哺乳动物等来源的脏器。而且，从对象的脏器得到的培养细胞、培养组织、血液等可以用作被检试样。
[0093]对照可以是对象的同一或其他脏器的正常部分或与对象同一或类似的生物种的脏器或细胞或者树立的正常细胞。作为树立的正常细胞，可以使用与上述一样的树立的细胞。
[0094]对于作为本发明的脏器中的纤维化的鉴别方法的对象“脏器”没有特殊限制，可以是例如皮肤、肺或者肝脏等内脏等。
[0095]ETFB的表达的程度如后述，可以测定ETFB蛋白质的表达，也可以测定编码ETFB的RNA等基因的表达。对于脏器的成纤维细胞中的ETFB蛋白质或编码ETFB的基因的测定方法没有特殊限制，例如可以这样来进行，按照常规方法破碎细胞，得到包含ETFB蛋白质或编码ETFB的基因的细胞提取液，采用如后述的通常的测定方法测定细胞提取液中所含的ETFB蛋白质或编码ETFB的基因。
[0096](异常增殖抑制剂的鉴别方法)[0097]如果采用本发明的成纤维细胞的增殖状态的鉴别方法，则可以通过在存在被检物质的条件下ETFB的产生量是提高还是受到抑制，来鉴别该被检物质是异常生长促进剂还是异常增殖抑制剂。
[0098]这里，异常增殖可以是指成纤维细胞的异常增殖引起的疾病状态。对于成纤维细胞的异常增殖引起的疾病状态没有特殊限制，可以是例如纤维化(具体有增生性疤痕、瘢痕瘤、硬皮病、粉刺疤痕、肺纤维症、肝纤维症等)、成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化引起的纤维化等。
[0099]本发明的一个方面提供一种纤维化抑制剂的鉴别方法，其中，将成纤维细胞在张力存在下的胶原凝胶中、在存在或不存在被检物质的条件下进行培养，
[0100]在与不存在被检物质的条件下进行培养时相比，存在被检物质的条件下进行培养时ETFB的表达量低的情况下，将该被检物质作为纤维化抑制剂。
[0101]对于与不存在被检物质的条件下进行培养时相比，存在被检物质的条件下进行培养时ETFB的表达量低的情况没有限制，可以是例如，存在被检物质的条件下不表达，或者存在被检物质的条件下的ETFB的表达量为不存在的条件下的ETFB的表达量的70%以下、50%以下、10%以下。
[0102]胶原凝胶中的存在或不存在被检物质的条件下的培养，可以是阴性对照的细胞的增殖良好、存在或不存在被检物质的条件下的细胞的增殖差异明确的培养条件，对其没有限制，可以通过例如，在胶原浓度0.05~0.5?七％凝胶中、30~40°C、培养12~72小时来进行。
[0103]“纤维化抑制剂的鉴别方法”也可以说成“纤维化抑制剂的筛选法”。
[0104]作为被检物质，可以是天然物或合成品，可以是通常可作为医药等的候选物质的那些，具体可以列举出植物和微生物来源的提取物及其纯化品、小分子合成化合物、抗体、肽、适体、siRNA、可用于基因治疗的核酸、其修饰体、衍生物等。
[0105]在这样的鉴别中，ETFB可以以蛋白质的形式来定量，也可以以编码ETFB的RNA等基因的形式来定量。作为蛋白质或基因的定量方法，可以使用常规方法。可以采用例如，凝胶电泳法、Western印迹法、ELISA法等免疫测定法、免疫组织化学分析法、Northern印迹法、PCR法等来进行测定。RNA等基因的定量中可以采用基于PCR的扩增法，因而特别优选。
[0106]在将ETFB以蛋白质的形式来定量的情况下，可以使用可对凝胶中的蛋白质进行染色的试剂、特异性识别ETFB的抗体。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体中的任一种。这些抗体可以采用公知的方法生产。抗体视需要，可以用荧光色素、放射性同位元素、酶等进行标记。
[0107]在将ETFB以基因的形式进行定量的情况下，可以使用由能够与ETFB的mRNA特异性杂交的核酸引物以及能够与以所述mRNA作为模板合成的cDNA特异性杂交的核酸引物组成的I对核酸引物。引物可以基于作为测定的对象的基因的序列信息来设计。
[0108]作为用于PCR反应的引物，可以使用例如，序列表的SEQ ID N0:1或者序列表的SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸。包含该序列作为部分序列、且能够扩增编码ETFB的碱基序列的、显示同样效果的寡核苷酸也属于本发明的技术范围。作为该寡核苷酸的长度没有限制，可以是例如，10~50个碱基、15~30个碱基左右。
[0109](异常增殖抑制剂)[0110]如此这般，对被检物质进行评价，对于确认了 ETFB表达的抑制作用的那些，可以判定为成纤维细胞异常增殖抑制剂。该成纤维细胞异常增殖抑制剂通过将该抑制剂作为有效成分加工成皮肤外用剂、医药组合物，可以作为疤痕、特别是增生性疤痕等的成纤维细胞异常增殖引起的疾病的预防或治疗用医药。作为预防药，例如，优选可以列举出在疤痕特别是增生性疤痕等发生的盖然性高的部位、例如手术中的切除位置的周围等、在增生性疤痕发生前预先施用，来防止增生性疤痕的生成，或者预先施用来使已发生的增生性疤痕不恶化；在治疗方面，优选可以示例出这样的应用:施用于业已生成的增生性疤痕等疤痕，来缩小该疤痕。该医药的制剂化可以通过加入所述纤维芽异常增殖抑制剂和用于制剂化的任意成分、例如赋形剂、崩解剂、结合剂、着色剂、矫味剂、除臭剂、分散剂、表面活性剂等，按照常规方法来进行处理，加工成医药制剂。作为医药制剂，可以加工成内服药、外用剂、注射剂等剂型，特别优选加工成外用剂。
[0111]此外，对于皮肤片等从生物体采集的样品，通过利用PCR等确认该样品中ETFB怎样程度地表达，可以知道该样品周围的疤痕化倾向。
[0112]以下，列举实施例进行更详细的说明。
[0113]实施例1
[0114](细胞培养)
[0115]就人皮肤正常成纤维细胞的种类而言，有许多可以从ATCC获得的细胞，但优先使用了与作为瘢痕瘤细 胞株的(KELFIB)的概貌(profile)最为接近的(XD_1113Sk细胞(39岁黑人女性来源)。
[0116]将成纤维细胞用添加了 10% FBS的DMEM(D-6046、Sigma)的培养基在组织培养烧瓶(353024、BD FALCON))中于设定为37°C、CO2浓度5%的环境下的孵育器(M14-3158、Forma Scientific、SANYO)中进行培养。传代时，用PBS洗涤细胞后，添加0.05%胰蛋白酶溶液(T4049、Sigma)，于孵育器中温育2~3分钟,然后回收细胞,进行传代来使用。传代每隔3~4日实施，该情况下，使用传代数至7~12为止的那些。
[0117](胶原凝胶中的细胞培养)
[0118]胶原凝胶中的培养按Varedi等的方法的改进方法进行。即，从粉末培养基制作通常的5倍浓缩的DMEM(5xDMEM、D5523、Sigma)，按以下所示的混合比制作了胶原溶液，使得最终成为与DMEM培养基同样的组成。制作的胶原溶液在恒温槽中于12°C保存至使用。用胶原原液的必要量(lmg/mL 时为 7mL)、5xDMEM7mL、200mM HEPES3.5mL、0.03% NaH2C033.5mL、0.01% NaOHl.5mL、FBS必要量(10%时为3.5mL)、H2O使得总量为31.5mL。在制作基底层(Basal layer)的情况下，预先在24孔或6孔组织培养平板(24孔；353047、6孔;353046、BD FALCON)上添加胶原溶液(24孔时为250 μ L、6孔时为ImL)，于孵育器中静置15分钟以上使胶原凝固。
[0119]制作IxlO6细胞/mL的细胞悬浮液，将其与12°C保存的胶原溶液以胶原溶液:细胞悬浮液=9:1的混合比进行混合，充分搅拌后，迅速接种于平板，移动至孵育器。接种量为24孔平板lmL、6孔平板4mL (均为IxlO5细胞/mL)。在制作悬浮凝胶的情况下，于孵育器中培养2小时后，用药勺从孔的边缘剥离凝胶，使之游离，继续进行培养。
[0120](细胞计数)
[0121]在经过各实验确定的培养时间后，将胶原凝胶用药勺从平板剥离，并添加至使用DMEM制备的最终浓度310U/mL的胶原酶溶液中，于37°C振荡20~40分钟，消化胶原。消化的细胞悬浮液以1500rpm离心3~5分钟进行分离，回收细胞。对于回收的细胞,添加100 μ L的培养基，实施台盼蓝染色后，使用Burkel-Turk血球计数板以1/5的稀释率对活细胞数进行计数。
[0122](TUNEL 染色)
[0123]消化胶原凝胶的胶原，回收细胞后，加入ImL的DMEM培养基和细胞固定液(Collection Fluid、6768315、Thermo Shandon)，颠倒混合。将该细胞悬浮液用Cytospin (Thermo scientific)进行离心,将其附着于载玻片，制作了标本。对于所制作的标本，使用 in situ Apoptosis Detection Kit (MK500, Takara)按照操作说明书实施了TUNEL染色。镜检使用荧光显微镜(ECLIPSE E600,Nikon)以100~400倍的倍率来进行，观察附着条件下和游离条件下的阳性细胞出现。
[0124](二维电泳) [0125]附着状态和游离状态培养的胶原凝胶平板分别制作8~10张，培养后I日像前述方法那样消化胶原。但为了尽可能抑制胶原酶引起的非特异性的蛋白质分解，在 ImM 的盐酸苯甲脉水合物(Benzamidinehydrochrolide Hydrate) (B6506、Sigma)和0.1mM的N- α -对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸(N- a -p-Tosy 1-L-LysineChloromethylketone Hydrochloride) (TLCK、T7254、Sigma)存在下实施。
[0126]对消化后的细胞进行离心分离，回收于Eppendorf管中，用PBS洗涤2次。在此期间的作业尽可能在冰冷下实施。此时的细胞湿重为100~200mg。膜级分的提取使用ProteoPrep Membrane Extraction Kit (Sigma)按操作说明书进行。而且，融化细胞时，按操作说明书添加蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail、P2714、Sigma)和憐酸酶抑制剂(Phosphatase inhibitor cocktail I&I1、P2850&P5726、Sigma)。提取的蛋白质用Coomassie Protein Assay Reagent Kit (2320、PIERCE)按操作说明书对蛋白质量进行测定，保存于低温冰箱中直至使用。I次提取的提取率(从细胞的湿重得到的膜蛋白质的量)为约1/300。
[0127]二维电泳使用Pharmacia公司的二维电泳装置来实施。等电点电泳使用18cm的凝胶(Immobile Dry Strip、Amersham),研究了 pi 范围:3 ~IONL (non-linear)、5.5 ~6.7 和6~9。蛋白质的上样量为100~300 μ g。等电点电泳按照操作说明书采用Cup loading法进行展开。电泳装置使用Ettan IPGphor IEF System(Amersham),展开条件是如下所示的条件。
[0128]50 μ A/Strip、20°C
[0129]SI:Gradient500Vlmin.[0130]S2:Gradient4000V4h
[0131]S3:Step-n-hold8000V10h
[0132]S4:Step-n-hold6000V 至回收
[0133]等电点电泳后，用Multiphor II electrophoresis unit (18-1018_06、Amersham)和 Electrophoresis Power supply (19-3500-01、Amersham)实施了 SDS-PAGE。凝胶使用预制凝胶(Excel-Gel SDS、80-1255_53、Amersham、245X 110mm、0.5mm 厚、Gradient8_18% )，电泳条件为 S1:600V、400mA、13W、30min ；S2:600V、400mA、30W、16h。对于展开后的凝胶，应用自动染色装置(Hoefer Processor Plus、Amersham)用 Silver stain MSkit (299-58901、和光纯药)按操作说明书实施了银染色，实施染色使得各凝胶的染色条件等同。而且，显影时间为6分钟。重复以上的操作，对附着状态和游离状态，每pi范围分别制作了 5张凝胶。在8.7%甘油液中于4°C保存直至MALD1-TOF-MS解析。
[0134](差异显示解析)
[0135] 对于染色结束后的凝胶，使用扫描仪(ImageScanner III>28-9076-07>Amersham)扫描录入计算机。对于录入的图像，使用图像解析软件(2D Master Elite Ver.4.01>2DMaster Database Ver.4.00、Amersham)按照以下的顺序实施解析。DD中的整体流程如下所示。
[0136](I)利用计算机进行斑点的自动检测，通过目测确认对重复斑点进行修正
[0137](2)在未作为斑点检测到的凝胶的背景和染色的斑点整体的染色强度的凝胶间进行标准化
[0138](3)对凝胶间因迁移率而被识别为共通存在的斑点进行编号(匹配，这里检测的编号称为Match N0.)，以及相同样品的电泳图像是否真正等同的统计处理(本处理中判断为等同的凝胶用于DD)。
[0139](4)通过t检验进行DD (剔除率10% )
[0140]此外，同时通过目测实施DD，判断计算机处理计算出的斑点是否真正存在染色强度差异；以及，实施在计算机处理中未判定为显著、但目测中强度不同的斑点的追加。
[0141]〈1>斑点检测
[0142]用ImageScanner III对读取的图像进行修整,使之大小等同。用2DMaster Elite按以下参数实施自动斑点检测。
[0143]Peak Dilation Parameters:
[0144]Min.Peak Area85
[0145]Max.Peak AreallOO
[0146]Min.Aspect Ratio0.4
[0147]Max.Aspect Ratio4.5
[0148]Min.Area Ratio50
[0149]<2>背景除去和斑点强度标准化
[0150]按照操作说明书实施2D Master Elite中加载的背景除去设定和扫描到的凝胶染色浓度的标准化的作业。
[0151]Max.Number of Touching Peaks20
[0152]Background Intensity。
[0153]Step Sizel
[0154]Smoothing Sizel
[0155]Histogram Equalization 无
[0156]Tidy Edges 有
[0157]然后，目测确认斑点，实施了重复识别的斑点的修正。
[0158]<3>斑点匹配和凝胶等同性判断
[0159]将斑点像良好且斑点数多的游离状态的凝胶像设定为Reference gel，按照操作说明书实施了斑点的匹配。此外，使用2D Master Database中加载的Test Hypothesis功能，实施与Reference gel的Dunnett检验,对于5张凝胶中有3张以上确认为等同的组实施了〈4>的作业。
[0160]<4>附着状态和游离状态的培养细胞的DD
[0161]使用2D Master Database对匹配的斑点实施剔除率10%的t检验,提取了斑点强度上有差异的。然后，对算出的斑点进行目测确认，确认了目测中是否也存在差异。此外，同时对斑点整体进行目测再确认，追加计算机处理中未检测到的、附着状态-游离状态下浓度有差异的斑点。
[0162]对于采用前述手段确认了表达量存在差异的斑点，利用MALD1-T0F-MS实施了推定。对于通过解析判断为等同的3~4张凝胶，切下表达量多的组的斑点。由于预想蛋白量少，因而将这些凝胶片段汇总作为一个样品用于试验。斑点的脱银和胰蛋白酶消化使用96孔的胰蛋白酶消化装置和试剂盒(Montage In-GelDigest Kit、Millipore)按照操作说明书来实施。将实施了胰蛋白酶消化的蛋白质与基质一起在锚芯片(74115、Bruker Daltonics)上(CHCAmatrix ; 10mg/mLa-CHCA in acetone-Ethanoll:lv/v)点样 1 μ L,干燥后用 MALD1-TOF-MS (AutoFlex I1、Bruker Daltonics)实施 Peptide MassFingerprinting(PMF)解析。PMF解析是根据从基质飞出的肽片段的质量模式推定蛋白质的方法。对于含有足够量的蛋白质的斑点，实施了类似MS/MS解析、能够解析氨基酸序列的Post Source Decay (PSD)解析，进行了鉴定。将解析结果用于数据库检索并得到了结果，其中，该数据库使用MASCOT (Ver.1.9、Matrix science), PMF解析中得到的结果中将在基于MOffSE算法的得分分布中概率95%以上、在MASCOT上计算出的分子量和等电点等同的确定为该蛋白。PSD解析中，根据其氨基酸序列使用该数据库对候选物进行检索，将分子量和等电点等同的作为该蛋白质。在本实验条件下，使用BSA的PMF解析中的检测下限为5fmol。
[0163]对于总计31个斑点进行了确定。MALD1-TOF-MS中确定的蛋白的列表如表1和2。在31个斑点中，确定的蛋白为18个(中性区域8个、碱基性区域10个)。其中，在附着状态下表达量高的蛋白有8个，在游离状态下表达量高的蛋白有9个，被认为是斑点移动的蛋白有I个。此外，定位于膜的蛋白为9，定位于核的为2，定位于细胞质的为3，分泌蛋白为1，不明的为3。虽未得到外膜的蛋白，但在某种程度上得到了细胞内的膜蛋白，总蛋白大量获得的伴侣蛋白有2种，可以认为级分化是有效果的。在附着状态下表达量高的8种蛋白中定位于线粒体膜的有3种，存在于核的有2种，定位于膜的有I种，定位不明的有2种。此外，所得蛋白中，就涉及创伤治愈和疤痕形成的报告而言，存在下述报告:柠檬酸合酶(Citratesynthase)在创伤形成后10日内表达量提高,半乳糖凝集素_3 (Galectin_3)的敲除小鼠中确认角膜创伤后的再上皮化延迟，ETFB在对成纤维细胞照射低输出的红色光时表达上升；其他不明。