专利名称：一种和厚朴酚亚微乳注射剂及其生产方法和厚朴酚(honokiol)是一种带有烯丙基的联苯二酚类化合物，是从木兰科植物厚朴中分离出来的主要活性成分。传统中医认为厚朴具有消除胸腹满闷、止痛、健胃、下气降逆、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用，因而被广泛使用(刘可云，董志，朱毅.厚朴酚与和厚朴酚的药理学研究现状.中成药，2006 (28)5:716)。近年来随着现代医药学的发展，陆续发现和厚朴酚的多种药理作用，包括抗炎，抗菌，抗心律失常，抗癫痫，抗血栓形成，抗氧化， 抗肿瘤，抗吗啡戒断反应，抗抑郁，抑制肌肉收缩等(王立青，江荣高，陈惠芳.厚朴酚与和厚朴酚药理作用的研究进展，中草药，2005，36 (10):1591)。其中，和厚朴酚在抗肿瘤方面的研究得到越来越多的关注，目前国内外均有许多针对和厚朴酚抗肿瘤作用进行的研究，结果令人鼓舞。和厚朴酚的抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应等特点，并且毒副作用低，它不仅对常见的肿瘤细胞有明显的细胞毒作用，对于一些抗药的肿瘤细胞(如多发性骨髓瘤细胞)也表现出了一定的治疗效果。其抗肿瘤作用和机制主要体现在以下几个方面(1) 细胞毒作用研究发现和厚朴酚对人的纤维母细胞和淋巴细胞没有明显的细胞毒作用，对这两种细胞的安全剂量可以达到40μ g/ml，远远高于对其他肿瘤细胞的安全剂量(Fei C, Tao W, Yi-Feng W, et al. Honokiol A potent chemotherapy candidate for human colorectal carcinoma [J]· World J Gastroenterol, 2004, 10 (23): 3459-3463·)。 另外，研究表明和厚朴酚对人肺癌细胞CH27、H460和H1299进行治疗时也显示出了剂量和 Wfe]itM^iMIfi^^lS (Shu-Er Y, Ming-Tsuen H, Tung-HuT, et al. Down-modulation of Bcl-XL, release of cytochrome c and sequential activation of caspases during honokiol - induced apoptosis in human squamous lung cancer CH27 cells [J]. Biochem Pharm，2002,63: 1641-1651.)。(2)抑制肿瘤血管生成和厚朴酚是一种小分子量的天然产物，它在体内和体外均被发现可以抑制新生血管，抑制肿瘤生长，并且在有效剂量范围内能够被宿主很好的耐受(Xianhe B, Francesca C, Masuko U, et al. Honokiol, a Small Molecular Weight Natural Product, Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo [J], J of Biol Chem, 2003, 278 (37): 35501-35507·)。(3)诱导肿瘤细胞的凋亡科研工作者进行了大量的研究，发现和厚朴酚在许多细胞中都具有诱导凋亡的作用。一项用人的结肠癌细胞系RKO进行的研究显示和厚朴酚能够诱导RKO细胞的凋亡，并在种植RKO的裸鼠上观察到了肿瘤生长的抑制和生存期的延长(Fei Chen, Tao Wang, Yi - Feng Wuj Ying Guj Xiao-Li Xu. Shu Zheng, Xun Hu. Honokiol: A potent che- motherapy cardidate for human colorectal carcinoma [J]. World J Gastroenterol，2004，10(23) :3459-3463.)。在人多发性骨髓瘤中，和厚朴酚激活了caspase-3, _7、_8、_9，并且促使凋亡诱导因子(AIF)从线粒体释放到胞浆中，从而和厚朴酚诱导了 caspase依赖和非依赖性途径的凋亡(Kenji I，Teru H, Makoto H, et al. Honokiol overcomes conventional drug resistance in human multiple myeloma by induction of caspase-dependent and independent apoptosis [M]. Blood First Edition Paper, 2005，106 (5) : 1794-1800. )。(4)抑制肿瘤细胞的增殖和厚朴酚对人前列腺癌细胞(PC23、LNCaP)的研究发现，和厚朴酚可降低成视网膜母细胞瘤蛋白Rb及其磷酸化水平，降低细胞周期蛋白(⑶1、⑶E)、周期素依赖性蛋白激酶(Cdk4，Cdk6)的表达水平，使肿瘤GcZG1期细胞周期停滞，抑制肿瘤细胞增殖，且呈剂量、时间依从性(Eim-R yeong H, Shivendra VS. Honokiol causes G0-G1 phase cell cycle arrest in human prostate cancer cells in association with suppression of retinoblastoma protein level/phosphorylation and inhibition of E2F1 transcriptional activity[J]. Mol Cancer Ther, 2007, 6 (10) : 2686-2695. )。(5)抑制肿瘤细胞转移和厚朴酚通过抑制人纤维肉瘤细胞HT-1080中的基质金属蛋白酶-9的活性而抑制肿瘤迁移(Nagase H, Ikeda K, Sakai Y. Inhibitory effect of magnolol and honokiol from Magnolia obovata on human fibrosarcoma HT-1080. Invasiveness in vitro[J]. Planta Med,2001, 67(8):705-708.)。但和厚朴酚的水溶性较差，很难制成普通水溶性注射剂，这极大地限制了其临床应用。目前已申请并公开的和厚朴酚制剂专利，如“和厚朴酚、厚朴酚或其混合物的制剂及其在制备治疗心脑血管疾病药物中的用途，申请号200310121303. 0”，此制剂中加入了增溶剂如吐温80、CremOphOr EL、PEG200_400、丙二醇等，具有潜在的溶血作用；“和厚朴酚脂质体冻干粉制剂及其在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，申请号200610021277. 8”，此制剂在制备过程中先要溶解于三氯甲烷和甲醇中，有机溶媒的使用具有潜在的毒副作用，而且制备工艺较为复杂，最终产品质量难以控制。目前尚无和厚朴酚亚微乳制剂的文献公开。亚微乳注射剂是目前医药领域中发展较快的剂型之一，亚微乳是以植物油或动物油为主要成分，加乳化剂、助乳化剂与注射用水，通过高压乳勻机分散，经高压灭菌，可供静脉注射，其中的植物油可经机体代谢而被完全利用。作为静脉给药载体，脂肪亚微乳可保护被包封药物，而且具有载药量大、能提高药物稳定性、延长药物作用时间、降低毒副作用、使药物具有缓控释和靶向等作用。另外，亚微乳制备工艺简单、质量可控，适合工业化生产，因此亚微乳注射剂具有很好的应用前景。亚微乳作为药物载体，在给药的同时，还能给病人补充营养和提供能量，这对营养缺乏的重症病人具有重要意义。
针对上述问题，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的在于研制和向临床提供一种安全性高，疗效显著，毒副作用小，稳定性强，制备工艺简单并且适合工业化生产的一种和厚朴酚亚微乳注射剂及其生产方法，可有效解决抗肿瘤药物的生产及临床需要问题。本发明的目的是通过以下技术方案实现的以注射用油、乳化剂和助乳化剂为主要辅料，通过机械分散的方法，将和厚朴酚制备成亚微乳注射剂，并加入稳定剂、抗氧剂、等渗调节剂等加以调节实现的，具体是以和厚朴酚为主药，以注射用植物油、乳化剂及助乳化剂为辅料，与水配制成亚微乳注射剂，各组分的重量百分比为和厚朴酚0.019Γ3. 0%，注射用植物油0. 19Γ30%，乳化剂 0. 01% 6. 0%，助乳化剂0. 001 3%，抗氧剂0. ΟΟΓΟ. 3%，等渗调节剂0. 001% 10%，ρΗ调节剂 0. 000001-2%，余量为水；所说的注射用植物油为大豆油、玉米油、葵花籽油、橄榄油、茶油中的一种或两种以上的混合物；所说的乳化剂为大豆卵磷脂、吐温80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中的一种或两种以上的混合物；所说的助乳化剂为泊洛沙姆188/407中的一种或两种的混合物； 所说的抗氧剂为维生素E ；所说的等渗调节剂为甘油、氯化钠、葡萄糖的一种或两种的混合物； 所说的PH调节剂是氢氧化钠或盐酸中的一种或两种的混合物； 本发明厚朴酚亚微乳注射剂由以下步骤实现1)制备水相按照权利要求1的组分量，将助乳化剂、等渗调节剂加入注射用水中，在 4(T80°C条件下，搅拌均勻，形成水相，或将乳化剂、助乳化剂、等渗调节剂加入注射用水中， 在4(T80°C条件下，搅拌均勻，形成水相；
2)制备油相按照权利要求1的组分量，如水相中不含有乳化剂，则将和厚朴酚、乳化剂、抗氧剂加入注射用植物油中，在4(T80°C条件下，搅拌均勻，形成油相，如水相中含有乳化剂，则将和厚朴酚、稳定剂、抗氧剂加入注射用植物油中，在4(T8(TC条件下，搅拌均勻，形成油相；
3)制备初乳在温度为4(T8(TC并不断搅拌下，将水相缓缓注入到油相，在勻质速度 650(T24000rpm下均质2 15min，用ρΗ调节剂调节ρΗ值4 9，得初乳；
4)制备终乳将初乳过高压均质机或微射流仪，在2.0X104kPa 1.2X105 kPa (3^18kpsi)的压力下反复勻质3 20次，得和厚朴酚亚微乳；
5)将和厚朴酚亚微乳分装于安瓿瓶中，充氮气，熔封，在115-121°C灭菌15-30min，或 0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得和厚朴酚亚微乳注射剂。本发明和厚朴酚亚微乳注射剂组成科学、制备工艺简单，质量稳定可控，成本低廉，适合工业化生产；本发明提供的制剂载药量及包封率高，可长期稳定储存，有利于和厚朴酚更好地发挥药效，降低毒副作用，是药物上的一大创新。

作详细说明。本发明在实施中，可由以下实施例给出，但本发明的保护范围不局限于此。其中实施例中所涉及的部分原料和厚朴酚(含量98. 31%，西安融升生物科技有限公司);注射用大豆卵磷脂S75(德国LIPOID公司);注射用蛋黄卵磷脂E80((德国LIPOID 公司);泊洛沙姆 188 (Lutrol F68，BASF，德国)；泊洛沙姆 407 (Lutrol F127，BASF，德国)； 聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor ELP，德国BASF)；吐温80 (北京市海淀会友精细化工厂)； 注射用大豆油(江西金海棠药用有限公司);注射用茶油(江西金海棠药用有限公司);其它试剂均为分析纯或色谱纯。
仪器超级恒温器(上海市实验仪器厂);IKA T25 basic高速分散均质机(德国IKA 公司);m-110L型高压微射流(美国Microfluidics公司);Nano4S90激光粒度分析仪(英国马尔文公司);Angilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦);WD-A药物稳定性检查仪(天津药典标准仪器厂)。实施例1
称取和厚朴酚500mg，大豆油10g，维生素E 0. Olg,搅拌溶解得到油相；称取大豆卵磷脂2g，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，60°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质8min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环10次，最后分装、充氮气、熔封， 121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例2
称取和厚朴酚600mg，大豆油5g，大豆卵磷脂1. 5g，维生素E 0. Ig,搅拌溶解得到油相； 称取泊洛沙姆188 0. 8g，甘油2. 25g，加入注射用水余量至100ml，搅拌溶解得到水相。70°C 下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质5min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节 PH值为7. (Γ8.0。然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环10次。最后分装、充氮气、 熔封，115°C灭菌30min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例3
称取和厚朴酚600mg，玉米油10g，大豆卵磷脂2g，维生素E 0. Olg，搅拌溶解得到油相； 称取大豆卵磷脂2g，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，60°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质8min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节PH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环10次，过0. 22Mm的微孔滤膜，分装、充氮气、熔封，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例4
称取和厚朴酚800mg，葵花籽油10g，维生素E 0. 02g,搅拌溶解得到油相；称取大豆卵磷脂2g，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 25g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，70°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质5min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH 值为7. (Γ8.0，然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环10次，最后分装、充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例5
称取和厚朴酚400mg，橄榄油8g，油酸0. Ig,维生素E 0. Olg,搅拌溶解得到油相；称取 Cremophor EL lg，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，50°C下将水相和油相混合，在勻质速度17500rpm下勻质6min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节PH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过高压乳勻机，在ISkpsi压力下循环8次，最后分装、 充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例6
称取和厚朴酚1200mg，大豆油llg，维生素E 0. 01g，搅拌溶解得到油相；称取大豆卵磷脂2g，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，60°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质8min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值为 7. (Γ8. 0，然后将初乳过微射流仪，在12kpsi下初步循环5次，然后在ISkpsi压力下循环10次，最后分装、充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例7
称取和厚朴酚400mg，茶油10g，维生素E 0. Olg，搅拌溶解得到油相；称取大豆卵磷脂 lg，泊洛沙姆188 1. 5g，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，40°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质lOmin，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环12次，最后分装、充氮气、熔封， 115°C灭菌30min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例8
称取和厚朴酚600mg,玉米油IOg,油酸0. Ig,维生素E 0. Olg,搅拌溶解得到油相；称取吐温-80 Ig,泊洛沙姆188 1. 5g，葡萄糖5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相， 60°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质5min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节PH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过高压乳勻机，在ISkpsi压力下循环15次，最后分装、充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例9
称取和厚朴酚400mg，葵花籽油llg，维生素E O.Olg，搅拌溶解得到油相；称取吐温-80 lg，泊洛沙姆407 2g，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，70°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质5min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环12次，最后分装、充氮气、熔封， 121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例10
称取和厚朴酚600mg，玉米油llg，维生素E O.Olg,搅拌溶解得到油相；称取 Cremophor ELP lg，大豆卵磷脂lg，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，60°C下将水相和油相混合，在勻质速度17500rpm下勻质6min，用0. Imol/ L氢氧化钠溶液调节pH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过微射流仪，在ISkpsi压力下循环10次， 最后分装、充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例11
称取和厚朴酚400mg，橄榄油8g，油酸0. Ig,维生素E 0. Olg,搅拌溶解得到油相；称取 Cremophor EL lg，泊洛沙姆188 lg，甘油2. 5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相，50°C下将水相和油相混合，在勻质速度17500rpm下勻质6min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节PH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过高压乳勻机，在ISkpsi压力下循环8次，最后分装、 充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。实施例12
称取和厚朴酚600mg,玉米油IOg,油酸0. Ig,维生素E 0. Olg,搅拌溶解得到油相；称取吐温-80 Ig,泊洛沙姆188 1. 5g，葡萄糖5g，加入注射用水至100ml，搅拌溶解得到水相， 60°C下将水相和油相混合，在勻质速度21500rpm下勻质5min，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节PH值为7. (Γ8. 0，然后将初乳过高压乳勻机，在ISkpsi压力下循环15次，最后分装、充氮气、熔封，121°C灭菌15min，即得和厚朴酚亚微乳注射剂。本发明经检测和试验，取得了满意的效果，有关资料如下 制剂表征方法及结果(一)表征方法 1.粒径及kta电位
精密量取ΙΟΟμΙ亚微乳制剂，用超纯水稀释100倍，采用NanojS90型激光纳米粒度分析仪测定乳滴粒径、粒径的多分散系数(PDI)和^ta电位。2.载药量测定
采用HPLC法测定制剂中的药物含量精密量取50μ1亚微乳制剂置于IOml容量瓶中， 加适量甲醇使之溶解，最后用甲醇定容至刻度，用0. 45Mffl的微孔滤膜过滤，取续滤液进样， 记录色谱峰及峰面积。将所测值代入事先做好的标准曲线求算和厚朴酚的含量。色谱条件为色谱柱:HypersilBDS C18 (4. 6 X 250mm, 5Mm)；流动相甲醇-0. 05% 磷酸水液(74 26)；流速:lml/min ；紫外检测波长:294nm ；柱温室温；进样量:20μ1。(二)表征结果
1.外观所有实施例经过一定时间的储存，目前均为均一乳白色液体，外观与制备初期无显著区别，无分层、絮凝、析油、沉淀、酸败等不稳定现象存在。2.稳定性评价
(1)粒径稳定性各实施例的平均粒径以及多分散系数(PDI)在经过一定储存期后的变化见表1。表1各实施例的初步稳定性考察结果


本发明涉及和厚朴酚亚微乳注射剂及其生产方法，可有效解决抗肿瘤药物的生产及临床需要问题，其解决的技术方案是，由重量百分比计和厚朴酚0.01%~3.0%，注射用植物油0.1%~30%，乳化剂0.01%~6.0%，助乳化剂0.001~3%，抗氧剂0.001~0.3%，等渗调节剂0.001%~10%，pH调节剂0.000001-2%，余量为水，本发明和厚朴酚亚微乳注射剂组成科学、制备工艺简单，质量稳定可控，成本低廉，适合工业化生产；本发明提供的制剂载药量及包封率高，可长期稳定储存，有利于和厚朴酚更好地发挥药效，降低毒副作用，是药物上的一大创新。