专利名称：芋螺毒素类似物Glu-Con-G[1-13]、设计合成方法及用途的制作方法芋螺属于软体动物门，腹足纲，芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域，因外形呈圆锥形或芋头状而得名，表面常有各色花纹，壳口窄长。芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)时期海洋捕食性软体动物菊石的消失客观促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于中新世(Miocene)，基本上持续到现在(Terlau and Olivera，2004)。芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约700种芋螺，芋螺是海洋无脊椎动物中进化最成功的生物之一。芋螺虽然种类很多，但它们都是食肉动物，靠毒液来捕食。芋螺毒液是芋螺捕食与防御的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常是由7 41个氨基酸残基组成的小分子多肽，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较 (40 80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短的多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均有单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体， 约为70 100个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。这些成熟肽分别选择性地作用于钙、钠、钾离子通道，或者乙酰胆碱、NMDA、5-羟色胺等受体，许多已经成为神经生理学研究的工具药。二十世纪八十年代初，美国犹他大学(University of Utah)的Olivera实验室最早开展了芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫键骨架)可分为不同的超家族。至今已分离得到的芋螺毒素有近千种。数十种芋螺毒素已申请美国专利。他们在某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已用于临床研究或被FDA正式批准为治疗新药，用作特异通道或受体鉴定诊断试剂和镇痛药。在神经药理学领域得到了广泛的应用。芋螺睡眠肽(Conantokin，Con)是一类较特殊的芋螺毒素，是芋螺毒素超家族中的一个成员家族。该家族迄今已经发现多个成员，但对芋螺睡眠肽-G(Con-G)、芋螺睡眠肽-T(Con-T)、芋螺睡眠肽-R(Con-R)、芋螺睡眠肽-L(Con-L)研究的较多。这四个毒素肽序列上显示了高度同源性，除了 Con-R有一个二硫键外，其他三个肽均不含二硫键，而芋螺毒素超家族中其他成员一般均含有二硫键。这四个肽序列中都含有Y-羧基谷氨酸(Gla)， 能够结合二价金属离子。与金属离子结合时，他们的空间构象均呈现高比例的-螺旋结构。 这四种毒素都是选择性的NMDA受体非竞争性抑制剂，在实验幼鼠身上可引起睡眠样症状。 研究发现人的NMDA受体参与一系列神经系统的病理过程，如阿尔茨海默症、癫痫、中风等， 动物试验中发现芋螺睡眠肽对治疗上述病症有较好的疗效。芋螺睡眠肽-G(Con-G)是1984年美国犹他大学(University ofUtah)的 Olivera 小组从芋螺Conus geographus中分离得到的第一个Conantokins家族成员，它最初以前体3肽(Con-G原始肽)的形式出现，其氨基酸序列为MHLYTYLYLLVPLVTFHLILGTGTLDDGGALTER RSADATALKAEPVLLQKSAARSTDDNGKDRLTQMKRILKQRGNKARGE γ Y LQ Y NQ γ LIR γ KSNGKR, N 端的信号肽和插入区域为80个氨基酸，序列保守，C端为成熟肽，前体肽通过翻译后加工成为成熟肽(Con-G成熟肽)，其氨基酸序列为GEy YLQyNQyLIRyKSN = (I)在蛋白酶的作用下前体肽的Arg8°与Gly81之间发生裂解，Gly81成为成熟肽的Gly1残基；(2)在维生素K的作用下前体肽的大部分Glu残基羰基化为Gla。Con-G由17个氨基酸组成，其最保守的氨基酸残基包括N末端的Gly-Gla序列、Glaici-Gla14以及最后一个Gla前的Arg残基。Con-G为亲水肽，呈酸性，与Con-T、Con-R相比，Con-G酸性最高。在未结合金属离子时，Con-G呈现一种无规则的结构，但当结合Ca2+、Mg2+等金属离子后，Con-G的空间构想变成从N端到C端的-螺旋结构，其比例可高达85% (25°C )，这主要是由于Con-G的四个带负电残基Gla3-Gla7-Glaici-Gla14位于分子的同一面，相互之间的静电斥力使之几乎无法形成-螺旋结构，金属离子与Gla的螫合正好起到电力中和作用，使原来排斥的负电残基Gla空间上相互靠近，从而能转变成稳定的-螺旋结构。用肽C端逐个截去氨基酸的方法发现Con-G最短有生物活性序列长度是 Con-G[l-13]，其氨基酸序列为GE y y LQ y NQ y LIR,表明对生物活性有影响的残基位于这些序列内。N端的四个保守残基即Gly1、Glu2, Gla3、Gla4被认为对芋螺睡眠肽的生物活性起非常重要的作用，第五位残基对芋螺睡眠肽的抑制活性和亚基选择性非常重要，Gln9对 Con-G的抑制活性是必不可少的，Gla7, Gla10, Gla14是金属离子的结合位点，但和抑制活性无关，第12位残基被认为参与了和NMDA受体的相互作用。研究已知，在脑动脉阻塞的小鼠梗塞模型中，Con-G能有效缩小梗塞范围，有效抑制缺血性脑损伤引起的受损脑细胞中c-f0S、bax、bcl-2基因的大量表达，具有较强的神经保护作用。文献报道，芋螺睡眠肽可用于癫痫的治疗，以减轻癫痫的发作频率和程度，且对神经受损引起的痛觉超敏有很强的抑制作用。芋螺睡眠肽还可用于药物依赖的治疗，本实验室已初步证明Con-G可以抑制吗啡诱导的精神依赖和躯体依赖。由于Gla为非天然氨基酸，难以通过常规的生物表达或化学合成获得。除此之外， Con-G还存在肽链过长、分子量过大、难以通过血脑屏障的缺陷，动物实验时只能通过鞘内注射的方法注射药物，临床应用时具有较大的局限性。
本发明首先要解决的技术问题是提供一种较Con-G肽链短、分子量小的芋螺毒素类似物Glu-Con-G [1-13]，其氨基酸序列从N端到C端为GEEELQENQELIR，分子量为1588。所述GlU-Con-G[l-13]的C端可以是被酰胺化的C端，其氨基酸序列从N端到C 端为GEEELQENQELIRX，χ表示酰胺化。由于采用本发明的上述技术方案，本发明首先用天然氨基酸Glu将Con-G的Gla3、 Gla4、Gla7、Gla1Q、Gla14 替换，得到 Glu-Con-G 的氨基酸序列为GEEELQENQELIREKSN(如序列表SEQ NO :4所示)，其在一定程度上改善了 Gla残基的难以获得的缺陷，进一步地，将其序列C端4个氨基酸截掉，即得到Glu-Con-G[1-13]的氨基酸序列为GEEELQENQELIR(如序列表SEQ NO 5所示)，本发明所提供的GlU-Con-G[l-13]保持原有活性，即仍对吗啡精神依赖和躯体依赖有一定的干预作用，但更易于人工合成，且分子量更小，分子量仅为1588，而Con-G和Glu-Con-G的分子量分别为2洸5. 19、2044. 14。本发明另一个所要解决的技术问题是提供芋螺毒素类似物GlU-Con-G[l-13]的合成方法。为此，本发明采用以下技术方案它包括以下步骤(1)、利用同源模建的方法，以PDB数据库中ID为2A5S的参考蛋白为模板，利用 Modeller 8v2进行NR2B亚基的同源模建；(2)、采用镶嵌在 hsight II package version 2005 (AccelrysTM he.)中的 ZDOCK模块，进行Con-G与NR2B亚基对接；(3)、选取与活性数据相符合的构象运用Charmml9力场进行能量优化；(4)、通过NACCESS软件计算NR2B受体与Con-G作用前后蛋白质表面溶剂可及性 ASA 的变化AASAi = ASA^B-ASAiN—G ；(5)、计算受体NR2B亚基与配体Con-G之间重要氨基酸相互作用形成的氢键位点和长短，得到Con-G的重要氨基酸；(6)、保持Con-G重要氨基酸，剔除或替换非重要氨基酸以及非天然氨基酸，保持多肽原来三维结构、与受体结合方式，构建Con-G类似物Glu-Con-G[1-13]；(7)、采用固相合成和分离纯化的化学方法合成GlU-Con-G[l-13]。由于采用上述技术方案，本发明可以计算机模拟、计算和预算配体分子与受体生物大分子之间的关系，设计和优化配体分子的方法，使设计出的新分子具有合理性，大大减少了所筛选的化合物的数目加快了药物研究与开发的周期，明显的优于传统的广泛药理筛选和先导化合物优化的方法。本发明另一个所要解决的技术问题是提供芋螺毒素类似物GlU-Con-G[l-13]在制备对吗啡精神依赖和躯体依赖有干预作用的药物中的用途，以及在制备对镇痛有一定疗效的药物中的用途。本发明所提供的芋螺毒素类似物GlU-Con-G[l-13]具有抑制吗啡诱导小鼠条件性位置偏爱(Conditioned Place Preference,CPP)的作用，其最佳镇痛率为吗啡的702倍。因此，本发明所述的此种类似物GlU-Con-G[l-13]可作为抗吗啡成瘾药以及高效镇痛药物。图 1NR2B 与同源蛋白 1Y20 (NRl 的 PDB ID)、2A5S (NR2A 的 PDB ID)和 (NR3A 的PDB ID)进行序列比对图。图2Con-G和NR2B亚基作用模型图。虚线表示氢键，紫色字母代表Con-G氨基酸， 桔黄色字母代表NR2B的氨基酸。图3NR2B亚基和Con-G的Connolly表面图。NR2B亚基和Con-G相互作用的氨基酸用不同颜色标出。箭头表示作用位置。图4Con G、Glu_Con G、Glu_Con G[l_13]抑制吗啡诱导小鼠CPP表达的结果图。* P <0.01表示与生理盐水组相比存在差异，其数据表示为均数士标准差。M-C表示Con-G 组，M-G 表示 Glu-Con-G 组，M-13 表示 Glu-Con-G[1-13]组。图5为Glu-Con-G[1-13]与生理盐水组、吗啡组、ConG组躯体依赖试验结果比较图。与生理盐水组比较，<0.05，<0.01，*〃p <0.001 ；与吗啡组相比较， #p <0.05，##p < 0. 01 ；与 ConG 组相比较，腳ρ <0.001，；Δ ρ < 0. 05，ΔΔ ρ < 0. 01，ΔΔΔρ< 0. 001。图6为Glu-Con-G[1-13]与生理盐水组、吗啡组、ConG组福尔马林实验结果比较图。与生理盐水组比较，<0.05，<0.01，*〃p <0.001 ；与吗啡组相比较， flP < 0. 05，##p < 0.01,腳ρ < 0. 001 ；与 ConG 组相比较，Δρ < 0. 05，ΔΔρ < 0·01，ΔΔΔρ < 0. 001。图7 为 0. 5h、lh、l. 5h、2h、2. 5h 时刻 Glu-Con-G[l_13]与生理盐水组、吗啡组、 ConG组热板实验结果的比较图。


本发明用天然氨基酸Glu将Con-G的Gla3、Gla4、Gla7、Gla10、Gla14替换，得到一种较Con-G肽链短、分子量小的芋螺毒素类似物Glu-Con-G[1-13]。本发明在一定程度上改善了Gla残基的难以获得的缺陷，本发明所提供的Glu-Con-G[1-13]保持原有活性，即仍对吗啡精神依赖和躯体依赖有一定的干预作用，但更易于人工合成，且分子量更小，分子量仅为1588，而Con-G和Glu-Con-G的分子量分别为2265.19、2044.14。