专利名称：鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法鲆鲽鱼类是我国北方工厂化海水养殖的主要品种，对我国沿海地区的渔业经济发展做出了重要贡献。近几年，随着鲆鲽类养殖产业规模和产量的迅速扩大，疾病成为养殖生产面临的主要问题之一。疾病频繁的发生，对养殖的成活率形成直接威胁，造成的经济损失已经在一定程度上制约了产业的健康平稳发展。中国水产科学研究院黄海水产研究所已对我国的养殖鲆鲽类进行了全面、系统的疾病流行病学研究，发现了鲆鲽类20余种典型的疾病症状，并对它们的病原进行了细致、 深入的研究。研究发现鲆鲽类的大多数疾病是由细菌性病原引起的，而鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌是鲆鲽类养殖过程中最为常见的五种病原菌，可以造成烂鳍、腹水、肠炎、红体、肌肉脓肿等多种明显的表观症状。因为细菌性疾病是我国养殖鲆鲽类的主要疾病，广大鲆鲽类养殖者在国内没有商业化的鲆鲽类疫苗可用的情况下，主要依赖抗生素和化学类药物来防御疾病。而长期使用抗生素，不仅容易使病原菌产生耐药性，增加后续预防疾病的困难，而且其药残问题也关联到养成商品鱼的食品质量安全。因此，开发鲆鲽类养殖专用疫苗迫在眉睫。通过注射疫苗来预防病原感染，是具有特异性免疫系统的动物行之有效的无公害疾病防治技术。这一技术方法在海水养殖鱼类中同样适用。在本发明作出之前，国内外有 N. Castro^ (Development of an effective Edwardsiella tarda vaccine for cultured turbot Scophthalmus maximus. Fish & Shellfish Immunology, Volume 25, Issue 3, September 2008)对大菱鲆的爱德华菌疫苗，曹宏梅等对鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果(中国水产科学，2006年13卷第3期)，朱开玲等对大菱鲆的鳗弧菌灭活疫苗等方面展开了研究(高级技术通讯，2004年第2期)。他们的研究主要集中在用1种或2种大菱鲆的细菌病原制备疫苗，而且没有使用黄芪多糖作为疫苗佐剂，与本发明相比， 无论在疫苗组成还是疫苗功能上都存在明显的不同。
本发明所要解决的技术问题是提供一种鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗，它具有多重的免疫效果，对鲆鲽鱼类一次接种免疫后可以有效预防5种细菌性病原菌的感染，能够显著降低细菌性疾病的发病率。本发明采用如下技术方案鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗是由灭活的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌的菌悬液等体积混合制成。所述的鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗，优选的由灭活的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌的菌悬液和黄芪多糖溶液混合制成。所述的鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗，优选的各成份浓度为鳗弧菌IO8 109cfu/mL， 大菱鲆弧菌IO8 109cfu/mL，哈维氏弧菌IO8 109cfu/mL，溶藻胶弧菌IO8 109cfu/mL， 迟钝爱德华氏菌IO8 109cfu/mL，黄芪多糖7. 5 17. 5mg/mL。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种鲆鲽鱼类的五联灭活疫苗的制备方法。本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案如下(1)将能够感染鲆鲽类发病的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌接种到胰蛋白胨大头肉汤培养基(TSB)平板上，28°C培养24h-4 !进行复苏；(2)分别挑取上述5株病原菌到TSB液体培养基中，28°C条件下110 120r/min 的转速振荡培养Mh，收集培养液在4°C条件下5000rpm离心5分钟，将离心后的沉积菌体用 pH = 7. 2 的 PBS 缓冲液(成份=NaCl 8. Og/L ；KC10. 2g/L ；Na2HPO4 1. 15g/L ；KH2PO4 0. 2g/ L，去离子水配制。)冲洗3遍后，用灭菌后的1.5% (重量比)的NaCl溶液分别制成IO9 101(lCfu/mL的菌悬液原液；(3)将五种病原菌的菌悬液原液分别灭活后，1 :1:1:1: 1等体积混合，即为鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液。(4)将上述步骤C3)得到的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液和黄芪多糖佐剂原液按 1 1的体积比混合，振荡均勻后即为含黄芪多糖佐剂的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。所述的五种病原菌菌悬液的灭活，为分别在哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌菌悬液中添加0.5% (ν/ν)的福尔马林溶液；在大菱鲆弧菌和鳗弧菌菌悬液中添加1.0% (ν/ν)的福尔马林溶液；在爱德华氏菌菌悬液中添加1.5% (ν/ν)的福尔马林溶液，28°C条件下110 120r/min的转速振荡灭活处理4 后，用PH = 7. 2的PBS缓冲液洗脱3次去除福尔马林。所述的黄芪多糖佐剂原液，是将多糖含量> 78. 2%的黄芪多糖(APS)原粉用蒸馏水溶解，配制成黄芪多糖浓度为15 35mg/mL的溶液，经115°C高压灭菌IOmin后，自然冷却制备而成。本发明与已有技术对比其特点是1、本发明的疫苗菌种是经过鲆鲽类流行病学和病原学研究而筛选出来的，菌株的致病力强，具有较强的针对性和代表性，经灭活后可显著提高接种对象的特异和非特异性免疫指标。2、本发明实现了鲆鲽鱼类疫苗的多重免疫效果，一次接种就可以有效预防鲆鲽类 5种重要病原细菌的感染，能够有效降低由这些病原菌引发的疾病的发生率，对鲆鲽鱼类的保护率为30% -71.4%。3、本发明适用对象多，能够用于现有中国全部养殖鲆鲽类品种的免疫接种。 图1为含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗接种大菱鲆后56天内的抗体效价变化图；图2为不含黄芪多糖佐剂的鲆鲽类五联灭活疫苗原液接种大菱鲆后56天内的抗体效价变化图。

本发明涉及一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗和它的制备方法。疫苗的主要成分是由鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌五种细菌的灭活菌体混合而成。它的制备方法是将上述五种细菌分别制成109～1010cfu/mL的菌悬液经福尔马林灭活后按1∶1∶1∶1∶1比例等体积混合制成鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液，然后将鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与浓度为15～35mg/mL的黄芪多糖佐剂原液按1∶1的比例均匀混合后制成。本发明具有多重的免疫效果，一次接种后可以有效预防鲆鲽鱼类五种细菌性病原菌的感染，为海水鱼类多联灭活疫苗的研发提供了依据。