专利名称：短双歧杆菌及食品中甲胺磷农药残留的检测方法食品是人类赖以生存和发展的物质基础，农药残留超标已成为我国当前食品安全的突出问题之一。仅2010年以来，我国发生“海南毒豇豆”、“青岛检出1930千克韭菜农药超标”等一系列农药残留引发的食品安全事件；我国每年因食品中农药残留量超标造成的中毒事件屡屡发生，因此，对食品中农药残留及时、准确地分析检测事关重大，建立快速、简便、安全、准确的农药残留检测技术是食品安全发展的必然需求。甲胺磷是一种高效、持效期长、内吸性强的广谱性的有机磷杀虫剂，适用于蔬菜、 茶树、水稻、小麦等作物，能有效防治多种害虫。但甲胺磷的过量使用，使其在蔬菜水果中高残留，给人们的健康带来巨大的威胁，因此我国已限量使用，检测食品中甲胺磷残留量列为残留监控重点。目前，针对食品甲胺磷农药残留一般有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法 (HPLC)、分光光度计、化学发光法、酶抑制法、毛细管电泳技术(CE)等。用上述方法检测存在仪器设备复杂、样本前处理和测定操作繁琐的缺陷，设备成本大，检测费用高，对检测人员的要求也高，不适合大量样本筛检，不利于在基层食品检测部门推广应用。开发一种操作方便、费用低、可靠、可用大量检测样品中甲胺磷的检测方法势在必行。而其首要一环是筛选一种对甲胺磷普遍敏感且敏感性稳定、检测限低、生长迅速地指示菌。迄今为止，尚无筛选出甲胺磷敏感性高、特异性高的双歧杆菌工作菌株及其在食品中甲胺磷残留检测应用的相关报道。
有鉴于此，本发明的目的是筛选出不易受杂菌污染影响并对甲胺磷农药敏感的双歧杆菌菌株，并据此建立一种简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的以该菌株为工作菌株进行食品中甲胺磷农药残留检测的方法，该方法采用甲胺磷对发酵的抑制作用来确认食品样品中是否含有的甲胺磷残留，可以有效地检测食品中残留的甲胺磷农药。为解决上述技术问题，本发明提供一株对甲胺磷敏感性高并应用于甲胺磷检测的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) LJM-006 CGMCC No. 5418。本发明的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve) LJM-006,于 2011 年 10 月 28 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，保藏编号为 CGMCC No. 5418。本发明的短双歧杆菌LJM-006分离于一名浙江省健康青年人粪便中。本发明的短双歧杆菌LJM-006菌株具有下述微生物学特征(1)菌落形态LJM-006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1-1. 5mm;(2)个体形态为不规则G+无芽孢杆菌，有直杆、弯杆、火柴头状、哑铃形状和大雁状， 其中以大雁状为主；(3)生理生化特征D-核糖(+) ；L-阿拉伯糖(一)；乳糖(+ )；纤维二糖(一)； 松三糖(+ )；棉籽糖(+ )；山梨醇(一)；淀粉(一)；葡萄糖酸钠(一)；木糖(一)；甘露糖(十)；果糖(十)；半乳糖(十)；蔗糖(十)；麦芽糖(十)；海藻糖(一)；密二糖 (+ )；甘露醇(+ )；菊糖(一)；水杨素(一)；F6PH(酶(+ )；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(一)；触酶(一)；靛基质反应(一)；(4)厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37-41°C；最低生长温度 25-280C ；最高 43-450C ；生长最适 pH 6. 5-7. 0 ；在 ρΗ4· 5-5. 0 或 8. 0-8. 5 不生长。LJM-006菌株与同属同种标准菌株相比对甲胺磷敏感性提高了 100倍以上。本发明还提供一种食品中甲胺磷残留的检测方法，所述方法包括以下步骤(1)菌株活化将上述短双歧杆菌LJM-006菌株接种于营养琼脂斜面培养基上，调节该培养基的PH值至6. 8^7. 2，于35 37°C下进行优化培养，并进行转种继代培养；(2)菌悬液制备取步骤(1)所得短双歧杆菌LJM-006接种于营养琼脂斜面培养基，35士2°C厌氧培养M小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，调整其0D_值至 0. 25 0. 35，置2-8°C冰箱中保存；
(3)检测管制备以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，吐温-80 lmL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6. 5，115°C高压灭菌15-20分钟，冷却温度为 5(T65°C，并迅速取10 mL上述液体，注入10 mL试管内，作为检测管，于(T4°C下直立静置， 密封后(T4°C下保存、备用；
(4)绘制标准曲线并建立回归方程选择浓度为0mg/L、0. 25mg/L、0. 5 mg/LU. 0 mg/ LU. 5 mg/L、2.0 mg/L、4. 0 mg/L的甲胺磷标准品溶液，其中Omg/L为阴性对照。取以上标准品溶液2(Γ100 μ L加入所述检测小管内，37°C厌氧培养纩12h，测定样品反应管和阴性对照反应管的OD5tltl值；测定样品反应管和阴性对照反应管的OD5tltl值的具体步骤为①收集菌体取步骤(2)所得菌悬液30 mL于各离心管中，4°C、8，000 r/min离心10 min，弃上清液、收集菌体，用PH 6. 5的PBS缓冲液洗涤菌体2次；②菌体破碎离心管中加0.7 mL、pH 6. 5的PBS和0. 3 mL、0· 45% (质量体积比，W/V)的CTAB,混勻，作用10 min,结束后放置冰上备用；③取上述步骤②菌体破碎后液体，即粗酶液0.25 mL加入各0.25 mL的NaF (3 g/ L)、碘乙酸钠(5 g/L)和果糖-6-磷酸二钠(80 g/L)，混勻，置于37°C下孵育30 min ；④结束后，加入1. 5 mL的盐酸-羟胺(130 g/L)，混勻，室温静置10 min ；⑤然后加入各1 mL 的TCA(15%，质量体积比)、HCl (4 mol/L)和FeCl3 (5%，质量体积比，用0. 1 mol/L HCl配制)，混勻，4°C、10，000 r/min离心15 min后，用722分光光度计测定OD值，检测光的波长为500 nm，阴性对照反应管以蒸馏水代替，其余操作同上。Bz^l (B值为样品反应管的OD5tltl 值，B0值为阴性对照反应管的OD5tltl值)为纵坐标Y，甲胺磷浓度的对数值为横坐标X (单位是mg/L)，绘制标准曲线，建立甲胺磷含量与B/ B。的线性回归方程Y= — M.68x + 66.72， 甲胺磷的线性范围为0. 0广100mg/L，检测下限达到0. lmg/L，R2为0. 9902 ；(5)样品前处理取待检的食品样品勻浆组织5g，用无菌1%磷酸盐缓冲液(酸度为 ρΗ6.0 7.2)20 mL稀释，漩涡混勻，于80°C水浴加热5 min，冷却后于5，000 r/min离心15 min，取上清液作为供试样品液；
(6)样品检测取步骤( 所得供试样品液2(Γ 00μL加到所述检测小管中，密闭封口后于35士2°C厌氧培养纩10小时，并测定样品反应管和阴性对照反应管的OD5tltl值，根据所得各样品的BziBci值在标准曲线上求出其对应的甲胺磷质量浓度，或代入步骤(4)所得回归方程计算样品质量浓度的对数值X，求其反对数，即为样品中所含甲胺磷的质量浓度。果糖-6-磷酸酮解酶(F6PPK)是双歧杆菌属的双歧代谢途径中的特征性酶，通过特异的“果糖-6-磷酸支路”(又称为双歧支路)对葡萄糖进行发酵，这与其它细菌利用醛缩酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶明显不同。该酶催化果糖6-磷酸盐分解为乙酰磷酸盐和4-磷酸赤藓糖。葡萄糖不经过糖酵解途径而经过F6PH(酶进行双歧代谢途径最终生成乳酸和醋酸，即双歧支路、果糖-6-磷酸支路，该酶已广泛应用于双歧杆菌的鉴定与活菌计数。本发明的工作菌株为短双歧杆菌LJM-006，已于2011年10月观日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. M18。本发明所述的食品样品包括白菜、茄子、黄瓜、南瓜、冬瓜、苹果、梨子、桃子等蔬菜水果。本发明使用的标准曲线回归方程是通过下述的方法得到的利用甲胺磷的标准储备液配置浓度分别为 0. 25mg/L、0. 5mg/L、l. Omg/LU. 5mg/L、2. 0mg/L、4. O mg/L 的标准溶液，其中Omg/L为阴性对照。取以上标准品溶液20yL加入检测小管内，37°C厌氧培养 8 12h，测定样品反应管和阴性对照反应管的OD5tltl值(F6PH(酶活)，以F6PH(酶活抑制率B/ B0 (B值为样品反应管的OD5tltl值，Btl值为阴性对照反应管的OD5tltl值)为纵坐标Y，甲胺磷浓度的对数值为横坐标X，绘制标准曲线，得到了标准曲线回归方程Y= —M.68x + 66. 72(Y B/ B0比值，B值为样品反应管的OD5tltl值，Btl值为阴性对照反应管的OD5tltl值，X 食品中所含有甲胺磷的对数浓度，其单位是mg/L)，线性范围为0. 0ri00mg/L, R2为0. 9902。本发明方法中，重复四次测定甲胺磷含量己知的蔬菜或水果样品，计算其相对标准偏差为7. 80，表明本发明方法的检测精确度较高。考察本发明方法的回收率，加入40yL、100mg/L的甲醛标准溶液于甲胺磷含量己知的蔬菜或水果样品中，重复分析四次，经计算得到的回收率为85. 94。通过测定甲胺磷最低浓度的定量溶液，得到本发明方法的最低检测限为0. lmg/L。本发明具有以下优点及效果
(1)本发明短双歧杆菌LJM-006具有以下特点①对甲胺磷敏感性高、特异性好；②菌株稳定性好；③专性厌氧菌，发酵过程中不易受杂菌污染影响；
(2)本发明方法的原理是基于甲胺磷农药对双歧杆菌具有抑制作用，并利用特性，双歧杆菌对样品进行发酵处理，跟踪发酵过程，根据其发酵特性来判断样品中有无甲胺磷农药的残留；该检测判断方法经济、简便、快捷、准确，适合食品质量安全控制，实用性非常强；
(3)本发明样品前处理简单，能同时筛检大量食品样品；
(4)本发明检测方法简便易行，具有灵敏度高，精确度高等特点，回收率均大于70%，变异系数在10%以内，符合食品甲胺磷残留筛检的准确度和精密度要求，完全适合食品中甲胺磷残留的检测。


图1为甲胺磷检测的标准曲线。

以一名浙江省健康青年人的粪便作为分离样品，在MRS琼脂培养基上，37°C厌氧条件下，4 涂布分离培养，获得本发明所述的短双歧杆菌LJM-006，鉴定为短双歧杆菌，该菌株已于2011年10月观日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，保藏号为 CGMCC No. 5418。MRS琼脂培养基的配方蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，吐温-80 lmL，琼脂15g，蒸馏水1L，调pH至7. 0，115°C灭菌15分钟。本发明的LJM-006菌株具有下述微生物学特征
(1)菌落形态LJM-006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1-1. 5mm ；
(2)个体形态为不规则G+无芽孢杆菌，有直杆、弯杆、火柴头状、哑铃形状和大雁状， 其中以大雁状为主；
(3)生理生化特征D-核糖(+) ；L-阿拉伯糖(+ )；乳糖(+ )；纤维二糖(一)； 松三糖(+ )；棉籽糖(+ )；山梨醇(一)；淀粉(一)；葡萄糖酸钠(一)；木糖(+ )；甘露糖(一)；果糖(十)；半乳糖(十)；蔗糖(十)；麦芽糖(十)；海藻糖(一)；密二糖 (+ )；甘露醇(+ )；菊糖(一)；水杨素(一)；F6PH(酶(+ )；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(一)；触酶(一)；靛基质反应(一)；
(4)厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37-41°C；最低生长温度 25-280C ；最高 43-450C ；生长最适 pH 6. 5-7. 0 ；在 ρΗ4· 5-5. 0 或 8. 0-8. 5 不生长。试验1 敏感性试验
采用纸片琼脂扩散(K-B)法，选取不同浓度的甲胺磷标准液，以改良MRS琼脂培养基， 培养基配方见实施例1，以本发明短双歧杆菌LJM-006为测试菌，置于37°C培养箱中厌氧培养24h后观察LJM-006菌株的生长情况，用纸片琼脂扩散法做甲胺磷敏感性试验，测定甲胺磷对LJM-006菌株的抑菌性能。上述试验做3次重复，以同属同种的短双歧杆菌标准菌株为对照。表1 敏感性试验


本发明涉及一种短双歧杆菌及利用该菌株进行食品中甲胺磷农药残留的检测方法。所筛选出的菌株为LJM-006菌株，保藏号为CGMCC No.5418；LJM-006菌株对甲胺磷超敏感；以该菌株为工作菌所建立的甲胺磷残留检测方法包括(1)菌株活化；(2)菌悬液制备；(3)检测管制备；(4)绘制标准曲线并建立回归方程；(5)样品前处理；(6)样品检测等步骤。本发明的检测方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、结果易判断，与高效液相色谱法进行对比，结果符合率高，适合样本筛检，更符合我国农药残留检测部门的大量样品筛检要求。