专利名称：一种分离纯化谷氨酰胺转胺酶的方法谷氨酰胺转胺酶，又称转谷氨酰胺酶，是一种催化酰基转移反应的转移酶。它可以 催化蛋白质分子内和分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间连接，以及蛋白质分子内谷氨 酰胺侧链酰胺基的水解，被认为是用来生产各种新型蛋白类加工产品的重要酶种，在食品、 生物制药、纺织等领域有着广泛的应用前景。在发达国家，谷氨酰胺转胺酶已经开始普遍推广应用，在日本已成为食品工业中 仅次于淀粉酶的第二大酶种。用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，是一种大量获得廉价 谷氨酰胺转胺酶的方法，但目前国内谷氨酰胺转胺酶的发酵水平不高，制得酶粉的比酶活 不高，且含有其它杂蛋白，颜色暗沉，影响其在各领域、尤其是生物制药领域的应用。近些年来，各国对谷氨酰胺转胺酶的纯化的研究取得了长足的进展，但多限于实 验室规模，且工艺繁琐、总收率低，不适合工业化生产。目前常用的谷氨酰胺转胺酶的分离 纯化工艺采用的是几种层析联合的方法粗酶经透析后，首先使用CM-纤维素柱进行离子 交换层析，洗脱时采用的是梯度洗脱，然后使用superdex或s印hadex进行凝胶柱层析。经 CM-纤维素柱后酶活收率一般在55-65%，再经凝胶柱层析后酶活收率仅为20-40%，难以满 足生产和应用中的需要。
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种在较大的规模下，采用阳离子交换树 脂分离纯化谷氨酰胺转胺酶，得到高比酶活谷氨酰胺转胺酶的方法。本发明的目的是通过以下方式实现的一种采用阳离子交换树脂分离纯化谷氨酰胺转胺酶的方法，具体步骤为(1)在0-10°C下，用体积为1-5倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.02-0. 15mol/L的缓冲液平 衡阳离子交换树脂，流速为1/2-3柱体积/小时；(2)用体积为1/50-1/8倍树脂量(ν/ν)的谷氨酰胺转胺酶酶活为100-1000U/ml的料 液以1/2-2柱体积/小时的流速通入平衡好的阳离子交换柱；(3)用体积为2-5倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.02-0. 15mol/L的缓冲液以1/2-2柱体积 /小时的流速洗脱部分杂质；(4)再用体积为1/2-5倍树脂量(ν/ν)的洗脱剂浓度为0.1-lmol/L的洗脱液以1/5-2 柱体积/小时的流速洗脱谷氨酰胺转胺酶；
(5)收集所得的洗脱液，经过分子截留量为1000-20000道尔顿的超滤设备进行浓缩， 至浓缩后的酶浓缩液体积为浓缩前体积的1/5-1/20 ；
(6)用体积为酶浓缩液体积的1/5-2倍、浓度为40%-100%(v/v)的乙醇溶液沉降，离心，得到沉淀；
(7)将沉淀冷冻干燥，得到高比酶活的谷氨酰胺转胺酶成品。上述过程中所用的缓冲液都须经脱气处理，上柱方式为正上柱，即顺流上柱。阳离子交换树脂骨架的化学组成是聚苯乙烯、聚丙烯酸或酚醛中的一种或几种， 优选Amberlite IR-120强酸性阳离子交换树脂、ion exchanger IV弱酸性阳离子交换树 脂或者Dowex 50强酸性阳离子交换树脂中的一种。所述的Amberlite IR-120强酸性阳离子交换树脂、ion exchanger IV弱酸性阳 离子交换树脂、Dowex 50强酸性阳离子交换树脂均为市售。其中，缓冲液是选自乙酸-乙酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲 液、TriS-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的一种。本发明采用强酸型阳离子交换树脂时，洗脱液优选含H+、Na+、K+、NH4+等无机离子 洗脱剂的洗脱缓冲液，进一步优选含NH40H、NaCl, K2SO4等洗脱剂的洗脱缓冲液；采用弱酸 型阳离子交换树脂时，优先选含稀酸溶液洗脱剂的洗脱缓冲液，进一步优选含HC1、等 洗脱剂的洗脱缓冲液。本发明所使用的阳离子交换树脂，具有高载量、高蛋白回收率、低稀释体积的特 点，可将分离纯化速度提高5倍。本发明洗脱收集酶液时采用阶段洗脱，不需使用梯度混合仪。此法不仅设备简单、 耗时短、分离效果好，而且酶活回收率高，酶活收率为80-90%，有利于医药级谷氨酰胺转胺 酶的产业化。

对本发明作进一步详细的说明。谷氨酰胺转胺酶的酶活的测定以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-Y -单轻 肟酸做标准曲线。1个单位的谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37°C时每分钟催化形成1 μ mol 的L-谷氨酸-γ -单羟肟酸的酶量(U/mL)。以下实施方式旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。实施例1
(1)在0-10°C下，用体积为5倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.02mol/L、pH5. 0的磷酸盐缓 冲液平衡Amberlite IR-120强酸性阳离子交换树脂，流速为3柱体积/小时；
(2)用体积为1/50倍树脂量(ν/ν)的谷氨酰胺转胺酶酶活为1000U/ml的料液以1/2 柱体积/小时的流速通入平衡好的阳离子交换柱；
(3)用体积为5倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.02mol/L、pH5. 0的磷酸盐缓冲液以2柱体 积/小时的流速洗脱部分杂质；
(4)再用体积为3倍树脂量(ν/ν)的含lmol/LK2SO4的0. 02mol/L、pH5· 0的磷酸盐洗 脱液以1/2柱体积/小时的流速洗脱谷氨酰胺转胺酶；
(5)收集所得的洗脱液，经过分子截留量为1000道尔顿的超滤设备进行浓缩，至浓缩 后的酶浓缩液体积为浓缩前体积的1/5 ；
(6)用体积为酶浓缩液体积的2倍、浓度为40%(v/v)的乙醇溶液沉降，离心，得到沉
淀；(7)将沉淀冷冻干燥，得到高比酶活的谷氨酰胺转胺酶成品。经测定，谷氨酰胺转胺酶的酶活回收率为90. 5%，比酶活为23056U/g蛋白质。实施例2
(1)在0-10°C下，用体积为2倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.lmol/L、ρΗ7· 0的Tris-HCl 缓冲液平衡ion exchanger IV弱酸性阳离子交换树脂，流速为1柱体积/小时；
(2)用体积为1/8倍树脂量(ν/ν)的谷氨酰胺转胺酶酶活为100U/ml的料液以2柱体 积/小时的流速通入平衡好的阳离子交换柱；
(3)用体积为3倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.lmol/L、ρΗ7· 0的Tris-HCl缓冲液以1. 5 倍柱体积/小时的流速洗脱部分杂质；
(4)再用体积为5 倍树脂量(ν/ν)的含 0. lmol/L H2SO4 的 0. lmol/L、pH7. 0 的 Tris-HCl 洗脱液以1柱体积/小时的流速洗脱谷氨酰胺转胺酶；
(5)收集所得的洗脱液，经过分子截留量为10000道尔顿的超滤设备进行浓缩，至浓缩 后的酶浓缩液体积为浓缩前体积的1/10 ；
(6)用体积为酶浓缩液体积的1/5倍、浓度为100%(v/v)的乙醇沉降，离心，得到沉淀；
(7)将沉淀冷冻干燥，得到高比酶活的谷氨酰胺转胺酶成品。经测定，谷氨酰胺转胺酶的酶活回收率为92. 7%，比酶活为22183U/g蛋白质。实施例3
(1)在0-10°C下，用体积为1倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.15mol/L、pH8. 5的硼酸-硼 砂缓冲液平衡Dowex 50强酸性阳离子交换树脂，流速为1/2柱体积/小时；
(2)用体积为1/20倍树脂量(ν/ν)的谷氨酰胺转胺酶酶活为500U/ml的料液以1柱体 积/小时的流速通入平衡好的阳离子交换柱；
(3)用体积为2倍树脂量(ν/ν)的浓度为0.15mol/L、pH8. 5的硼酸-硼砂缓冲液以1/2 柱体积/小时的流速洗脱部分杂质；
(4)再用体积为1/2倍树脂量(ν/ν)的含0.5mol/L NaCl的0. 15mol/L、ρΗ8· 5的硼 酸-硼砂洗脱液以1/5柱体积/小时的流速洗脱谷氨酰胺转胺酶；
(5)收集所得的洗脱液，经过分子截留量为20000道尔顿的超滤设备进行浓缩，至浓缩 后的酶浓缩液体积为浓缩前体积的1/20 ；
(6)用体积为酶浓缩液体积的1/2倍、浓度为80%(ν/ν)的乙醇溶液沉降，离心，得到沉
淀；
(7)将沉淀冷冻干燥，得到高比酶活的谷氨酰胺转胺酶成品。经测定，谷氨酰胺转胺酶的酶活回收率为88. 2%，比酶活为25M6U/g蛋白质。


本发明提供了一种分离纯化谷氨酰胺转胺酶的方法，它有效地提高了谷氨酰胺转胺酶的比酶活，解决了酶的颜色过深从而影响其应用等问题。本发明仅用一种阳离子交换树脂分离纯化出高纯度的谷氨酰胺转胺酶，方法简单，耗时短，收率高，且可大规模制备，放大到工业生产。