专利名称：一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法长期以来，传统化石能源消耗越来越大，储量越来越低，而过度利用化石能源，造成严重的温室效应等环境问题，这成为促进生物质能源兴起的关键因素。生物能源中，燃料乙醇产业的发展速度快、发展力度最强，尤其是，以农林废弃物为原料生产燃料乙醇已成为研究开发的热点。这类技术主要包括木质纤维素水解糖化、酒精发酵及乙醇的提纯。其中，木质纤维素的糖化水解形成还原糖，是技术关键步骤，它占整个燃料乙醇生产成本的50%，制约着整个纤维素制备乙醇技术的发展进程。目前，纤维素制乙醇技术领域的关键，则主要集中于 原料预处理、优化酶的复配及激活剂的添加等方面。所研究的最终目的都是为了降低酶的用量，提高还原糖得率及纤维素转化率以及经济效益。由于木质纤维素的结构较复杂，细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键联结成网络结构，纤维素镶嵌其中，造成纤维素复合酶与纤维素的有效接触面积减少；而且纤维素本身的结晶结构使纤维素聚合物显示出刚性和高度水不溶性，更增加了纤维素的降解难度。因此，对天然纤维素进行预处理的目的是，改变该木质纤维素的结构，适度破坏纤维素、半纤维素及木质素之间的难以被破坏的连接区域，降低纤维素的结晶度，降低木质素的含量，增加原料的疏松性，以增加纤维素酶系与纤维素的有效接触面积，从而提高还原糖得率。玉米芯是剥取玉米颗粒后的残余物，是一种木质纤维素，通常采用燃烧、堆肥等处理方法得到部分利用。这种玉米芯经过机械破碎形成50 200目颗粒材料，该颗粒材料采用碱与过氧化物处理后，形成可酶解的纤维素原料。现有技术用于纤维素预处理的常用方法有:酸、碱水解、蒸汽爆破、高温水热等。纤维素复合酶的水解过程受水解温度、pH值、水解时间及底物性质与反应质量浓度等因素的影响。因此，筛选合适的反应条件，可以使纤维素复合酶得到最大化的利用。此外，酶的用量也非常关键，它直接制约着燃料乙醇的生产成本。采用酶的复配，如添加β -葡聚糖酶，不仅弥补了纤维素复合酶中β -葡聚糖酶酶活低的缺陷，而且可以避免产物抑制引起的纤维素转化率低。现有技术如专利CN1806945公开了一种利用秸杆预处理和酶解工艺使秸杆纤维素酶解的方法。秸杆首先经汽爆处理，然后用热水洗涤，除去半纤维素多糖，干燥后与离子液体混合，微波加热或直接加热，然后将处理后的秸杆用水反复冲洗，洗涤液中的溶剂可通过蒸馏等方法回收。冲洗干净的处理秸杆在50.0°C，ρΗ4.8的缓冲液中用纤维素酶解48.0 72.0小时，纤维素的酶解率达100%，但汽爆处理能耗较大，且设备要求高，成本较闻。现有技术如专利CN102115994公开了一种木质纤维素原料的处理方法，该方法通过粉碎，高度分散和高压破碎将木质纤维素原料分散到粒径为10 40 μ m,并通过酶的复配，添加β -葡聚糖酶和木聚糖酶，最终使水解率达95 % 98 %，但该方法预处理能耗大，预处理并没有使半纤维素得到有效的分离，经木聚糖酶得到的木糖，在后续的发酵过程中不能得到有效的利用。针对木质纤维素的水解糖化工艺，现有技术存在的问题可归结为:(I)大多数预处理工艺对设备要求高，能耗高，成本高，并且不能将半纤维素得到很好的分离和利用。(2)大多数工艺中，未对纤维素复合酶的最佳反应条件进行试验，造成酶不能得到有效利用。(3)现有技术采用酶的复配技术，所添加酶的种类较多，但其应用有效性和成本没有得到充分考虑。这些现有技术的问题导致迄今仍不能规模化有效处理和经济性转化木质纤维素，显著降低现有技术的创造性和实用性。由于木质纤维素各品种之间结构的差异性以及半纤维素形态与分布的不同，对它们采用的处理方法也不相同。尤其是，处理木屑与处理玉米芯的方法，就有很大差异。针对现有技术的问题，尤其是现有处理木质纤维素技术未能有效利用酶的问题，本发明技术提出在预处理木质纤维素时采用非离子型表面活性剂，促进酶的有效分散，主要是基于纤维素复合酶与反应底物中的木质素无效吸附，会造成部分酶的失活问题而提出的有效方法。本发明所述的非离子型表面活性剂，可以优先与木质素进行吸附结合，优先占据木质素活性反应位置产生占位效应，避免了酶的浪费，减少了纤维素的转化成本，提高还原糖的得率。
为了最大化的利用纤维素复合酶，降低成本，提高纤维素转化率及还原糖得率，本发明对木质纤维素采用2 步法的预处理工艺，所述的预处理过程为:在IL圆底烧瓶中，力口入一定量的木质纤维素，加入浓度为1.2%氢氧化钠和浓度为0.225%双氧水，以1: 20固液比加入蒸馏水，温度70.(TC，转速300r/min，反应3.0小时。离心后，倒掉上清液，以固液比为1: 20加入浓度1.0%的稀硫酸，温度120.(TC，反应1.0小时，用碱调节pH至7.0 9.0,干燥备用。所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于所述的木质纤维素原料为由经2步法预处理得到的玉米芯，该预处理玉米芯的过程为:将玉米芯材在低于100.(TC烘干后粉碎至80目，用浓度1.2%氢氧化钠和浓度0.225%双氧水于70.(TC水浴中处理3.0小时，过滤，烘干得到初级处理产品；该产品用浓度1.0%的稀硫酸120.(TC处理1.0小时，并用碱调至pH为7.0 9.0，再经烘干即得到2步法预处理的玉米芯。利用上述预处理得到的玉米芯纤维素，设计处理2步法预处理反应过程。利用正交实验方法优化实验组成及酶反应过程，分析优化合适的酶反应条件，添加β -葡聚糖酶和非离子型表面活性剂，提高纤维素复合酶的利用率。所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于所述的复合酶用量为 15.0 120.0FPU/g ο所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于所述的底物质量浓度为10.0 200.0g/L所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于所述的反应温度为 30.0 70.(TC所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于所述的反应pH值为3.5 5.5。所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于所述的反应时间为 6.0 72.0h0所述的一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，其特征在于，所采用的氢氧化钠浓度为1.2%，双氧水浓度为0.225%。实施例中还原糖的测定采用DNS法。
实施例11步骤如实施例7，将底物质量浓度改变为100.0g/L,还原糖得率为53.0%。实施例12配制好pH为3.6的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的2步法预处理的玉米芯分散在缓冲液中，分别加入75.0FPU/g的纤维素复合酶，置于摇床中45.(TC，转速150r/min，反应48.0h，实验所得的还原糖得率为46.8%。实施例13步骤如实施例12，所述的缓冲液的pH值为4.0，实验所得的还原糖得率为55.9%。实施例14步骤如实施例12，所述的缓冲液的pH值为4.4，实验所得的还原糖得率为60.2%。实施例15步骤如实施例12，所述的缓冲液的pH值为4.8，实验所得的还原糖得率为61.0%。实施例16步骤如实施例12，所述的缓冲液的pH值为5.2，实验所得的还原糖得率为51.0%。实施例17配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的2步法预处理的玉米芯分散在缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素复合酶，置于摇床中35.(TC，转速150r/min，反应48.0h，还原糖得率为54.4%。实施例18步骤如实施例17，只改变温度为40.(TC，还原糖得率为58.7%。实施例19步骤如实施例17，只改变温度为45.(TC，还原糖得率为61.0%。实施例20步骤如实施例17，只改变温度为50.(TC，还原糖得率为64.1 %。实施例21步骤如实施例17，只改变温度为55.(TC，还原糖得率为51.9%。实施例22配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的2步法预处理的玉米芯分散在缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素复合酶，置于摇床中45.(TC，转速150r/min，反应时间为6.0h，实验得到的还原糖得率为43.8%。实施例23
实验步骤如实施例22，只是将反应时间确定为12.0h,实验得到的还原糖得率为54.7%。实施例24实验步骤如实施例22，只是将反应时间确定为24.0h,实验得到的还原糖得率为56.5%。实施例25实验步骤如实施例22，只是将反应时间确定为36.0h,实验得到的还原糖得率为59.3%。
实施例26实验步骤如实施例22，只是将反应时间确定为48.0h,实验得到的还原糖得率为61.0%。实施例27配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的2步法预处理的玉米芯分散在缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素酶，再加入1.5CBU/g β -葡聚糖酶置于摇床中50.(TC，转速150r/min，反应48.0h，实验得到的还原糖得率为71.5%实施例28实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改变为2.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为73.2%。实施例29实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改变为3.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为73.8%。
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实施例30实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改变为4.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为75.1 %。实施例31实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改变为5.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为75.7%。实施例32实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改变为6.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为78.1 %。实施例33实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改变为7.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为76.9%。实施例34实验步骤如实施例27，只是将β -葡聚糖酶加量改为8.5CBU/g,实验得到的还原糖得率为76.0%。实施例35配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的2步法预处理的玉米芯分散在缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素酶和6.5CBU/g β -葡聚糖酶，然后加Λ 0.075g/g的聚乙二醇置于摇床中50.(TC，转速150r/min，反应48.0h，所得的还原糖得率为 80.5%。实施例36实验步骤如实施例35，只是将聚乙二醇加量改变为0.150g/g，所得的还原糖得率为 86.4%0实施例37实验步骤如实施例35，只是将聚乙二醇加量改变为0.225g/g，所得的还原糖得率为 89.3%。
实施例38实验步骤如实施例35，只是将聚乙二醇加量改变为0.300g/g，所得的还原糖得率为 89.5%。实施例39实验步骤如实施例35，只是将聚乙二醇加量改变为0.375g/g，所得的还原糖得率为 89.8%比较例I玉米芯原料烘干，粉碎至80目，备用。配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的玉米芯分散在上述配制的缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素酶，置于摇床中45.(TC，转速150r/min，反应48.0h，还原糖得率为35.2%。比较例2玉米芯原料烘干，粉碎至80目，加入浓度1.2%的氢氧化钠和浓度0.225%的双氧水，于70.(TC水浴中处理3.0小时，过滤，烘干。配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的上述碱氧处理玉米芯分散在配制的缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素酶，置于摇床中45.(TC，转速150r/min，反应48.0h，还原糖得率为58.2%。比较例3玉米芯原料烘干，粉碎至80目，加入浓度1.0%的稀硫酸120.(TC油浴处理1.0小时，并用碱调至pH为7.0 9.0，烘干备用。配制好pH为4.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，称取质量浓度为40.0g/L的上述稀硫酸处理玉米芯分散在配制的缓冲液中，加入75.0FPU/g的纤维素酶，置于摇床中45.(TC，转速150r/min，反应48.0h，还原糖得率为51.3%。表1实施例2-

本发明公开了一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，首先，通过碱氧预处理与硫酸预处理的2步法预处理纤维素原料，再优选纤维素复合酶质量份为15.0～120.0FPU/g及其最佳反应条件，加入β-葡聚糖酶质量份为1.5～8.5CBU/g和表面活性剂质量份为0.075～0.375g/g在缓冲液反应，促进预处理纤维素的反应，实现木质纤维素的高效糖化水解。本发明在纤维素复合酶水解的最佳反应条件下，采用β-葡聚糖酶，弥补纤维素复合酶中β-葡聚糖酶酶活低的缺陷，非离子表面活性剂避免了纤维素酶与木质纤维素中木质素的吸附，使纤维素复合酶水解纤维素的效率提高，还原糖转化率可达89.8％，所制成的还原糖用于直接发酵制乙醇，形成乙醇新能源的重要技术方法。