专利名称：一种去除污水中金属铬的基因的合成及其应用的制作方法金属铬主要以三价和六价形式大量存在于工业废水中，Cr ( VI)的毒性比Cr (III)高100多倍，由于铬的毒性强，且不能被微生物降解，有可能在微生物的作用下转化为金属有机化合物，产生更大的毒性，通过食物链在生物体内富集到相当高的浓度，通过多种途径吸入人体，严重威胁水生生物的生存和人类的健康，已经成为各国治理废水的重点。目前，对污染水体中铬离子的处理技术有沉淀法、吸附法、离子交换法、微生物法、 钛质薄膜蒸发浓缩器法等。通常采用的是将毒性较大的Cr6+还原为毒性较小的Cr3+，然后通过沉淀法除去Cr3+。纳米TiO2光催化法还原脱除水中络离子，铬离子的脱除率最高可达88. 41%，回收利用简单，但极易受pH的影响，对铬离子的吸附不稳定；稻草秸杆可将Cr(VI)从溶液中去除，且还可将其转化成低毒的Cr，但受温度、pH值的影响；以根霉吸附水体中的重金属铬，Cr(VI)的生物吸附不受温度的影响，其去除率可达95%，但溶液的pH值会影响其吸附效果。然而这些技术都针对于含铬污水排放之前工厂的内部处理，对于被工厂处理过的低浓度含铬废水的生态净化技术还远远不足。其实，水生植物对水中的重金属有吸附作用，可把水中的重金属富集在植物的组织中，可以通过控制需净化水体的物理、化学性状，使植物能最有效地从水中吸收重金属，降低水中的重金属浓度，达到水体净化的目的。假稻的根茎对Cr3+有较强的富集能力及耐受性，其对铬的生物富集系数为57. 30 ;水葫芦对污水中的铬有很强的富集作用达到几十万倍；海藻对铬的富集作用很强，其浓缩系数可达120000。但对于工厂达标排放的低浓度含铬废水，目前还没有一种能富集浓缩因子水平很高的生物，因此，我们有必要合成一种基因，将其应用到水生植物中，能够有效地富集污染水体中的低浓度铬，从而有效地降低污染水体中的铬含量。
本发明针对水生植物对达标排放的低浓度含铬废水的富集浓缩因子水平不高，提供了一种基因的合成方法，将该耐铬拟球蛋白基因注射到水体中槐叶萍的根部，使得槐叶萍能产生一种能与水体中的低浓度铬结合能力相当强的物质，导致其对低浓度铬具有富集浓缩作用，生物富集系数达到几千或几万，从而把水环境中的低浓度铬去除，解决了含铬废水的生态净化问题。本发明所采用的原料为金鱼藻、氯化钙、氯化钾、半知菌、鱼孢菌、培养基，通过提取金鱼藻中耐铬基因片段、体外DNA重组、重组DNA导入受体细胞、筛选获得含耐铬拟球蛋白基因的细胞，该蛋白基因细胞与氯化钠以一定的质量比，注射到水体中槐叶萍的根部，使得槐叶萍对铬的生物浓缩达到几千甚至几万，从而最大程度地去除水中低浓度铬。本发明采用的技术方案是一种富集污染水体中铬的基因的合成方法，该方法采用金鱼藻、氯化钙、氯化钾、半知菌、鱼孢菌、培养基为原料，通过提取金鱼藻中耐铬基因片段、体外DNA重组、重组DNA导入受体细胞、筛选获得含耐铬拟球蛋白基因的细胞，该蛋白基因细胞与氯化钠以一定的质量t匕,注射到水体中槐叶萍的根部。本发明中单胞球蛋白的生物制剂的合成过程 (I)培养基的制备 以质量计，葡萄糖8 10g、磷酸氢二钾0.2、.5g、硫酸镁O. l、.2g、琼脂l(Tl2g、氯化钠O. 8 l.Og、硫酸镁O. I、. 3g、磷酸氢二钾O. 3、. 5g 牛肉膏5. (Γ6. Og 蛋白胨7. (TlO. Og;将上述物质溶解，加蒸馏水定容至IOOOmL,分装、在高压蒸汽灭菌锅内杀菌，杀菌条件为压力105Kpa ;温度120° C ;时间:20 30min，备用； (2)耐铬DNA片段提取 从金鱼藻细胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性内切酶切割DNA分子，获得耐铬基因的DNA序列； (3)体外DNA重组
从半知菌细胞中提取质粒作为运载体，用BgI II型限制性内切酶切割形成开环质粒，加入适当的DNA连接酶，将耐铬基因连接在质粒环上，形成一个重组DNA分子；
(4)重组DNA导入受体细胞与筛选
将重组得到的DNA导入用CaCl2处理的鱼孢菌中，接种到15 20mL的培养基中，置于生物培养箱中培养，温度控制在37 37. 3° C，培养时间为15 18h ;再将该培养液转移到50mL预冷的无菌离心管中，在4飞° C下以30(T350r/min的转速离心2 3h，除去上层清液；再用3 5mL 0. ImoVLCaCl2溶液洗涤沉淀，静置l(Tl5min，再4 6° C下以20(T400r/min的转速培养35 45min，滤去上层清液，获得细胞沉淀；并筛选含耐铬基因的受体细胞，保存于4 6° C下备用。一种富集污染水体中低浓度铬的基因的使用方法将该耐铬拟球蛋白基因的细胞以体积比I :4 8溶解于0. 05mo/L氯化钠溶液中，其中，耐铬拟球蛋白基因的浓度为0. 20g/L 0. 25g/L，注射4 6mL于槐叶萍的根部，给药期为15天，三天注射一次，35 45天后检测槐叶萍和水体中的铬含量。本发明制备得到的耐铬拟球蛋白基因，其特征在于，外观为白色粉末状，溶解度为99. 99%，半衰期为20天，给药周期为5天，用量为0. 20g/L 0. 25g/L。本发明制备得到的耐铬拟球蛋白基因，将其注射到水体中槐叶萍的根部，使得槐叶萍对铬的生物浓缩达到几千甚至几万，富集浓缩因子达到5120(Γ82000，周围水环境中的铬浓度小于0. lppm，解决了含铬废水的生态净化问题。本发明的有益效果是
(O.溶解度为99. 99%，半衰期为20天，给药周期为5天，用量为0. 20g/L 0. 25g/L ；
(2).成本低，操作简单，不会带来二次污染；
(3).槐叶萍对铬的富集浓缩因子达到51200 82000，水体中铬含量从0.3 0. 5mg/L降到浓度小于0. lppm。

本发明所采用的原料为以金鱼藻、氯化钙、氯化钾、半知菌、鱼孢菌、培养基为原料，通过提取金鱼藻中耐铬基因片段、体外DNA重组、重组DNA导入受体细胞、筛选获得含耐铬拟球蛋白基因的细胞，该蛋白基因细胞与氯化钠以一定的质量比，注射到水体中槐叶萍的根部，使得槐叶萍对铬的富集浓缩因子达到5120(Γ82000，水体中铬浓度小于O. lppm。本发明具体合成步骤
(1)培养基的制备
以质量计，葡萄糖8 10g、磷酸氢二钾0.2、.5g、硫酸镁O. l、.2g、琼脂l(Tl2g、氯化钠O. 8 l.Og、硫酸镁O. I、. 3g、磷酸氢二钾O. 3、. 5g 牛肉膏5. (Γ6. Og 蛋白胨7. (TlO. Og;将上述物质溶解，加蒸馏水定容至IOOOmL,分装、在高压蒸汽灭菌锅内杀菌，杀菌条件为压力105Kpa ;温度120° C ;时间:20 30min，备用；
(2)耐铬DNA片段提取
从金鱼藻细胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性内切酶切割DNA分子，获得耐铬基因的DNA序列；
(3)体外DNA重组
从半知菌细胞中提取质粒作为运载体，用BgI II型限制性内切酶切割形成开环质粒，加入适当的DNA连接酶，将耐铬基因连接在质粒环上，形成一个重组DNA分子；
(4)重组DNA导入受体细胞与筛选
将重组得到的DNA导入用CaCl2处理的鱼孢菌中，接种到15 20mL的培养基中，置于生物培养箱中培养，温度控制在37 37. 3° C，培养时间为15 18h ;再将该培养液转移到50mL预冷的无菌离心管中，在4飞° C下以30(T350r/min的转速离心2 3h，除去上层清液；再用3 5mL 0. ImoVLCaCl2溶液洗涤沉淀，静置l(Tl5min，再4 6° C下以20(T400r/min的转速培养35 45min，滤去上层清液，获得细胞沉淀；并筛选含耐铬基因的受体细胞，保存于4 6° C下备用。一种富集污染水体中低浓度铬的基因的使用方法将该耐铬拟球蛋白基因的细胞以
体积比I :4 8溶解于0. 05mo/L氯化钠溶液中，其中，耐铬拟球蛋白基因的浓度为0. 20g/L 0. 25g/L，注射4 6mL于槐叶萍的根部，给药期为15天，三天注射一次，35 45天后检测槐叶萍和水体中的铬含量。实例I
(I)培养基的制备
以质量计，取葡萄糖8g、磷酸氢二钾0. 2g、硫酸镁0. lg、琼脂10g、氯化钠0. 8g、硫酸镁0. lg、磷酸氢二钾0.3g、牛肉膏5. Og、蛋白胨7. 0g，将上述物质溶解，加蒸馏水定容至IOOOmL,分装、在高压蒸汽灭菌锅内杀菌，杀菌条件为压力105Kpa ;温度120° C ；时间20min,备用。(2)耐铬DNA片段提取
从金鱼藻细胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性内切酶切割DNA分子，获得耐铬基因的DNA序列。⑶体外DNA重组
从半知菌细胞中提取质粒作为运载体，用BgI II型限制性内切酶切割形成开环质粒，、加入适当的DNA连接酶，将耐铬基因连接在质粒环上，形成一个重组DNA分子。(4)重组DNA导入受体细胞与筛选
将重组得到的DNA导入用CaCl2处理的鱼孢菌中，接种到15mL的培养基中，置于生物培养箱中培养，温度控制在37° C，培养时间为15h ;再将该培养液转移到50mL预冷的无菌离心管中，在4° C下以300r/min的转速离心2h,除去上层清液；再用3mL O. Imol/LCaCl2溶液洗涤沉淀，静置lOmin，再4° C下以200r/min的转速培养35min，滤去上层清液，获得细胞沉淀；并筛选含耐铬基因的受体细胞，保存于4° C下备用。将该耐铬拟球蛋白基因的细胞以体积比I :4溶解于0.05mo/L氯化钠溶液中，其中，耐铬拟球蛋白基因的浓度为O. 20g/L，注射4mL于槐叶萍的根部，给药期为15天，三天注射一次，35天后检测槐叶萍和水体中的铬含量。结果表明该基因蛋白在槐叶萍内对铬的浓缩因子达到51200，检测不到水体中铬含量。
实例2
(I)培养基的制备
以质量计，葡萄糖9g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁O. 15g、琼脂llg、氯化钠0.9g、硫酸镁O. 2g、磷酸氢二钾O. 35g牛肉膏5. 5g蛋白胨8. 0g，将上述物质溶解，加蒸馏水定容至IOOOmL,分装、在高压蒸汽灭菌锅内杀菌，杀菌条件为压力105Kpa;温度120° C ;时间25min，备用。(2 )耐铬DNA片段提取
从金鱼藻细胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性内切酶切割DNA分子，获得耐铬基因的DNA序列。(3)体外DNA重组
从半知菌细胞中提取质粒作为运载体，用BgI II型限制性内切酶切割形成开环
质粒，加
入适当的DNA连接酶，将耐铬基因连接在质粒环上，形成一个重组DNA分子。(4)重组DNA导入受体细胞与筛选
将重组得到的DNA导入用CaCl2处理的鱼孢菌中，接种到7mL的培养基中，置于生物培养箱中培养，温度控制在37. 1° C，培养时间为16h ;再将该培养液转移到50mL预冷的无菌离心管中，在5° C下以320r/min的转速离心2. 5h,除去上层清液；再用4mL0. lmol/L CaCl2溶液洗涤沉淀，静置12min，再5° C下以250r/min的转速培养40min，滤去上层清液，获得细胞沉淀；并筛选含耐铬基因的受体细胞，保存于5° C下备用。将该耐铬拟球蛋白基因的细胞以体积比I :5溶解于0. 05mo/L氯化钠溶液中，其中，耐铬拟球蛋白基因的浓度为0. 21g/L， 注射5mL于槐叶萍的根部，给药期为15天，三天注射一次，38天后检测槐叶萍和水体中的铬含量。结果表明该基因蛋白在槐叶萍内对铬的浓缩因子达到58500。实例3
(I)培养基的制备
以质量计，葡萄糖9g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0. 15g、琼脂llg、氯化钠0.9g、硫酸镁0. 2g、磷酸氢二钾0.4g牛肉膏5.6g蛋白胨9. 0g，将上述物质溶解，力口蒸馏水定容至lOOOmL，分装、在高压蒸汽灭菌锅内杀菌，杀菌条件为压力105Kpa ;温度120。C ;时间28min，备用。(2 )耐铬DNA片段提取
从金鱼藻细胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性内切酶切割DNA分子，获得耐铬基因的DNA序列。(3)体外DNA重组
从半知菌细胞中提取质粒作为运载体，用BgI II型限制性内切酶切割形成开环
质粒，加
入适当的DNA连接酶，将耐铬基因连接在质粒环上，形成一个重组DNA分子。(4)重组DNA导入受体细胞与筛选
将重组得到的DNA导入用CaCl2处理的鱼孢菌中，接种到18mL的培养基中，置于生物培养箱中培养，温度控制在37. 2° C，培养时间为17h ;再将该培养液转移到50mL预冷的无菌离心管中，在5° C下以335r/min的转速离心2. 5h,除去上层清液；再用4mLO. lmol/L CaCl2溶液洗漆沉淀,静置14min,再6° C下以300r/min的转速培养40min,滤去上层清液，获得细胞沉淀；并筛选含耐铬基因的受体细胞，保存于5° C下备用。将该耐铬拟球蛋白基因的细胞以体积比I :6溶解于O. 05mo/L氯化钠溶液中，其中，耐铬拟球蛋白基因的浓度为O. 23g/L，注射5mL于槐叶萍的根部，给药期为15天，三天注射一次，42天后检测槐叶萍和水体中的铬含量。结果表明该生物制剂在黑鱼体内对氮的浓缩因子达到69500。


本发明公开了一种富集污染水体中低浓度铬含量的基因蛋白的合成及其应用，该方法采用金鱼藻、氯化钙、氯化钾、半知菌、鱼孢菌、培养基为原料，通过提取金鱼藻中耐铬基因片段、体外DNA重组、重组DNA导入受体细胞、筛选获得含耐铬基因的细胞，即耐铬拟球基因蛋白。本发明的使用方法为将该耐铬拟球蛋白基因的细胞以体积比14~8溶解于0.05mo/L氯化钠溶液中，其中，耐铬拟球蛋白基因的浓度为0.20g/L~0.25g/L，注射4~6mL于槐叶萍的根部，给药期为15天，三天注射一次。本发明通过将耐铬拟球基因蛋白注射到水体中槐叶萍的根部，35天后，槐叶萍对铬的富集浓缩因子达到51200~82000。