一种环黄芪醇的制备方法及其用途[0002]癌症是危害人类健康的三大疾病之一，其发病率及死亡率在某些国家已上升到第I位，在我国每年大约有350万人患癌，250万人死于癌症，而且还在不断的增长，并逐渐呈年轻化趋势。癌症每年给我国造成的直接经济损失逾千亿元。因此，研制抗癌药物是改善人类生活质量的一个重要方式，也是是广大医药工作者面临的重大课题之一。目前开发成功的很多抗癌药物，虽然有较明显治疗效果，但其毒副反应也显而易见，它在杀伤癌细胞的同时，也杀害了人体正常细胞，伴随着药物治疗而来的，是患者胃肠道功能紊乱、肝肾功能的损伤、白细胞数目减少和免疫力降低等毒副作用；使抗癌药物的临床应用受到限制。因此，目前抗癌药物研究，一方面继续寻找杀死癌细胞的治疗药物外，开发增强抗癌药物的疗效，降低其毒副作用为主要功效的抗癌辅助药物也越来越受到重视。[0003]黄芪皂苷，是黄芪属(Astragalus)植物中的一类活性成分，是黄芪药效物质基础重要药组成之一，是一类对人类健康有显著保健作用的天然活性成分，具有调节机体免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、保护心脑血管、保护肝肾、促进骨髓造血等作用。当其与抗肿瘤化疗药物配合使用时，能较好的改善人体对化疗药物的耐受性，提高癌症患者的生存质量；但由于黄芪皂苷的相对分子质量较大、具有溶解惰性等原因使其在体内的相对生物利用度不足，限制了其作为药物的开发和推广。
[0004]本发明的第一目的是提供一种环黄芪醇的制备方法，该种方法反应温和、操作简便、收率高、产品质量好、便于大规模工业化生产。 [0005]本发明的第二目的是提供环黄芪醇的用途，即在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。以其为药物活性成分制得的抗癌辅助治疗药物，能增强抗癌药物疗效、降低抗癌药物毒性、预防和治疗抗癌药物治疗引起的白细胞降低的抗癌辅助治疗作用。[0006]本发明实现其第一目的，所采用的第一种技术方案是，一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤:[0007]A、氧化
[0008]将黄芪甲苷加入溶剂配制成黄芪甲苷含量为0.001-0.05mol/L的悬浊液；加酸调节悬浊液的pH至3-6，向悬浊液中加入氧化剂，在5-35°C下避光反应12-96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:2-1:15 ;随后加碱调pH至7-10，减压浓缩至无醇味，再经过滤或萃取得到氧化产物；
[0009]B、还原
[0010]将A步得到的氧化产物加入溶剂分散成溶液或悬浊液；加入的溶剂与A步的黄芪甲苷的质量比为1:0.7-1:40 ;然后加入硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂,还原反应12-48h后，再加入乙酸或乙酸水溶液调节反应液的pH至4-6酸性以终止还原反应；其中还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2-1:8 ;
[0011]C、水解
[0012]向步骤B的反应液加入强酸，在10_60°C下静置或搅拌反应6_96h ;加入的强酸与反应液的质量比为0.5-3:100 ；
[0013]D、萃取；
[0014]向步骤C得到的反应液中加碱、调pH至中性，再采用与反应液等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0015]
[0016]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶中的一种或多种方法进行纯化，即得环黄芪醇。
[0017]本发明实现其第一目的，所采用的第二种技术方案是，一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤:
[0018]A、氧化
[0019]将黄芪皂苷加入溶剂配制成黄芪皂苷含量为0.6-50g/L的悬浊液；加酸调节悬浊液的PH至3-6，再向悬浊液中加入氧化剂，在5-35°C下避光反应12-96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂 苷与氧化剂的质量比为3:1-1:5 ;随后加碱调pH至7-10，减压浓缩至无醇味，再经过滤或萃取得到氧化产物；
[0020]B、还原
[0021]将A步得到的氧化产物加入溶剂分散成溶液或悬浊液，加入的溶剂与A步的黄芪阜苷的质量比为1:0.6-1:50 ;然后加入硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂,还原反应12-48h后，再加入乙酸或乙酸水溶液调节反应液的pH至4-6酸性以终止还原反应；其中还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:1.5-1:20 ；
[0022]C、水解
[0023]向步骤B的反应液加入强酸，在10_60°C下静置或搅拌反应6_96h ;加入的强酸与反应液的质量比为0.5-3:100 ；
[0024]D、萃取
[0025]向步骤C得到的反应液中加入碱，调pH至中性，采用与反应液等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0026]
[0027]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶中的一种或多种方法进行纯化，即得环黄芪醇。
[0028]与现有技术相比，本发明的有益成果是:
[0029]一、黄芪甲苷或黄芪皂苷通过液相中的氧化、还原、水解、萃取和纯化反应，使黄芪甲苷或黄芪皂苷降解得到较小分子量的环黄芪醇，并有效去除其它成分，获得的环黄芪醇的品质高。测试表明本发明方法制备的环黄芪醇的纯度在95%以上。
[0030]二、整个制备过程均在液相中进行、最高温度不超过80度，其工艺条件温和、收率高、操作简便、对操作人员技术要求低，适合工业化推广。
[0031]上述步骤A的黄芪皂苷为环黄芪醇类皂苷的含量不低于50%的黄芪皂苷。[0032]当环黄芪醇类皂苷的含量低于50%时，混杂有较多的黄酮苷等成分，在反应时会发生较多的副反应，从而影响制备物的纯度。
[0033]上述步骤A中的溶剂选用水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合液。
[0034]这三种溶剂能较好的溶解黄芪皂苷，且其价廉易得。
[0035]上述步骤A中的氧化剂为高碘酸、高碘酸钠或高碘酸钾。
[0036]这三种氧化剂既能对黄芪皂苷中的糖部分进行氧化使其开链，以便于后续的水解去除，又不影响苷元(环黄芪醇)部分，从而能很好地提取出环黄芪醇。
[0037]上述步骤A中的萃取的具体操作是:加入与减压浓缩后的反应液等体积的正丁醇萃取2-4次；合并正丁醇萃取液，水洗2次，再蒸干正丁醇。
[0038]使用正丁醇萃取，能够有效的去除步骤A中产生的小分子杂质，另外可去除未完全反应的氧化剂。
[0039]上述步骤B中的溶剂为体积分数为0-50%的甲醇水溶液或乙醇水溶液。
[0040]使用体积分数为0-50%的甲醇水溶液或乙醇水溶液,能够较好的溶解和分散A步的氧化产物，且对D步的萃取无影响。
[0041]上述步骤C中加入的强酸为硫酸、盐酸或硝酸。
[0042]这三种强酸价廉易得，并能很好的进攻糖苷键使其断裂，从而水解得到环黄芪醇。下面结合
`[0043]本发明实现其第二发明目的所采用的技术方案是，上述制备方法得到的环黄芪醇的用途是，环黄芪醇在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。
[0044]上述用途的具体应用方法是:将环黄芪醇作为活性成分，添加制药辅剂采用药物制剂技术，制成抗癌辅助治疗用的固体口服制剂或液体口服制剂。
[0045]所述的固体口服制剂优选为普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂或缓控释制剂。所述的缓控释制剂优选为缓控释片剂、颗粒或胶囊。
[0046]所述的液体口服制剂优选为口服液或乳剂。
[0047]采用本发明方法制得的环黄芪醇，其品质高，纯度在95%以上，将其作为药效成分制成抗癌辅助治疗药物，药效实验表明其抗癌辅助治疗效果显著:
[0048]与单独使用抗癌药物相比，在对小鼠H22肝癌和S180肉瘤的抑制率增加20%以上；同时明显改善由于单独使用抗癌药物引起的胸腺指数、脾指数、白细胞数下降，与单独使用抗癌药物相比，这些参数改善50%以上。在相同效果下，作为抗癌辅助药物，其用药量仅为黄芪皂苷的30%及以下。
[0049]高纯度环黄芪醇用于抗癌辅助药物效果好的可能机理是:与黄芪皂苷相比，环黄芪醇具有相对较小的分子质量和较强的亲脂性，其在生物膜渗透和胃肠道吸收方面具有优势，有更好的生物利用度，从而有更好的抗癌辅助治疗效果。
【具体实施方式】
[0050]实施例1
[0051]A、氧化
[0052]取780mg(约lmmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪甲苷含量为0.01mol/L的悬池液,加盐酸调节悬池液的pH至3-4,向悬池液中加入氧化剂-高碘酸钠在20°C下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:10 ;随后加Na2CO3调pH至7_8，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0053]B、还原
[0054]将A步得到的氧化产物加入30%的甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的30%甲醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:0.7 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应24h后，加入50%乙酸至反应液pH到4-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2。
[0055]C、水解
[0056]向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为0.5:100，在501:下静置反应48h ；
[0057]D、萃取；
[0058]向步骤C得到的反应液中加入K2CO3，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0059]
[0060]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化:用适量的CH2Cl2-丙酮溶解后，然后置于10°c条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
[0061]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为99%。
[0062]实施例2
[0063]A、氧化
[0064]取1.5g(约2mmol)黄苗甲苷作为原料，往其中加入水配置成黄苗甲苷含量为
0.001mol/L的悬池液,加硫酸调节悬池液的pH至4-5,向悬池液中加入氧化剂-高碘酸
在5°C下避光反应96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:2 ;随后加NaOH调pH至8-9，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼多次后，得到氧化产物
[0065]B、还原
[0066]将A步得到的氧化产物用水分散成悬浊液，加入的水与A步的黄芪甲苷的质量比为1:20 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应12h后,加入50%乙酸至反应液pH到4-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:4。
[0067]C、水解
[0068]向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的质量比为2:100，在30°C下搅拌反应72h ；
[0069]D、萃取；
[0070]向步骤C得到的反应液中加入NaHCO3,调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。 [0071]
[0072]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化:用适量的石油醚-丙酮溶解后，然后置于4°C条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。[0073]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为98%。
[0074]实施例3
[0075]A、氧化
[0076]取800mg (Immol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入20%甲醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.05mol/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在25°C下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:15 ;随后加KHCO3调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0077]B、还原
[0078]将A步得到的氧化产物加入50%的甲醇水溶液分散成溶液，加入的50%甲醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:40 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应24h后,加入50%乙酸至反应液pH到4-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:8。
[0079]C、水解
[0080]向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为0.5:100，在60°C下搅拌反应12h ；
[0081]D、萃取；
[0082]向步骤C得到的反应液中加氨水，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0083]
[0084]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化:用适量的丙酮溶解后，然后置于-4°C条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
[0085]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为98%。
[0086]实施例4:
[0087]A、氧化
[0088]取78.5mg(0.lmmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入50%甲醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.05mol/L的悬浊液，加甲酸调节悬浊液的pH至3_4，向悬浊液中加入氧化剂一高碘酸钾在20°C条件下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:5 ;随后加Na2COjfpH至7-8，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼多次后，得到氧化产物。
[0089]B、还原
[0090]将A步得到的氧化产物加入20%的乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的20%乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:10 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应12h后，加入50%乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为 1:8。
[0091]C、水解
[0092]向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的重量比为1:100，在40°C下搅拌反应12h。
[0093]D、萃取；[0094]向步骤C得到的反应液中加入KHCO3,调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0095]
[0096]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化:用适量的甲醇溶解后，滴加水使水的比例为10%(v/v)，然后置于0°C冰水浴条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
[0097]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为97%
[0098]实施例5:
[0099]A、氧化
[0100]取1.5g(约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入乙醇配置成黄芪甲苷含量为0.05mol/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在5°C下避光反应96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为I: 13 ;随后加NaHCO3调pH至8_9，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
[0101]B、还原
[0102]将A步得到的氧化产物加入水溶解分散成悬浊液，加入的水与A步的黄芪甲苷的质量比为1:10 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后,加入乙酸至反应液pH到
4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的`摩尔比为1:2。
[0103]C、水解
[0104]向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为1:100，在15°C下静置反应96h ；
[0105]D、萃取；
[0106]向步骤C得到的反应液中加氨水，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0107]
[0108]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析纯化:洗脱剂选用石油醚--乙酸乙酯=5:1~1:5，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0109]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
[0110]实施例6:
[0111]A、氧化
[0112]取400mg(约0.5mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入40%乙醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.005mol/L的悬浊液，加盐酸调节悬浊液的pH至3_4，向悬浊液中加入氧化剂一高碘酸钾在5°C下避光反应96小时，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:4;然后加入乙二醇终止氧化；随后加NaOH调pH至9-10，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取2次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0113]B、还原
[0114]将A步得到的氧化产物加入50%乙醇水溶液分散成溶液，加入的乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:15 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后,加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:5。
[0115]C、水解
[0116]向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为3:100，在15°C下搅拌反应96h ；
[0117]D、萃取；
[0118]向步骤C得到的反应液中加Κ0Η，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0119]
[0120]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析结合重结晶纯化:洗脱剂选用石油醚:丙酮=5:1~1:3，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，用适量氯仿-甲醇溶解，置于4°C下静置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0121]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为98%。
[0122]实施例7:
[0123]A、氧化
[0124]取6g(约4mm ol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪甲苷含量为
0.001mol/L的悬池液,加盐酸调节悬池液的pH至3-4,向悬池液中加入氧化剂-高碘酸
钾在15°C下避光反应72小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:10 ;随后加NaHCOjf pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0125]B、还原
[0126]将A步得到的氧化产物加入10%甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的10%甲醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:30 ;然后加入硼氢化钾作为还原剂,还原反应48h后,加入乙酸至反应液PH到5-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2。
[0127]C、水解
[0128]向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为3:100，在10°C下搅拌反应6h ；
[0129]D、萃取；
[0130]向步骤C得到的反应液中加Κ0Η，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0131]
[0132]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析纯化:洗脱剂选用乙酸乙酯:甲醇=100:0.1~10:1，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0133]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
[0134]实施例8:
[0135]A、氧化
[0136]取1.5g (约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入体积比为1:1的甲醇乙醇溶液配置成黄芪甲苷含量为0.01mol/L的悬浊液，加乙酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂一高碘酸在25°C下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:7 ;随后加KOH调pH至9-10，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0137]B、还原
[0138]将A步得到的氧化产物加入5%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的5%乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:40。然后加入硼氢化钾作为还原剂,还原反应24h后,加入乙酸至反应液PH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:8。
[0139]C、水解
[0140]向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为1:100，在60°C下静置反应36h ；
[0141]D、萃取；
[0142]向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0143]
[0144]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化:洗脱剂选用甲醇:水=50: 50~100: 0，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0145]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
[0146]实施例9:
[0147]A、氧化
[0148]取1.5g(约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入10%乙醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.03mol/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在25°C下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:3 ;随后加KOH调pH至9-10，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
[0149]B、还原
[0150]将A步得到的氧化产物加入40%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的40%乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:1。然后加入硼氢化钾作为还原剂,还原反应48h后,加入乙酸至反应液PH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:3。
[0151]C、水解
[0152]向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为2:100，在20°C下搅拌反应60h ；
[0153]D、萃取；
[0154]向步骤C得到的反应液中加氨水，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0155]
[0156] 将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化，洗脱剂选用乙腈:水=30:70~80:20，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，SP得纯度大于90%的环黄芪醇。[0157]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
[0158]实施例10:
[0159]A、氧化
[0160]取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入20%乙醇水溶液配置成黄芪皂苷含量为0.6g/L的悬浊液，加乙酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在20°C下避光反应24小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为3:1 ;随后加NaOH调pH至8_9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0161]B、还原
[0162]将A步得到的氧化产物加入10%甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的10%甲醇水溶液与A步的黄芪阜苷的质量比为1:10 ;然后加入硼氢化钾作为还原剂,还原反应12h后,加入30%乙酸至反应液pH到5-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:1.5。
[0163]C、水解
[0164]向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为1:100，在60°C下搅拌反应6h。
[0165]D、萃取； [0166]向步骤C得到的反应液中加Κ0Η，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0167]
[0168]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化:用适量的乙酸乙酯-乙醇溶解后，然后置于-10°C条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
[0169]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
[0170]实施例11:
[0171]A、氧化
[0172]取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪皂苷含量为30g/L的悬浊液，加甲酸调节悬浊液的PH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂一高碘酸钠在25°C下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:1 ;随后加氨水调PH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0173]B、还原
[0174]将A步得到的氧化产物加入50%甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的50%甲醇水溶液与A步的黄芪阜苷的质量比为1:0.6。然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄苗阜苷的质量比为1:10。
[0175]C、水解
[0176]向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为2:100，在50°C下搅拌反应12h。[0177]D、萃取；
[0178]向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0179]
[0180]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化:用适量的CH2Cl2-甲醇溶解后，然后置于-4°C条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
[0181]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
[0182]实施例12:
[0183]A、氧化
[0184]取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入30%乙醇水溶液配置成黄芪皂苷含量为IOg/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钠在20°C下避光反应24小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:5 ;随后加NaOH调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0185]B、还原
[0186]将A步得到的氧化产物加入水分散成悬浊液，加入的水与A步的黄芪皂苷的质量比为1:50 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应24h后,加入30%乙酸水溶液至反应液pH到5-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:20。
`[0187]C、水解
[0188]向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的质量比为3:100，在20°C下静置反应72h。
[0189]D、萃取；
[0190]向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0191]
[0192]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析结合重结晶纯化:用200~300目的正相硅胶柱层析纯化，样品与硅胶的质量比为1:7，洗脱剂选用CH2Cl2:丙酮=7:1~1:1，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，用适量石油醚-丙酮溶解，置于0°C下放置48h，析晶，过滤干燥即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0193]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为97%。
[0194]实施例13:
[0195]A、氧化
[0196]取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪皂苷含量为50g/L的悬浊液，加硫酸调节悬浊液的PH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂一高碘酸在25°C下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:3 ;随后加氨水调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
[0197]B、还原
[0198]将A步得到的氧化产物加入30%乙醇水溶液分散成溶液，加入的30%乙醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:5。然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:6。
[0199]C、水解
[0200]向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为1.5:100，在60°C下静置反应36h。
[0201]D、萃取；
[0202]向步骤C得到的反应液中加NaHCO3，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0203]
[0204]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析纯化:洗脱剂选用CH2Cl2:甲醇=100:1~10:1，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0205]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
[0206]实施例14:
[0207]A、氧化
[0208]取IOg黄芪皂苷作为原料，往其中加入30%乙醇水溶液配置成黄芪皂苷含量为30g/L的悬浊液，加乙酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在35°C下避光反应12小时 ，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为I: 5 ;随后加氨水调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
[0209]B、还原
[0210]将A步得到的氧化产物加入50%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的50%乙醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:2，此时溶液为悬浊液；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入70%乙酸水溶液至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:15。
[0211]C、水解
[0212]向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为1:100，在10°C下搅拌反应12h。
[0213]D、萃取；
[0214]向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0215]
[0216]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化:洗脱剂选用甲醇:水==50:50~100:0，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂；再即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0217]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
[0218]实施例15: [0219]A、氧化
[0220]取20g黄芪皂苷作为 原料，往其中加入体积比1:2的甲醇乙醇溶液配置成黄芪皂苷含量为0.6g/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在5°C下避光反应96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:2 ;随后加Na2COjfpH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
[0221]B、还原
[0222]将A步得到的氧化产物加入加入10%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的10%乙醇水溶液与A步的黄芪阜苷的质量比为1:0.6 ;然后加入硼氢化钠作为还原剂,还原反应24h后,加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄苗阜苷的质量比为 1:15。
[0223]C、水解
[0224]向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的质量比为3:100，在40°C下搅拌反应96h。
[0225]D、萃取；
[0226]向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取53次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
[0227]
[0228]将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化:洗脱剂选用乙腈:水=30: 70~80:20，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
[0229]经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
[0230]药效实验一:(环黄芪醇对化疗药物的增效作用)
[0231]1、实验材料
[0232]1.1药物及试剂:环黄芪醇，由实施例13所述制备方法制得，经过检测，纯度为95%，临用前用0.5%CMC-Na溶液配成母液10mg/ml，除菌备用。5-氟尿嘧啶(5-FU)针剂，批号:20130412，，IOml/支，上海旭东海普药业有限公司。IL-2和TNF-α放免试剂盒，北京东亚放射免疫研究所。
[0233]1.2动物及瘤株
[0234]昆明种小鼠，6~8周龄,体重18~22g,购自四川大学实验动物中心,合格证号:SCXK (川)2012-0010。雌雄兼用，每批实验采用同一性别。
[0235]1.3细胞株:小鼠肝癌H22，小鼠肉瘤S180，购自四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室。
[0236]1.4仪器与器械
[0237]无菌室和超净工作台；
[0238]血象分析仪； [0239]外科手术器械；
[0240]消毒用碘酒、酒精。
[0241]2、试验内容
[0242]荷瘤鼠模型的建立:小鼠肝癌H22、肉瘤S180瘤株，腹腔传代接种。取于昆明鼠腹腔内接种七天的上述荷瘤小鼠，消毒腹部皮肤后，抽取腹水，离心后弃上清，无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度为2X IO7个细胞/ml。消毒鼠腋下皮肤，每只小鼠于腋下注射瘤细胞悬液0.2ml,各瘤株分别接种90只。
[0243]接瘤后第二天随机分为如下9组并给药:
[0244]空白对照组(模型组):给予等量辅料的0.5%CMC-Na溶液
[0245]5-FU 低剂量组:5-FU5mg/kg
[0246]5-FU低剂量+药物高剂量组:给予5-FU5+环黄芪醇30mg/kg
[0247]5-FU低剂量+药物中剂量组:给予5-FU5+环黄芪醇15mg/kg
[0248]5-FU低剂量+药物低剂量组:给予5-FU5+环黄芪醇5mg/kg
[0249]5-FU 高剂量组:5_FU15mg/kg
[0250]5-FU高剂量+药物高剂量组:给予5-FU15+环黄芪醇30mg/kg
[0251]5-FU高剂量+药物中剂量组:给予5-FU15+环黄芪醇15mg/kg
[0252]5-FU高剂量+药物低剂量组:给予5-FU15+环黄芪醇5mg/kg
[0253]5-FU腹腔注射给药，其余均为灌胃给药，每日I次，连续给药10天。末次给药24h后颈椎脱白处死小鼠，称体重，计算体重差(结束体重-开始体重)，剥取瘤组织并称重，计算抑瘤率。
[0254]抑瘤率=(1-模型对照组平均瘤重/实验组平均瘤重)X 100% ；
`[0255]胸腺(脾)指数=[胸腺(脾)重量/体重]X 100%。
[0256]末次给药后脱颈椎处死小鼠，取瘤并称重，比较模型对照组、单用5-FU、5_FU与环黄芪醇不同剂量联合用药各组的抑瘤率，观察环黄芪醇对化疗药物的增效作用。
[0257]3、试验结果
[0258]3.1环黄芪醇对5-FU治疗小鼠H22肝癌的增效作用
[0259]以下的表1为试验得到的环黄芪醇对5-FU治疗小鼠H22肝癌的增效作用结果。表I表明，5-FU的5mg/kg剂量组和15mg/kg剂量组的对小鼠H22肝癌的抑瘤率分别为25.58%和46.98%，而加用环黄芪醇后，明显提高了 5-FU的抑瘤效果。联合治疗组与相应剂量5-FU组比较有显著性差别(高剂量和中剂量组:P < 0.01，低剂量组:P < 0.05)。表明环黄芪醇对5-FU具有明显的增效作用。
[0260]表1:5_FU与环黄芪醇联合应用对小鼠H22肝癌生长的抑制作用(I±S,11=10)
[0261]