蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于中医药【技术领域】，尤其是涉及一种蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用。[0002]血管新生是多种因素共同作用的结果。以炎性病灶部位的血管新生为例，新生血管的形成分3个步骤:炎性介质激活内皮细胞；蛋白酶降解血管内皮基质；内皮细胞趋化及新生血管发生。VEGF是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)的简称，早期亦称作血管通透因子(vascular permeability factor),是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。VEGF是主要的血管新生因子，其能够刺激血管内皮细胞存活、移动、增殖。在血管的成熟过程中，血管生成素(angiopoietins,Ang) I负责招募周围的间充质细胞并促进其分化成血管平滑肌细胞，显著地增强了新生血管的血管稳定性。因此VEGF介导了内皮细胞的移行和增殖，Ang，特别是Ang-1促进了血管壁的稳定性，协同行动使得新生血管稳定形成。二者在血管增生中起到了主要的推进作用，[0003]类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性进行性自身免疫性疾病。其病理特点是关节反复的炎症、滑膜细胞“肿瘤样”增生以及由此引起的软骨和骨的破坏，最终导致关节畸形。具体表现为滑膜增生和炎性细胞浸润。类风湿关节炎的滑膜改变可分为炎症期、血管翳形成期和纤维化期。血管翳形成是类风湿关节炎滑膜的重要病理特征，在类风湿关节炎软骨和骨破坏过程中发挥重要作用。关节外表现的主要病理基础为血管炎。类风湿结节是 其特征性表现，结节中心为类纤维素样坏死组织，周围有“栅状”排列的组织细胞，成纤维细胞及巨噬细胞等。VEGF和Ang-1在RA促进了血管翳的形成、促使滑膜炎症产生及破坏骨与软骨，在肿瘤中促进了血管的疯狂生长。[0004]现有的抗血管生成药物非常少且价格昂贵，比如贝伐单抗，其通过与人的血管内皮生长因子(VEGF)结合并阻断血管内皮生长因子(VEGF)生物活性，从而减少了血管的生成。对于类风湿性关节炎而言，生物制剂是目前的主要药物，其能够减少骨破坏，减少激素的用量以及骨质疏松。治疗类风湿关节炎的生物制剂主要包括肿瘤坏死因子(TNF)-Ci拮抗剂、白细胞介素(IL)-1和IL-6拮抗剂、抗CD20单抗以及T细胞共刺激信号抑制剂等，但是这些生物制剂成本高，价格昂贵。[0005]为了对现有技术进行改进，人们进行了长期的探索，提出了各种各样的解决方案。例如，中国专利文献公开了一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用[申请号:CN201110361926.X]，该发明经动物实验证实物理改性后的中华眼镜蛇总毒在(10-3000 μ g/kg)范围内能抑制炎性疼痛、炎性增生和佐剂性关节炎有明显的治疗作用，其能减轻关节肿大，疼痛和关节损伤等症状。[0006]上述方案虽然公开了物理改性后的眼镜蛇蛇毒对治疗抑制炎性疼痛、炎性增生和佐剂性关节炎治疗作用，但治疗的应用范围小，制备过程复杂，需要经过酒精去毒，实用性差，不利于工业化生产和推广。
[0007]本发明的目的是针对上述问题，提供一种易于实施、安全可靠的蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用。
[0008]本发明的另一目的是提供一种质量可控、剂量小、使用方便、安全可靠的含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物。
[0009]本发明再有一目的是提供一种含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物作为治疗相关疾病的应用。
[0010]为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案:蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用。
[0011 ] 在上述的蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用中，所述的蕲蛇蛇毒作为抗血管生成时的VEGF抑制剂。
[0012]在上述的蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用中，所述的蕲蛇蛇毒作为抗血管生成时的Ang-1抑制剂。
[0013]在上述的蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用中，所述的蕲蛇蛇毒作为抗血管生成时的VEGF和Ang-1协同抑制剂。
[0014]新生血管的形成分3个步骤:炎性介质激活内皮细胞；蛋白酶降解血管内皮基质；内皮细胞趋化及新生血管发生。在新生血管发生的初始，VEGF能够刺激血管内皮细胞存活、移动、增殖，是最有效的促血管生长因子，在血管生成过程中起到非常大的作用，通过抑制VEGF能够有效治疗相应的疾病。当血管初生成后还是非常脆弱的，需要一个成熟的过程，而在血管的成熟过程中血管生成素(angiopoietins，Ang) I起到了很大的作用，其主要负责招募周围的间充质细胞并促进其分化成血管平滑肌细胞，显著地增强了新生血管的血管稳定性。Ang-l/Tie-2通路能诱使平滑肌细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞产生趋化效应，促进间充质细胞向平滑肌细胞转化，并且能诱导血清素、基质金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶的分泌，对Ang-1的抑制间接打断了 Ang-1/Tie2的通路，从而使得微血管显著减少。从治疗疾病的角度看，通过破坏血管的成熟也能达到抗血管生成的目的。蕲蛇蛇毒既能用于制备VEGF抑制剂，也能用于Ang-1抑制剂，而VEGF抑制剂和Ang-1抑制剂二者联用，既能够阻止血管的初生成，也能够阻止血管的成熟，二者产生协同作用，抗血管生成的作用更强。在血管生成的不同时期，蕲蛇蛇毒所发挥的作用存在一定差异。显然，在血管生成时期，蕲蛇蛇毒主要起到VEGF抑制剂的作用；在血管生成并成熟过程时期，蕲蛇蛇毒主要起到Ang-1抑制剂的作用；在既有新生血管又有成熟过程中血管时期，蕲蛇蛇毒主要起到VEGF和Ang-1协同抑制的作用。
[0015]一种含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物。
[0016]在上述的含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物中，本药物包括蕲蛇蛇毒和药学上可接受的载体。
[0017] 在上述的含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物中，所述的蕲蛇蛇毒为经过升华干燥形成的冻干粉。真空冷冻干燥技术，简称冻干，又称升华干燥，广泛应用于药品、生物制品、化工及食品工业，对热敏性物质如抗生素、疫苗、血液制品、酶激素及其他生物组织，冻干技术非常适用。因为蕲蛇蛇毒为生物制剂，其还有大量蛋白质，为保证药效，最好采用冻干法制备，以下是冻干法的制备方法:第一步，过滤是去除杂质，得来澄清液，进行冷冻，等结成冰块后再进行干燥。第二步，将冷冻的蛇毒冰块放置于真空干燥器内，进行真空干燥，真空干燥一般在6小时内彻底干燥完。干燥后的蛇毒即成粉末状或块状,五步蛇毒为白色粉状,眼镜蛇毒为淡黄色粉状。干燥后蛇毒含水量不得超过5%,这样的蛇毒即为精制蛇毒冻干粉。
[0018]在上述的含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物中，所述的冻干粉制成含有蕲蛇蛇毒量为0.1-1.0mg/kg体重的注射针剂。
[0019]一种含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物作为治疗相关疾病的应用。
[0020]在上述的含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物作为治疗相关疾病的应用中，所述的相关疾病包括眼内新生血管形成、银屑病、肿瘤、动脉硬化、炎性疾病和子宫内膜异位症、糖尿病并发症。[0021]更进一步，所述的炎性疾病优选风湿性关节炎和类风湿性关节炎。在风湿性关节炎和类风湿性关节炎中，蕲蛇蛇毒除了能够抑制VEGF和Ang-1外，还能够从RA的其他环节来阻断疾病的进程。主要有以下几个方面:第一，RA特征性的病理改变起始于滑膜炎，随着病程的进展，滑膜出现明显增殖，形成具有侵袭性的绒毛，突向关节腔或侵入到软骨和软骨下的骨质，即形成了滑膜血管翳，在其内部有大量的新生血管增生和各种炎性细胞浸润，释放多种水解酶最终使关节破坏、强直、功能完全丧失，在骨破坏的过程中，TNF-α触发炎性细胞因子和粘附分子的表达，激活胶原酶和诱导破骨细胞分化。研究员在研究RA的过程中发现蕲蛇蛇毒对蕲蛇蛇毒在肿瘤坏死因子-α具有良好的抑制作用。第二，在RA研究中，MMPs能够调节细胞外基质组分的降解，尤其在关节炎疾病中对软骨基质的降解起决定因素正常人、进展性骨性关节炎(OA)和RA患者的关节滑膜液中都有MMP (8种)和--ΜΡ (4种)的特征性表达，并且MMP含量增加与进展性OA和RA的严重程度密切相关，而蕲蛇蛇毒对ΜΜΡ-9具有很好的抑制作用。第三，作为ΜΜΡ-9特异性抑制剂的--ΜΡ-1，其在人体血清中的低表达与早期滑膜炎介导的关节周围骨质疏松呈正相关，认为可能成为早期RA的关节周围骨质疏松的生物标志物。促进--ΜΡ-1的释放则可以能有效抑制ΜΜΡ-9从而达到治疗风湿性关节炎的目的，而蕲蛇蛇毒能有效促进TIMP-1的释放。所以对于风湿性关节炎和类风湿性关节炎具有独特疗效。
[0022]与现有的技术相比，本蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用的优点在于:蕲蛇蛇毒价格较抗血管生成类的生物制剂便宜，较易得到，冻干法操作简单，容易得到较纯净的蕲蛇蛇毒冻干粉，抗血管生成作用显著，可以应用于多种与血管增生相关的疾病，应用范围广，疗效显著，实用性强，利于工业化生产和推广。



[0023]图1是本发明实施例1中动物实验I提供的各组大鼠踝关节滑膜组织病理学改变图(ΗΕΧ400)。图中，A:正常组；Β:模型组；C:美洛昔康组；D:蛇毒低剂量组；E:蛇毒中剂
量组；F:蛇毒高剂量组。
[0024]图2是本发明实施例1中动物实验I提供的各组大鼠踝关节滑膜组织vWF免疫组化染色图(X400)。图中，A:正常组；B:模型组；C:美洛昔康组；D:蛇毒低剂量组；E:蛇毒中剂量组；F:蛇毒高剂量组。
[0025]图3是本发明实施例1中动物实验I提供的各组大鼠踝关节滑膜组织VEGF免疫组化染色图(X400)。图中，A:正常组；B:模型组；C:美洛昔康组；D:蛇毒低剂量组；E:蛇毒中剂量组；F:蛇毒高剂量组。
[0026]图4是本发明实施例2中动物实验2提供各组大鼠踝关节滑膜组织病理学改变(HEX400)。图中，A:正常组；B:模型组；C:美洛昔康组；D:蛇毒低剂量组；E:蛇毒中剂量组；F:蛇毒闻剂量组。

[0027]实施例1
[0028]蕲蛇蛇毒在制备抗血管生成药物中的应用。更具体地说,蕲蛇蛇毒作为抗血管生成时的VEGF抑制剂；或者蕲蛇蛇毒作为抗血管生成时的Ang-1抑制剂；或者蕲蛇蛇毒作为抗血管生成时的VEGF和Ang-1协同抑制剂。
[0029]一种含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物。本药物包括蕲蛇蛇毒和药学上可接受的载体。本实施例中，蕲蛇蛇毒为经过升华干燥形成的冻干粉。冻干粉制成含有蕲蛇蛇毒量为
0.1-1.0mg/kg体重的注射针剂。
[0030]一种含有蕲蛇蛇毒的抗血管生成药物作为治疗相关疾病的应用。相关疾病包括眼内新生血管形成、银屑病、肿瘤、动脉硬化、炎性疾病和子宫内膜异位症、糖尿病并发症。更进一步，所述的炎 性疾病优选风湿性关节炎和类风湿性关节炎。由于眼内新生血管形成、银屑病、肿瘤、动脉硬化、炎性疾病(如风湿性关节炎和类风湿性关节炎)和子宫内膜异位症、糖尿病并发症等疾病均具有血管生成的相似特征，因此蕲蛇蛇毒治疗上述疾病的机理基本相同，本文不做赘述。
[0031]一、本发明实施例1的动物实验I如下(以大鼠类风湿性关节炎为例):
[0032]I动物实验
[0033]1.1实验动物和试剂48只雌性SPF级Lewis大鼠(8~9周龄，体重150± IOg)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养在浙江中医药大学实验动物中心，自由饮食进水。牛II型胶原(C II)、完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)购自美国Chondrex公司；兔抗大鼠vWF购自millipore公司；兔抗VEGF抗体、Ang-1ELISA试剂盒购自Santacruz公司；蕲蛇蛇毒冻干粉购自黄山市蛇类科学研究所；莫可比(美洛昔康片)购自上海勃林格殷格翰药业有限公司。真空冷冻干燥技术，简称冻干，又称升华干燥，广泛应用于药品、生物制品、化工及食品工业，对热敏性物质如抗生素、疫苗、血液制品、酶激素及其他生物组织，冻干技术非常适用。因为蕲蛇蛇毒为生物制剂，其还有大量蛋白质，为保证药效，最好采用冻干法制备，以下是冻干法的制备方法:第一步，过滤是去除杂质，得来澄清液，进行冷冻，等结成冰块后再进行干燥。第二步，将冷冻的蛇毒冰块放置于真空干燥器内，进行真空干燥，真空干燥一般在6小时内彻底干燥完。干燥后的蛇毒即成粉末状或块状，五步蛇毒为白色粉状，眼镜蛇毒为淡黄色粉状。干燥后蛇毒含水量不得超过5%,这样的蛇毒即为精制蛇毒冻干粉。
[0034]1.2造模及分组将C II IOmg,与0.05mol/L冰醋酸溶液5mL混匀，配成浓度2mg/mL,置4°C冰箱中过夜。取4mg/mL的CFA，冰浴中与含有C II的冰醋酸等体积混合，充分乳化后制成C II终浓度为I mg/mL的乳化液作为第1次免疫注射剂。同上方法取IFA与含有C II的冰醋酸等体积混合，制成C II终浓度为I mg/mL的乳化液作为第2次免疫注射剂。大鼠麻醉后用微量注射器于尾根部皮内3~4点，注射第1次免疫乳剂0.2mL/只，7d后在相同部位注射第2次免疫乳剂0.15mL/只加强免疫。正常组同法同部位注射等量生理盐水。建模时间21d，除正常组外，造模成功后分模型组、美洛昔康组、蛇毒低、中、高剂量组，每组8只。
[0035]1.3给药方法各组于造模成功后第I天开始给药，蛇毒低、中、高剂量组分别于腹腔注射0.1、0.33、lmg/kg体重，美洛昔康组按0.072mg/kg体重灌胃，正常组和模型组腹腔注射等容量生理盐水，I次/d，连续21d。
[0036]1.4滑膜病理学检测及评分对左足踝关节进行固定、脱钙、石蜡包埋、切片后进行HE染色。参照Takyanagi等标准，采用双盲法进行关节病理损伤程度评分:根据滑膜细胞增生、滑膜下层炎症细胞浸润和血管生成3项指标，每项按轻、中、重程度分别评为O~3分，3项指标总和为该大鼠关节炎组织总病理学评分。
[0037]1.5微血管密度计数观察vWF免疫组织化学阳性区域，评价新生毛细血管情况。染色切片在100倍低倍显微镜下先扫描整个视野，选择内皮细胞染色最密集的3个区域(hotspot,即微血管形成最丰富的区域)，然后转至200倍显微镜下计数6个视野(每个视野
0.16mm2)的微血管数，取其平均值，即为每高倍视野的血管数(MVD)。任何一个胞浆呈棕染的单个内皮细胞或内皮细胞簇，与周围其他组织有明显界限，无论有无血管腔，无论管腔内有无红细胞均定义为一个微血管，管腔大于8个红细胞直径或有明显肌层者不计数在内。
[0038]1.6免疫组织化学观察VEGF蛋白表达及评分采用EnVisionTM 二步法免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达。VEGF阳性细胞为细胞质呈棕黄色或棕褐色。VEGF蛋白表达采用半定量记分法判定:按阳性着色程度评分:0分无着色；1分浅黄色，略高于背景色；2分棕黄色，明显高于背景色；3分棕褐色。按阳性细胞所占比例评分:0分阴性；1分10%以下；2分11%~50% ；3分51%~75% ；4分75%以上。二者乘积为阳性结果。
[0039]1.7ELISA检测血清Ang-1含量末次给药Ih后，大鼠经腹腔麻醉后无菌腹主动脉采血，静置lh，3000r/min离心15min，取上清液，置于_80°C冰箱保存。ELISA检测具体操作步骤参照试剂盒说明书，450nm酶标仪波长下测定吸光度值。
[0040]1.8统计方法采用SPSS20.0统计软件包进行分析，各组数据以土 s表示，采用Oneway ANOVA(Student-Newman-Keuls)进行组间比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
[0041]2 结果
[0042]2.1蕲蛇蛇毒对大鼠滑膜病理学的影响
[0043]正常大鼠关节滑膜由I~3层扁平滑膜细胞组成，无炎细胞浸润及血管增生，关节结构完整，软骨层较厚，表面光滑。本研究中CIA模型大鼠于免疫后18~21d关节肿胀度最高，滑膜细胞层数增至10~15层，炎细胞浸润，滑膜血管翳增生，关节软骨面损伤；21d后关节肿胀逐渐消退僵直，关节软骨局部纤维化可见坏死脱落，关节腔狭窄，伴有广泛炎细胞浸润，滑膜下层大量纤维增生及新生血管形成，呈肿瘤性侵袭性生长。如图1和表1，与模型组相比，美洛昔康组和蛇毒中、高剂量组的大鼠踝关节的病理学评分显著降低(P〈0.05)。见图1，表1。
[0044]2.2蕲蛇蛇毒对大鼠滑膜微血管密度的影响
[0045] CIA模型组大鼠滑膜组织微血管丰富，微血管数目密集，MVD呈高表达；如图2所示，与模型组相比，美洛昔康组和蛇毒高剂量组的MVD明显降低(P〈0.05)，而蛇毒低、中剂量组的MVD减少尚无统计学意义。见图2，表1。
[0046]2.3蕲蛇蛇毒对大鼠滑膜中VEGF蛋白表达的影响
[0047]正常组大鼠VEGF蛋白表达少见，CIA模型中VEGF蛋白表达明显，均表达于细胞浆中。与模型组相比，美洛昔康组和蛇毒中、高剂量组的大鼠踝关节的VEGF蛋白阳性表达量显著降低(P〈0.05)。见图3，表1。
[0048]2.4蕲蛇蛇毒对RA大鼠血清Ang-1含量的影响
[0049]与正常组比较，其余各组血清Ang-1含量显著升高(P〈0.01);与模型组相比，美洛昔康组和蛇毒高剂量组的大鼠踝关节的Ang-1含量显著降低(P〈0.05)。见表1。
[0050]表1蕲蛇蛇毒对CIA大鼠踝关节滑膜总病理学评分及VEGF阳性评分、微血管计数
的影响(JC土 S? n=8)
[0051]