专利名称：发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶，一种是乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH),另一种是乙醒脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛，后者使乙醛进一步转化为乙酸，最终分解为二氧化碳和水。其中乙醛脱氢酶(ALDH)有两种同工酶，分别分布于胞质溶胶(ALDHl)与线粒体(ALDH2)。大部分白人都有这两种乙醛脱氢酶，但是大约50%的亚洲人只有一种乙醛脱氢酶，即细胞质中活性较差的ALDHl。ALDH2的缺少，使乙醇不能被完全分解为水和二氧化碳，而是以乙醛的形式继续留在体内，而乙醛具有强烈的毒理作用，在体内积累会导致中毒现象。 目前市场上也出现了很多解酒药品和保健食品，但大多是中草药配方，也有纯化学制剂，都不能很好地达到解酒除病的目的，原因是这些解酒制剂在人体中起作用时都不符合乙醇在人体中的代谢机理和代谢途径，也就不能从根本上消除饮酒给人体造成的危害。相比之下，以乙醛脱氢酶为原料制备解酒药物，可以向人体补充外源性的乙醛脱氢酶，能有效的弥补内源性乙醛脱氢酶不足，且乙醛脱氢酶在人体内起作用时符合乙醇在人体中的代谢机理和代谢途径，是从根本上治疗和缓解各种酒精性疾病的最理想途径。目前国内市场上也出现了一些利用乙醛脱氢酶原理制成的解酒产品，但只是将微生物破壁后、未经过纯化直接用破碎液制成相关产品，解酒效果可能不够好。目前，天然的ALDH难以获得，大多是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中提取，其资源有限且价格昂贵，因此很难大规模生产。利用微生物生产乙醛脱氢酶不但成本低，而且产酶量较大，本发明采用发酵啤酒酵母制取乙醛脱氢酶，解决了自然界中乙醛脱氢酶不足这一问题，同时也提供了一种制取更高纯度乙醛脱氢酶的方法。
本发明的目的是为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种微生物发酵法生产乙醛脱氢酶的生产工艺。本发明生产周期短，提取工艺简单，产品回收率较高，能制备出更高纯度的乙醛脱氢酶产品，适合工业化生产。本发明的方法包括下列步骤I.菌株发酵以啤酒酵母LYOl为出发菌株，将培养好的种子液按2% 8%的接种量接入发酵培养基(蛋白胨O. 5% 1.5%，酵母膏O. 3% 1.2%，麦芽汁O. 3% 1.2%，水补齐)中，在28 32°C，pH值5. O 6. O的条件下，不停搅拌，发酵培养15 24h ；2.破壁处理将培养成熟的啤酒酵母经4 °C、5000r/min 10000r/min离心5min 15min，得到新鲜活性菌体，用无菌水洗涤I 3次，然后用O. Olmol/L O. 2mol/L磷酸缓冲液(PH7. O 7. 5)制成菌悬液，菌体的质量比浓度为10% 20% ;将上述菌悬液置于4 6°C，用低温高压细胞破碎仪破碎，压力为IOOObar 2000bar，经15s 25s —次性破碎；3.高速离心将细胞破碎后，以4°C、5000r/min 10000r/min离心5min 15min,收集上清液，即粗酶液；4.硫酸铵分级沉淀将粗酶液先用20% 40%饱和度的硫酸铵沉淀，留取上清液，再将其上清液用80% 90%饱和度的硫酸铵沉淀， 去掉上清液，将沉淀物用0. Olmol/L 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH值7. O 7. 5)溶解；5.双水相萃取进行双水相体系萃取,萃取条件为双水相体系中含有10%的粗酶液，10% 12% PEG20000 和 14% 16% (NH4)2SO4,体系混匀后于 4°C、5000r/min 10000r/min离心5min 15min,分离两相，乙醒脱氢酶集中在上相(PEG相);6.超滤将PEG相用截留分子量为3万的滤膜进行超滤，除去PEG、盐离子，实现浓缩，同时回收PEG ；7.真空冷冻干燥将超滤浓缩液进行冷冻干燥、粉碎，即得纯度大于40%的ALDH女口广叩ο本发明是通过发酵培养酵母提取ALDH，而ALDH为胞内产物，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取。成熟的酵母菌细胞壁较厚，不易被破碎，而且ALDH对温度及酸碱度很敏感，容易失活。因此本发明在制取ALDH的过程中都保持了低温操作，在破壁时采用了低温高压细胞破碎仪破碎的方式，只需经一次破壁，就能高效破碎酵母细胞，且能有效维持ALDH稳定性。目前从粗酶液中分离提纯ALDH多采用盐析法、色谱法、有机溶剂沉淀等方法，大部分都包含很多的步骤，复杂、耗时，导致产品回收率低，成本居高不下，很难在大范围内应用。本发明采用了硫酸铵分级沉淀和双水相萃取相结合的方式提纯ALDH，ALDH的比活性由0.04U/mg达到0. 15U/mg，纯化了 3. 75倍，回收率达到64. 2%。本发明乙醛脱氢酶集中在双水相中的上相，采用截留分子量为3万的滤膜进行超滤，可以有效地除去分子量为2万的PEG和盐离子等，也实现了浓缩，将浓缩液真空冷冻干燥即得纯度大于40%的ALDH产品。本发明发酵法制取乙醛脱氢酶具有操作简便、操作时间短、纯化效果较好、提取率高等特点，可用于进行大规模生产与现有技术相比，本发明具有如下有益效果I)本发明利用啤酒酵母LYOl发酵来提取ALDH，可减少提取成本，获得高产量的ALDH，利用其作为原材料提取ALDH具有一定优势；2)本发明采用低温高压破碎仪破碎细胞的方式，操作简便，时间短，产生热量少，可最大限度地保持细胞溢出物的生物活性，适合工业化生产；3)本发明采用双水相体系萃取乙醛脱氢酶，萃取时间短，纯化效果较好，不存在有机溶剂残留问题，环境温和，不会引起生物活性物质失活或变性，易于连续化生产和工业化生产。

附图为本发明以啤酒酵母LYOl为出发菌株，将发酵后获得的菌丝体进行破壁、离心、硫酸铵分级沉淀、双水相体系萃取、超滤浓缩、冷冻干燥后得到纯度大于40%的乙醛脱氢酶的工艺流程图。

5.O，通入无菌空气搅拌培养24h ；2)将培养成熟的啤酒酵母经4°C、5000r/min离心15min,得到新鲜活性菌体,用无 菌水洗涤I次，然后用O. Olmol/L磷酸缓冲液(pH7. O)制成菌悬液，菌体的质量比浓度为10% ；3)将上述菌悬液置于4 6°C，用低温高压细胞破碎仪破碎，压力为IOOObarj^25s 一次性破碎，以4°C、5000r/min离心15min，收集上清液，即粗酶液；4)将粗酶液先用20%饱和度的硫酸铵沉淀，留取上清液，再将其上清液用80%饱和度的硫酸铵沉淀，去掉上清液，将沉淀物用O. Olmol/L磷酸缓冲液(pH7. O)溶解；5)进行双水相体系萃取，萃取条件为双水相体系中含有10%的粗酶液，10%PEG20000和14% (NH4) 2S04，体系混匀后于4°C、5000rpm离心15min，分离两相，乙醛脱氢酶集中在上相(PEG相);6)将PEG用截留分子量为3万的滤膜进行超滤，除去PEG、盐离子，实现浓缩，同时回收PEG ；7)将超滤浓缩液进行冷冻干燥、粉碎，即得纯度为41. I %的ALDH。实施例2I)发酵培养基——蛋白胨I. O %，酵母膏O. 8 %，麦芽汁O. 8 %，pH5. 5，121 °C灭菌20min,按照接种量5%的比例接种啤酒酵母LYOI，温度为30°C，控制pH值在5. 5，通入无菌空气搅拌培养20h ；2)将培养成熟的啤酒酵母经4°C、7500r/min离心lOmin，得到新鲜活性菌体，用无菌水洗涤2次，然后用0. lmol/L磷酸缓冲液(pH7. 2)制成菌悬液，菌体的质量比浓度为15% ；3)将上述菌悬液置于4 6°C，用低温高压细胞破碎仪破碎，压力为1500bar，经20s 一次性破碎，以4°C、7500r/min离心lOmin，收集上清液，即粗酶液；4)将粗酶液先用30%饱和度的硫酸铵沉淀，留取上清液，再将其上清液用85%饱和度的硫酸铵沉淀，去掉上清液，将沉淀物用0. lmol/L磷酸缓冲液(pH7. 2)溶解；5)进行双水相体系萃取，萃取条件为双水相体系中含有10%的粗酶液，11%PEG20000和15% (NH4) 2S04，体系混匀后于4°C、7500r/min离心lOmin，分离两相，乙醛脱氢酶集中在上相(PEG相);6)将PEG相用截留分子量为3万的滤膜进行超滤，除去PEG、盐离子，实现浓缩，同时回收PEG ；
7)将超滤浓缩液进行冷冻干燥、粉碎，即得纯度为40. 2%的ALDH。实施例3I)发酵培养基——蛋白胨I. 5%，酵母膏I. 2%，麦芽汁I. 2%，pH6. 0，121°C灭菌20min,按照接种量8%的比例接种啤酒酵母LYOI，温度为32°C，控制pH值在6. 0，通入无菌空气搅拌培养15h ；2)将培养成熟的啤酒酵母经4°C、10000r/min离心5min，得到新鲜活性菌体，用无菌水洗涤3次，然后用O. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7. 5)制成菌悬液，菌体的质量比浓度为20% ；3)将上述菌悬液置于4 6°C，用低温高压细胞破碎仪破碎，压力为2000bar，经15s 一次性破碎，以4°C、10000r/min离心5min，收集上清液，即粗酶液；4)将粗酶液先用40 %饱和度的硫酸铵沉淀，留取上清液，再将其上清液用90 %饱 和度的硫酸铵沉淀，去掉上清液，将沉淀物用O. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7. 5)溶解；5)进行双水相体系萃取,萃取条件为双水相体系中含有10%的粗酶液,12%PEG20000和16% (NH4) 2S04，体系混匀后于4°C、10000r/min离心5min，分离两相，乙醛脱氢酶集中在上相(PEG相);6)将PEG相用截留分子量为3万的滤膜进行超滤，除去PEG、盐离子，实现浓缩，同时回收PEG ；7)将超滤浓缩液进行冷冻干燥、粉碎，即得纯度为40. 5%的ALDH。


本发明公开了一种发酵法制取乙醛脱氢酶的工艺，以啤酒酵母LY01为出发菌株，将发酵后获得的菌丝体进行破壁、离心后得到粗酶液，用硫酸铵分级沉淀和双水相体系萃取处理粗酶液，收集萃取后富集乙醛脱氢酶的PEG相，然后经超滤膜浓缩，冷冻干燥后得到纯度大于40％的乙醛脱氢酶。本发明具有操作简便、操作时间短、纯化效果较好、提取率高等特点，易于连续化生产和工业化生产。