专利名称：纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层的方法近年来，随着我国逐渐进入老龄化社会，牙种植义齿修复的需求在不断上升，但钛基种植体与周围骨组织之间的快速牢固结合是这类手术面临的一个关键性难题。含基因或基因复合物的表面薄膜制备，即表面介导的基因传递，已经引起了广泛的关注，如何将治疗基因固定到生物材料表面成为研究的热点。层层静电自组装工艺简单，厚度可控，可适用于具有复杂形貌结构的基底材料，并且通过对组装层数的控制能实现对带有正负电荷的聚合物(天然的和合成的材料，包括DNA)的超级薄膜提供精确的、纳米级的控制。人骨形成蛋白(BMP)是一类酸性多肽，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆的分化为软骨细胞和成骨细胞，从而诱导新骨形成；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可促进细胞迁移，使骨髓间充质干细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等向创伤部位聚集，从而启动创伤愈合过程。因此应用层层静电自组装的方法将人骨形成蛋白2 (BMP2) ,bFGF的cDNA基因固定到多孔纯钛种植体表面，可以诱导骨组织的早期形成，同时也为临床上即刻种植-即刻负载种植技术提供生物学材料基础。
本发明的目的在于提供一种多孔纯钛牙种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层的方法，从而使该种植体可以促进新骨形成、缩短愈合时间，进而达到即刻种植、即刻负载的理想效果。本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下本发明的其中一种纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层的方法，包括如下步骤步骤一将多孔纯钛种植体浸入聚乙烯亚胺溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；步骤二 将清洗后的带正电荷多孔纯钛种植体浸入透明质酸溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；然后将多孔纯钛种植体浸入到阳离子脂质体和治疗促进成骨的基因质粒的复合物中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体，用双蒸水清洗。进一步地，本发明所述治疗促进成骨的基因质粒为人骨形成蛋白2或人碱性成纤维细胞生长因子。进一步地，本发明重复所述步骤二 5 8次。进一步地，本发明所述多孔纯钛种植体的表面为具有生物活性的喷砂酸蚀多孔螺纹型结构。本发明的另一种纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层的方法，其特征是，包括如下步骤步骤一将多孔纯钛种植体浸入聚乙烯亚胺溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；步骤二 将清洗后的带正电荷多孔纯钛种植体浸入透明质酸溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；后将多孔纯钛种植体浸入到阳离子脂质体和人骨形成蛋白2的cDNA复合物中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；步骤三重复所述步骤二 3 4次；步骤四再将清洗后的带正电荷多孔纯钛种植体浸入透明质酸溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；再将多孔纯钛种植体浸入到阳离子脂质体和人碱性成纤维细胞生长因子的cDNA复合物中以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；步骤五重复所述步骤四3 4次。进一步地，本发明所述多孔纯钛种植体的表面为具有生物活性的喷砂酸蚀多孔螺纹型结构。与现有技术性相比，本发明方法具有的有益效果是可在多孔纯钛牙种植体表面制备具有诱导成骨作用的基因涂层，体外能成功转染前体成骨细胞系MC3T3-E1，并提高前体成骨细胞系碱性磷酸酶和骨钙素的表达，促进前体成骨细胞的成骨；利用本发明方法制备得到的种植体可以促进新骨形成、缩短愈合时间，进而达到即刻种植、即刻负载的理想效^ ο图1是本发明方法的原理图。
实施例2按以下步骤在纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层1)将表面为具有生物活性的喷砂酸蚀多孔螺纹型结构的多孔纯钛种植体浸入 5mg/ml聚乙烯亚胺(PEI)溶液中20分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗1分钟。2)再将种植体浸入含0. 5mg/ml的透明质酸纳溶液中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟。后将种植体浸入阳离子脂质体/人碱性成纤维细胞生长因子质粒的复合物(Lipofectmine LTX+Plus/ pEGFP-Cl-bFGF)中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟。3)重复上述步骤2、五次，由此在种植体表面组装5层基因薄层。将前体成骨细胞系MC3T3-E1接种于以上组装完成的种植体上，接种48小时后于荧光显微镜下观察细胞转染后蛋白表达效率，结果显示绿色荧光蛋白表达率约对％，证明使用本发明方法在多孔纯钛表面组装的基因薄膜能成功转染前体成骨细胞系MC3T3-E1。实施例3按以下步骤在纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层1)将多孔纯钛种植体浸入5mg/ml聚乙烯亚胺(PEI)溶液中20分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗1分钟。2)再将种植体浸入含0. 5mg/ml的透明质酸纳溶液中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟；后将种植体浸入阳离子脂质体/质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/pEGFP-C 1-BMP2)中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟。3)重复上述步骤2、三次，由此在种植体的表面组装了 3层BMP2基因薄层。4)再将步骤3)得到的种植体浸入含0. 5mg/ml的透明质酸纳溶液中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟；后将种植体浸入阳离子脂质体/质粒复合物(Lipofectmine LTX+P 1 us/pEGFP-C 1 -bFGF)中10 分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟。5)重复上述步骤4)三次，由此在具有BMP2基因薄层的多孔纯钛种植体的表面再组装3层bFGF基因薄层。将前体成骨细胞系MC3T3-E1接种于组装完成的种植体上，接种48小时后于荧光显微镜下观察细胞转染后蛋白表达效率，结果显示绿色荧光蛋白表达率约22%，证明多孔纯钛表面组装的复合基因薄膜能成功转染前体成骨细胞系MC3T3-E1细胞。实施例4按以下步骤在纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层1)将表面为具有生物活性的喷砂酸蚀多孔螺纹型结构的多孔纯钛种植体浸入 5mg/ml聚乙烯亚胺(PEI)溶液中20分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗1分钟。2)再将种植体浸入含0. 5mg/ml的透明质酸纳溶液中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟；后将种植体浸入阳离子脂质体/质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/pEGFP-C 1-BMP2)中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟。3)重复上述步骤2、四次，由此在种植体的表面组装了 4层BMP2基因薄层。4)再将步骤3)得到的种植体浸入含0. 5mg/ml的透明质酸纳溶液中10分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上负电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟；后将种植体浸入阳离子脂质体/质粒复合物(Lipofectmine LTX+P 1 us/pEGFP-C 1 -bFGF)中10 分钟以使多孔纯钛种植体的表面均勻带上正电荷，取出种植体，双蒸水清洗两次，每次1分钟。5)重复上述步骤4)四次，由此在具有BMP2基因薄层的多孔纯钛种植体的表面再组装4层bFGF基因薄层。将前体成骨细胞系MC3T3-E1接种于组装完成的种植体上，接种48小时后于荧光显微镜下观察细胞转染后蛋白表达效率，结果显示绿色荧光蛋白表达率约25%，证明多孔纯钛表面组装的复合基因薄膜能成功转染前体成骨细胞系MC3T3-E1细胞。实施例5本实施例中，将实施例1的步骤2)中的质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/ PEGFP-C1-BMP2)替换为质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3. 1 (+)-BMP2)，其他步骤与实施例1相同。将前体成骨细胞系MC3T3-E1分别接种于本实施例组装完成的种植体上及不含基因薄层的具有生物活性的喷砂酸蚀多孔螺纹型结构的多孔纯钛种植体(空白对照组)上， 每三天换培养液一次。分别于接种后7天和14天收集细胞总蛋白及细胞培养上清液测细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达量。碱性磷酸酶活性结果(见表1)显示，含BMP2基因薄层的种植体的碱性磷酸酶表达量在两个观察时间点表达都较不含基因涂层空白对照组有明显增加(P<0. 05)。骨钙素结果(见表幻显示，涂层组较不含涂层空白对照组的骨钙素表达量显著增加(P < 0. 05)，证明使用本发明方法在多孔纯钛表面组装的BMP2基因薄层能明显促进前体成骨细胞系MC3T3-E1的成骨。实施例6本实施例中，将实施例2的步骤2)中的质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/ pEGFP-Cl-bFGF)替换为质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3. 1 (+)-bFGF)，其他步骤与实施例2相同。以实施例5中的空白对照组作为本实施例的空白对照组，同时将与空白对照组等量的前体成骨细胞系MC3T3-E1接种于组装完成的种植体上，每三天换培养液一次。分别于接种后7天和14天收集细胞总蛋白及细胞培养上清液测细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达量。碱性磷酸酶活性结果(见表1)显示，含该基因薄层的种植体的碱性磷酸酶表达量在两个观察时间点的表达都较不含基因涂层空白对照组有明显增加(P < 0. 05)。骨钙素结果 (见表幻显示，该涂层组较空白对照组亦有显著增加(P <0.05)，证明使用本发明方法在多孔纯钛表面组装的bFGF基因薄层能明显促进前体成骨细胞系MC3T3-E1的成骨。实施例7本实施例中，将实施例3的步骤2)中的质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/PEGFP-C1-BMP2)及(Lipofectmine LTX+P1us/pEGFP-C1-bFGF)替换为质粒复合 ^ (Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3. 1 (+)-BMP2) R (Lipofectmine LTX+Plus/ pcDNA3. 1 (+) -bFGF)，其他步骤与实施例3相同。以实施例5中的空白对照组作为本实施例的空白对照组，同时将与空白对照组等量的前体成骨细胞系MC3T3-E1接种于组装完成的种植体上，每三天换培养液一次。分别于接种后7天和14天收集细胞总蛋白及细胞培养上清液测细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达量。碱性磷酸酶活性结果(见表1)显示，含基因薄层的种植体的碱性磷酸酶表达量在两个观察时间点的表达都较不含基因涂层空白对照组有明显增加(P <0.05)。骨钙素结果 (见表幻显示，涂层组较不含涂层空白对照组显著增加(P <0.05)，证明使用本发明方法在多孔纯钛表面组装的BMP2和bFGF复合基因薄层能明显促进前体成骨细胞系MC3T3-E1 的成骨。实施例8本实施例中，将实施例4的步骤2)中的质粒复合物(Lipofectmine LTX+Plus/ PEGFP-C1-BMP2)及(Lipofectmine LTX+P1us/pEGFP-C1-bFGF)替换为质粒复合 ^ (Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3.l(+)-BMP2) R (Lipofectmine LTX+Plus/ pcDNA3. 1 (+) -bFGF)，其他步骤与实施例4相同。以实施例5中的空白对照组作为本实施例的空白对照组，同时将与空白对照组等量的前体成骨细胞系MC3T3-E1接种于组装完成的种植体上，每三天换培养液一次。分别于接种后7天和14天收集细胞总蛋白及细胞培养上清液测细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达量。碱性磷酸酶活性结果(见表1)显示，含该基因薄层的种植体的碱性磷酸酶表达量在两个观察时间点的表达都较不含基因涂层空白对照组有明显增加(P < 0. 05)。骨钙素结果 (见表幻显示，涂层组较不含涂层空白对照组的骨钙素表达量显著增加(P <0.05)，证明使用本发明方法在多孔纯钛表面组装的BMP2和bFGF复合基因薄层能明显促进前体成骨细胞系MC3T3-E1的成骨。表1.前体成骨细胞系MC3T3-E1碱性磷酸酶表达活性(mmol/g/h)


本发明公开了一种纯钛种植体表面组装非病毒载体介导的基因薄层的方法，其步骤为(1)将多孔纯钛种植体浸入聚乙烯亚胺溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均匀带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；(2)将清洗后的带正电荷多孔纯钛种植体浸入透明质酸溶液中以使多孔纯钛种植体的表面均匀带上负电荷，后取出多孔纯钛种植体用双蒸水清洗；然后将多孔纯钛种植体浸入到阳离子脂质体和促进成骨的基因质粒的复合物中以使多孔纯钛种植体的表面均匀带上正电荷，后取出多孔纯钛种植体，用双蒸水清洗。本发明保证在种植体表面形成具有良好生物活性的多层基因薄膜，提高种植体-骨结合率，为即刻种植-即刻负载种植提供了生物材料基础。