专利名称：用磁性固定化磷脂酶A₁精炼毛油的方法固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学领域广泛应用。使用现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收困难，活力回收率低(一般为40% 60%)的问题。植物油脂中的胶质主要是磷脂混合物，脱胶是植物油精炼中非常重要的工序，脱胶效果好坏将直接影响精炼效率和产品质量；若脱胶不完全，则会加重脱色负担，影响油脂质量和精炼经济效益。植物油磷脂可分为水化磷脂和非水化磷脂，水化磷脂具有亲水性，可通过水化方法脱除，而非水化磷脂具有明显的疏水性，在水化脱胶中较难与水结合，其存在会给油脂精炼带来很多麻烦。现已提出用游离酶法水解脱除非水化磷脂，但在实际生产中发现游离磷脂酶对反应环境敏感，易变性失活，反应条件不易控制。因此将酶进行固定化，可提高它的稳定性和利用效率。目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的报道。
本发明的目的是为了解决现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收复杂，活力回收率低，及目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的问题，而提供一种磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。本发明的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行一、制备狗304纳米粒子；二、制备F%04/Si0x复合粒子；三、制备i^e304/Si0x-APTS载体；四、制备磁性狗304/ SiOx-g-P (GMA)复合粒子；五、将磁性!^e3CVSiOx-g-P (GMA)复合粒子加入到0. lmol/L且pH 值为7 7. 2的磷酸缓冲液中浸泡M ^h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值为5. 5 9. 5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0. 2 %的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12 88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10 50°C下用磁力搅拌器搅拌2 9h，搅拌速度为10 12r/min，然后进行磁分离，用0. Imol/ L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液冲洗2 3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1 ；其中步骤五中每克磁性!^e3CVSiOx-g-P (GMA)复合粒子加入到48 50mL磷酸缓冲液中。利用上述的磁性固定化磷脂酶~精炼毛油的方法，按以下步骤进行一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至70 90°C，加入质量浓度为40% 50%的柠檬酸溶液，混勻，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0. 2 %，在搅拌速度为400 600r/min的条件下反应 10 30min ；二、然后冷却至30 70°C，加入质量浓度为3% 5% NaOH溶液调节pH值至 3 9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 04 0. 16g的磁性固定化磷脂酶A1,于搅拌速度为40 120r/min下反应1 他，用磁铁将磁性固定化磷脂酶~与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。本发明的优点1、本发明的方法合成了磁性高分子微球载体，赋予了固定化磷脂酶A1较强的磁场响应性，从而可以借助外部磁场从反应体系中快速简便地富集、分离和回收固定化磷脂酶 A1，可有效地提高酶的活力回收率，使回收率达到85%以上，进而提高酶的使用效率；2、磁性固定化磷脂酶A1在50°C下反应120分钟后，固定化磷脂酶A1的活力保留值为初始活力的80% 85% ；经过6次使用后固定化磷脂酶A1的活力保留值为初始活力的83% 85%，固定化磷脂酶A1的热稳定性和重复使用性都有所提高；3、将磁性固定化磷脂酶A1用于精炼毛油，使磷含量降到7 10mg/kg ；4、重复脱胶4次以后，磁性固定化磷脂酶A1的活力仍保留80% 85%，提高了酶的重复利用性，降低了生产成本；5、可以利用外部磁场控制磁性固定化磷脂酶A1的运动，从而代替传统的机械搅拌方式，提高磁性固定化磷脂酶A1的催化效率，适合大规模连续化操作。，还包括各间的任意组合。一、本实施方式的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行一、制备1 纳米粒子；二、制备Fi5304/Si0x复合粒子；三、制备!^e3CVSiOx-APTS载体； 四、制备磁性i^O/SiOx-g-PteMA)复合粒子；五、将磁性i^O/SiOx-g-P (GMA)复合粒子加入到0. lmol/L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液中浸泡M ^h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值为5. 5 9. 5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0. 2%的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12 88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10 50°C下用磁力搅拌器搅拌2 9h，搅拌速度为10 12r/min，然后进行磁分离，用0. lmol/L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液冲洗2 3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1 ；其中步骤五中每克磁性i^CVSiOfg-P (GMA)复合粒子加入到48 50mL磷酸缓冲液中。

二 本实施方式与
一不同的是步骤一中制备!^e3O4纳米粒子的具体方法为a、将lmol/L的!^Cl2溶液和1. 75mol/L的!^Cl3溶液混合，使!^e2+与 1 3+的摩尔比为1 1.5，在氮气保护下，于水浴60°C搅拌，搅拌速度为10 40r/min，同时滴加质量浓度为25% 的氨水调节pH值至10，然后升温至80°C保持lh，之后冷却至室温，得产物A ；b、用永久磁体将产物A分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，于室温下真空干燥Mh，即得到!^e3O4纳米粒子。其它与
一相同。

三本实施方式与
一不同的是步骤二中制备!^e3O4/ SiOx复合粒子的具体方法为a、称取2gFe304纳米粒子，加入160mL乙醇、40mL水和5mL质量浓度为25%的氨水，用20 40KHz的超声波分散Ih后，进行搅拌，搅拌速度为10 50r/ min,同时滴加10 50mL的正硅酸乙酯，反应1 后，得产物B ；b、用永久磁体将产物B分离出来，用蒸馏水洗至PH值为中性，然后用lmol/L的盐酸将产物B覆盖，浸泡12h，磁分离后，用蒸馏水洗至PH值为中性，室温下真空干燥Mh，即得到i^304/Si0x复合粒子。其它与
一相同。

四本实施方式与
一不同的是步骤三中制备!^e3O4/ SiOx-APTS载体的具体方法为a、称取Ig !^3CVSiOx复合粒子，加入60mL无水乙醇，用20 40KHz的超声波分散lh，加入6mLNH3 ·Η20，再用超声波分散lOmin，在氮气保护下，于搅拌速度为20r/min的条件下滴加4mL γ -氨丙基三乙氧基硅烷，在水浴50°C条件下保持8h，自然冷却至室温，得产物C ；b、用永久磁体将产物C分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，再用无水乙醇洗涤3次，每次lOmin，于室温下真空干燥24h，得到i^e304/SiOx-APTS载体。其它与
一相同。

五本实施方式与
一不同的是步骤四中制备磁性 Fe304/Si0x-g-P(GMA)复合粒子的具体方法为化、称取2.(^ i^304/SiOx-APTS载体，加入 30mL 二甲基甲酰胺中，用20 40KHz的超声波分散lh，向其中加入5 20mL的三乙胺，在冰浴冷却下向其中滴加含有3mL氯乙酰氯的二甲基甲酰胺溶液5mL，滴加时间不超过0. 5h ；
b、加热回流，反应10h，然后用无水乙醇于20KHz超声波下洗涤，真空干燥至恒重，得产物D；
c、称取0.5g产物D，加入20mL二甲基甲酰胺溶液，二甲基甲酰胺与水的体积比为1 1， 用20 40KHz的超声分散30min，通入氮气0. 5h，然后加入50mL甲基丙烯酸缩水甘油酯、 ImL联吡啶、0. 5gCuCl和0. IgCuCl2,室温下搅拌，反应12h，得产物E ；d、用永久磁体将产物 E从溶液中分离，并用丙酮抽提48h，最后将产物E于室温下真空干燥Mh，得到磁性!^e3O4/ SiOx-g-P(GMA)复合粒子。其它与
一相同。

六本实施方式与
一至五之一不同的是步骤六中将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值为7 8的磷酸缓冲液中。其它与
一至五之一相同。

七本实施方式与
一至六之一不同的是步骤六中将浸泡后的载体加入到25 62. 5mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中。其它与
一至六之一相同。

八本实施方式与
一至七之一不同的是步骤六中在 20 40°C下用磁力搅拌器搅拌4 几。其它与
一至七之一相同。

九、本实施方式的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行一、制备1 纳米粒子；二、制备Fi5304/Si0x复合粒子；三、制备!^e3CVSiOx-APTS载体； 四、制备磁性i^O/SiOx-g-PteMA)复合粒子；五、将Ig磁性i^e304/Si0x-g-P(GMA)复合粒子加入到50mL的0. lmol/L且pH值为7的磷酸缓冲液中浸泡Mh，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值7的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0. 2% 的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到62. 5mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在 30°C下用磁力搅拌器搅拌5h，搅拌速度为lOr/min，然后进行磁分离，用0. lmol/L且pH值为7的磷酸缓冲液冲洗3次，即得到磁性固定化磷脂酶~。本实施方式制得的磁性固定化磷脂酶A1的酶蛋白负载量为98. 4mg/g固定化酶， 磁性i^O/SiOx-g-P (GMA)复合载体的粒径为90 lOOnm，其比饱和磁化强度为19. 6emu/g 载体，无剩余磁和矫顽力。

十本实施方式用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至70 90°C，加入质量浓度为40% 50%的柠檬酸溶液，混勻，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0. 2 %，在搅拌速度为400 600r/min的条件下反应10 30min ；二、然后冷却至30 70°C，加入质量浓度为3% 5% NaOH溶液调节pH值至3 9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 04 0. 16g的磁性固定化磷脂酶A1,于搅拌速度为40 120r/min下反应1 乩，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。

十一本实施方式与
十不同的是步骤一中将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至80°C。其它与
十相同。

十二 本实施方式与
十或十一不同的是步骤一中加入质量浓度为45%的柠檬酸溶液。其它与
十或十一相同。

十三本实施方式与
十至十二之一不同的是步骤一中柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0. 1%。其它与
十至十二之一相同。

十四本实施方式与
十至十三之一不同的是步骤一中柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.5% 1.5%。其它与
十至十三之一相同。

十五本实施方式与
十至十四之一不同的是步骤一中在搅拌速度为500r/min的条件下反应20min。其它与
十至十四之一相同。

十六本实施方式与
十至十五之一不同的是步骤二中然后冷却至40 60°C。其它与
十至十五之一相同。

十七本实施方式与
十至十六之一不同的是步骤二中然后冷却至50°C。其它与
十至十六之一相同。

十八本实施方式与
十至十七之一不同的是步骤二中加入质量浓度为4% NaOH溶液调节pH值至5 8。其它与
十至十七之一相同。

十九本实施方式与
十至十八之一不同的是步骤二中每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 08 0. 12g的磁性固定化磷脂酶A10其它与
十至十八之一相同。

二十本实施方式与
十至十九之一不同的是步骤二中每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 09 0. Ilg的磁性固定化磷脂酶Ap其它与
十至十九之一相同。

二十一本实施方式与
十至二十之一之一不同的是 步骤二中于搅拌速度为60 lOOr/min下反应2 证。其它与
十至二十之一相同。

二十二 本实施方式与
十至二十一之一不同的是步骤二中于搅拌速度为70 90r/min下反应3 4h。其它与
十至二i^一之一相同。

二十三本实施方式用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将 300g除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至80°C，加入0. 36mL质量浓度为50%的柠檬酸溶液，混勻，在搅拌速度为500r/min的条件下反应20min ；二、然后冷却至50°C，加入质量浓度为4% NaOH溶液调节pH值至6，再加入0. 03g磁性固定化磷脂酶A1,于搅拌速度为60r/min 下反应4h，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。本实施方式制备的脱胶油中磷含量降到8mg/kg，磁性固定化磷脂酶A1的活力回收率达到90%，重复使用4次以后，磁性固定化磷脂酶A1的活力仍保留85%。


用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，涉及一种用固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。本发明为了解决现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收复杂，活力回收率低，及目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的问题。制备及精炼毛油的方法一、制备磁性固定化磷脂酶A1；二、将毛油加热，加入柠檬酸溶液；三、冷却，调节pH值，再加入磁性固定化磷脂酶A1，搅拌，分离磁性固定化磷脂酶A1，即完成磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及精炼毛油的方法。本发明制备的磁性固定化磷脂酶A1的回收率达到85％以上，使毛油的磷含量降到7～10mg/kg。应用于油脂脱胶领域。