专利名称：一种普那霉素的发酵培养基及其发酵方法随着抗生素的发现及临床应用，为人类健康水平的提高、平均寿命的延长作出了极其重大的贡献。但随着抗生素的应用，病原菌表现出惊人的适应性，一次又一次地创造了临床几乎无法解决的严重问题。因此，开发全新结构的抗生素品种或具有独特性能的新类型抗生素，将是21世纪抗生素领域研究开发的重要方向。链阳性菌素是20世纪50年代发现的由链霉菌产生的一组天然环肽。对治疗重危感染者具有非常重要的临床意义，因而日益受到人们的关注。A族链阳性菌素的代表物质普那霉素II A及普那霉素II A的衍生物达福普汀，B族链阳性菌素典型代表物质普那霉素I A 及其普那霉素I A的衍生物奎奴普汀。普那霉素可作为万古霉素的替代药物，也可作为医药中间体用于合成奎奴普汀与达福普汀，因此具有良好的市场发展前景。普那霉素又名原始霉素，是由始旋链霉菌发酵产生的一种链阳性菌素类抗生素。 普那霉素对耐药菌具有很好的杀菌效果，可为作为万古霉素的替代药物，在治疗多重耐药革兰阳性菌引起的感染中有广阔的应用，但由于普那霉素水溶性极差，限制了其在临床的应用，普那霉素的衍生物奎奴普汀、达福普汀可以很好的解决上述问题，二者以30:70(W/W) 比例混合制成的药物在临床上具有很好的治疗效果和广阔的应用前景。
本发明要解决的技术问题是提供一种保证普那霉素发酵产物中普那霉素II和普那霉素I比例为3:7的普那霉素的发酵；本发明还提供了采用该培养基的普那霉素的发酵方法。为解决上述技术问题，本发明所述的培养基含有碳源2 10g/100ml，氮源2 7g/100ml，硫酸盐 O. 25 I. 2g/100ml 和碳酸钙 O. I O. 8g/100ml。本发明所述的碳源选自玉米淀粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、小麦淀粉，土豆淀粉和玉米粉中的一种或几种；所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、酵母粉、玉米浆、酵母膏、蛋白胨、豆柏和棉子饼粉中的一种或几种；所述的硫酸盐选自硫酸铵、硫酸镁、硫酸纳、硫Ife亚铁和硫Ife锋中的一种或几种。本发明优选的碳源为玉米淀粉和/或葡萄糖；优选的氮源为黄豆饼粉、蛋白胨和/ 或酵母粉；优选的硫酸盐为硫酸铵和/或硫酸镁。本发明优选的碳源含量为5g/100ml ;优选的氮源含量为4. 95g/100ml ;优选的硫酸盐含量为O. 5g/100ml ;优选的碳酸钙含量为O. 4g/100ml。本发明所述的培养基在发酵初始的pH最好为6. 5。本发明的发酵方法,是在上述任意一种培养基中发酵40 80小时。优选的发酵时间为60小时。本发明所述的发酵期间补入的为氨基酸混合液，补料时间从第22小时持续到第 60小时，每四小时补一次。本发明优选的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、脯氨酸和氨基丁酸中的一种或几种；优选的氨基酸混合液浓度为O. I O.6g/100ml。本发明更优选的氨基酸混合液浓度为O. 3g/100ml。采用上述技术方案所产生的有益效果在于普那霉素在发酵产生链阳性菌素A和链阳性菌素B，其中链阳性菌素A为多聚不饱和大环内酯，链阳性菌素B为环己缩肽，两种产物在结构上有着明显的差别，因此在同一发酵罐中需要进行两种代谢途径，并各自形成产物。因此本发明结合两种代谢途径的异同，在培养基基础配方和中间补料相结合的方法，最终达到控制两种产物比例为3 7的目的。本发明通过对培养基中原材料种类及配比的调整，可以提高发酵单位，而且可以使产物中普那霉素I和普那霉素II的比例为3:7左右，为后续生产奎奴普汀和达福普汀奠定了基础，使后续的普那霉素衍生物生产更加的方便。实施例6 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、180g玉米淀粉(浓度 3g/100ml)、90g葡萄糖(浓度I. 5g/100ml)、180g黄豆饼粉(浓度3g/100ml)、18g蛋白胨(浓度O. 3g/100ml)、120g玉米蛋白粉(浓度2g/ 100ml)、30g酵母粉(浓度O. 5g/100ml)、6g硫酸铵(浓度O. lg/100ml)、30g硫酸镁(浓度O. 5g/100ml)，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加 12g碳酸钙(浓度0.2wg/100ml)，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源 4. 5g/IOOml,氮源 5. 9g/IOOml,硫酸盐 O. 6g/IOOml,碳酸 丐 O. 2wg/IOOml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/v及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，浓度为O. 6g/100ml，每四小时补料一次，培养60小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为 3:6. 5o实施例7 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、240g玉米淀粉(浓度 4g/100ml),30g葡萄糖(浓度O. 5g/100ml )U20g黄豆饼粉(浓度2g/100ml )、30g蛋白胨(浓度O. 5g/100ml)、60g玉米蛋白粉(浓度lg/100ml)、18g酵母粉(浓度O. 3g/100ml)、9g硫酸铵(浓度O. 15g/100ml)、21g硫酸镁(浓度O. 35g/100ml )，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加 24g碳酸钙(浓度O. 4g/100ml)，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源 4. 5g/IOOml,氮源 3. 95g/IOOml,硫酸盐 O. 4g/IOOml,碳酸 丐 O. 4g/IOOml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/v及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和脯氨酸的混合溶液，浓度为O. lg/100ml，每四小时补料一次，培养55小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为3:6. 2o实施例8 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、240g玉米淀粉(浓度 4g/100ml)、60g葡萄糖(浓度lg/100ml)、150g黄豆饼粉(浓度2. 5g/100ml)、30g蛋白胨(浓度 O. 5g/100ml)、90g 玉米蛋白粉(浓度 I. 5g/100ml)、18g 酵母粉(浓度 O. 3g/100ml)、9g 硫酸铵(浓度O. 15g/100ml)、21g硫酸镁(浓度O. 35g/100ml )，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5， 加24g碳酸钙(浓度O. 4g/100ml)，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中 碳源 5g/IOOml,氮源 4. 95g/IOOml,硫酸盐 O. 5g/IOOml,碳酸|丐 O. 4g/IOOml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/v及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和脯氨酸的混合溶液，浓度为O. 3g/100ml，每四小时补料一次，培养70小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为 3:7。实施例9 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、240g玉米淀粉(浓度 4g/100ml)、90g葡萄糖(浓度I. 5g/100ml)、180g黄豆饼粉(浓度3g/100ml)、30g蛋白胨(浓度O. 5g/100ml)、120g玉米蛋白粉(浓度2g/ 100ml)、18g酵母粉(浓度O. 3g/100ml)、9g硫酸铵(浓度O. 15g/100ml )、21g硫酸镁(浓度O. 35g/100ml )，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加 24g碳酸钙(浓度O. 4g/100ml)，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源 5. 5g/IOOml,氮源 5. 95g/IOOml,硫酸盐 5g/IOOml,碳酸 丐 O. 4g/IOOml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵,搅拌速度600rpm，通气量 lv/v及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和脯氨酸的混合溶液，浓度为O. 6g/100ml，每四小时补料一次，培养60小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为 3:8.2。实施例10 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、300g玉米淀粉(浓度 5g/100ml )、30g葡萄糖(浓度O. 5g/100ml )U20g黄豆饼粉(浓度2g/100ml )、60g蛋白胨(浓度lg/100ml)、60g玉米蛋白粉(浓度lg/100ml)、12g硫酸铵(浓度O. 2g/100ml )、3g硫酸镁 (浓度O. 05g/100ml)，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加48g碳酸钙(浓度O. 8g/100ml),搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源5. 5g/100ml，氮源4. 2g/100ml，硫酸盐 O. 25g/100ml，碳酸钙 O. 8g/100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/v及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为苏氨酸、脯氨酸和氨基丁酸的混合溶液，浓度为O. lg/100ml，每四小时补料一次，培养60小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为3:8. 2。实施例11 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、300g玉米淀粉(浓度 5g/100ml)、60g葡萄糖(浓度lg/100ml)、150g黄豆饼粉(浓度2. 5g/100ml)、60g蛋白胨(浓度lg/100ml)、90g玉米蛋白粉(浓度I. 5g/100ml )、12g硫酸铵(浓度O. 2g/100ml )、3g硫酸镁(浓度O. 05g/100ml)，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加48g碳酸钙(浓度O. 8g/100ml), 搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源6g/100ml，氮源5. 2g/100ml，硫酸盐 O. 25g/100ml，碳酸钙 O. 8g/100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵,搅拌速度600rpm，通气量 lv/v及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为苏氨酸、 脯氨酸和氨基丁酸的混合溶液，浓度为O. 3g/100ml，每四小时补料一次，培养60小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为1:3.3 (3:10)。实施例12 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、300g玉米淀粉(浓度 5g/100ml)、90g葡萄糖(浓度I. 5g/100ml)、180g黄豆饼粉(浓度3g/100ml)、60g蛋白胨(浓度lg/100ml)、120g玉米蛋白粉(浓度2g/100ml)、12g硫酸铵(浓度O. 2g/100ml)、3g硫酸镁 (浓度O. 05g/100ml)，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加48g碳酸钙(浓度O. 8g/100ml),搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源6. 5g/100ml，氮源6. 2g/100ml，硫酸盐 O. 25g/100ml，碳酸钙 O. 8g/100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/V及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为苏氨酸、 脯氨酸和氨基丁酸的混合溶液，浓度为O. 6g/100ml，每四小时补料一次，培养60小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为1:3.2 (3:9. 6)。实施例13 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、60g玉米淀粉(浓度 lg/100ml )、60g葡萄糖(浓度lg/100ml )、120g黄豆饼粉(浓度2g/100ml )、30g蛋白胨(浓度 O. 5g/100ml)U20g酵母粉(浓度2g/100ml )、18g硫酸铵(浓度O. 3g/100ml )，用氢氧化钠或盐酸调PH为6. 5，加18g碳酸钙(浓度O. 3g/100ml)，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源2g/100ml,氮源4. 8g/100ml,硫酸盐O. 3g/100ml,碳酸隹丐O. 3g/100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/V及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸的混合溶液，浓度为O. lg/100ml，每四小时补料一次，培养60小时， 即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为1:2 (3:6)。实施例14 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在10L的发酵罐中，加入5L自来水、120g玉米淀粉(浓度 2g/100ml)、240g葡萄糖(浓度4g/100ml)、30g蛋白胨(浓度O. 5g/100ml)、30g玉米蛋白粉 (浓度 0. 5g/100ml)、30g 酵母粉(浓度 0. 5g/100ml )、30g 硫酸铵(浓度 0. 5g/100ml)、6g 硫酸镁(浓度0. lg/100ml )，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加18g碳酸钙(浓度0. 3g/100ml )，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源6g/100ml，氮源2g/100ml，硫酸盐
0.6g/ 100ml，碳酸 丐 0. 3g/ 100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/V及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为甘氨酸、 丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸的混合溶液，浓度为0. 3g/100ml，每四小时补料一次，培养65小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为 2:5.9 (3:8.85)。实施例15 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在10L的发酵罐中，加入5L自来水、180g玉米淀粉(浓度 3g/100ml)、120g葡萄糖(浓度2g/100ml)、黄豆饼粉240g(浓度4g/100ml)、60g蛋白胨(浓度lg/100ml)、60g玉米蛋白粉(浓度lg/100ml)、60g硫酸铵(浓度lg/100ml)、12g硫酸镁 (浓度0. 2g/100ml)，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加18g碳酸钙(浓度0. 3g/100ml)，搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源5g/100ml，氮源7g/100ml，硫酸盐
1.2g/100ml,，碳酸钙 0. 3g/100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/V及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为甘氨酸、 丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸的混合溶液，浓度为0. 6g/100ml，每四小时补料一次，培养45小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为1:3. 2 (3:9. 6)。实施例16 :采用下述的普那霉素的发酵培养基及其发酵方法。培养基的制备在IOL的发酵罐中，加入5L自来水、240g玉米淀粉(浓度 4g/100ml)、360g葡萄糖(浓度6g/100ml)、黄豆饼粉300g(浓度5g/100ml)、30g蛋白胨(浓度 O. 5g/100ml)、30g 玉米蛋白粉(浓度 O. 5g/100ml)、42g 硫酸铵(浓度 O. 7g/100ml)、6g 硫酸镁(浓度O. lg/100ml )，用氢氧化钠或盐酸调pH为6. 5，加24g碳酸钙(浓度O. 4g/IOOml )， 搅拌均匀即可得到液体培养基。所得的液体培养基中碳源10g/100ml，氮源6.7g/100ml， 硫酸盐 0. 8g/ 100ml,碳酸|丐 0. 4g/ 100ml。发酵过程始旋链霉菌在上述液体培养基中进行发酵，搅拌速度600rpm，通气量 lv/V及培养温度28°C，22小时开始补入氨基酸混合液，补加的氨基酸混合液为甘氨酸、 丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸的混合溶液，浓度为0. 3g/100ml，每四小时补料一次，培养72小时，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取样分析，普那霉素I和普那霉素II的质量比为 3:6. 7 ο


本发明公开了一种普那霉素的发酵培养基及其发酵方法，所述的培养基含有碳源2～10g/100ml，氮源2～7g/100ml，硫酸盐0.25～1.2g/100ml和碳酸钙0.1～0.8g/100ml；本发明的发酵方法，是在上述培养基中发酵40～80小时。其通过对培养基中原材料种类及配比的调整，可以提高发酵单位，而且可以使产物中普那霉素Ⅰ和普那霉素Ⅱ的比例为3:7左右，为后续生产奎奴普汀和达福普汀奠定了基础。