一种胃黏膜上皮细胞atp4b启动子驱动的sv40t-gfp真核表达载体的制作方法[0002]胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织(WH0)2006年度报道，2005年全球65亿人口中因癌症死亡的有760万人，约占当年5800万死亡总人数的13%，其中胃癌居肿瘤死亡率的第二位，每年约有100多万病人死于胃癌，资料还表明世界近三分之二的胃癌病例在发展中国家。在我国，胃癌死亡率一直居恶性肿瘤死亡的第一位，上海市也是全国胃癌相对闻发区之一，胃癌死亡率为35.32/10万。胃癌是个多因素的疾病，随着对癌基因研究的不断深入，发现与140多种基因及其蛋白产物密切相关。近年来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的不断深入，恶性肿瘤的基因治疗已成为当前临床肿瘤研究的新热点。肿瘤基因治疗已成为目前攻克和治愈肿瘤最具希望的，也是最活跃的领域。[0003]SV40 (simian virus 40)是20世纪60年代初发现并分离出的猿猴肾细胞病毒，具有转化动物细胞和诱发肿瘤的特性。SV40Tag (SV40T，猿猴病毒抗原蛋白)被广泛用于肿瘤发病机制的研究与转基因动物模型的建立，如利用SV40T基因已建立了小鼠脑脉络丛乳头状瘤、胰腺癌、肝癌等转基因动物模型。[0004]H+/ K+ ATP酶(H+/ K+ ATPase)基因在胃黏膜上皮细胞中特异性表达，和胃酸的合成与分泌有着直接的关系。[0005]绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因是1992年被克隆鉴定的新的报告基因。研究表明，GFP所产生的荧光无种属特异性，不干扰细胞的生长与功能，可耐受光漂白，表达检测时不需要任何协同因子，也不需要底物。
[0006]本发明的目的是提供一种胃黏膜上皮细胞H+/ K+ ATPaseP亚基(ATP4B)启动子驱动下的SV40Tag-GFP融合基因的真核表达载体，为进一步研究胃癌发生机制及开展胃癌的诊断与基因治疗奠定提供研究对象，奠定实验基础。[0007]为了达到上述目的，本发明提供了一种胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，该真核表达载体是包含ATP4B启动子序列、SV40T基因序列、以及携带绿色突光蛋白GFP基因序列的载体质粒DNA序列的基因融合重组质粒；所述的ATP4B启动子序列是在胃黏膜上皮细胞中特异性表达的H+/ K+ ATP酶的β亚基启动子序列，和胃酸的合成与分泌有关；所述的SV40T序列是猿猴病毒抗原蛋白基因序列，该蛋白具有转化动物细胞和诱发肿瘤的特性，SV40T被广泛用于肿瘤发病机制的研究与转基因动物模型的建立；所述的绿色荧光蛋白GFP基因是报告基因，所述的报告基因(importer gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即是一种其表达产物非常容易被鉴定的基因，把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体；所述的载体质粒是可以在宿主中复制和生存的真核表达质粒。
[0008]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的真核表达载体通过以下方法构建:步骤1，克隆ATP4B启动子序列；步骤2，将步骤I所得的ATP4B启动子序列插入携带GFP基因序列的载体质粒中，并进行验证；步骤3，将SV40T基因序列插入步骤2所得的携带ATP4B启动子序列和GFP基因序列的载体质粒，并进行酶切鉴定和测序。
[0009]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的步骤I的克隆ATP4B启动子序列，是以小鼠DNA为模板，经PCR扩增后获得ATP4B启动子序列，其大小为1022bp。
[0010]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T~GFP真核表达载体，其中，所述的PCR扩增，上游引物为 5’ ~GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3’，下游引物为 5’ ~GMGCGTCCTCTAGGGCTTA-3’，退火温度为57°C。
[0011]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的步骤2将ATP4B启动子序列插入携带GFP基因序列的载体质粒，是将携带GFP基因序列的载体经限制性内切酶酶切后，去除其包含的启动子，经琼脂糖电泳纯化后，再插入构建好的包含限制性内切酶位点的ATP4B启动子序列。所述的限制性内切酶是能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶，是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
[0012]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的步骤2将ATP4B启动子序列插入携带GFP基因序列的载体质粒，是以所述的步骤I构建的ATP4B克隆为模板，利用包含Asel和Xholl两个内切酶位点的引物将其插入携带GFP基因序列的载体质粒。
[0013]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的包含Asel和Xholl两个内切酶位点的引物为:
上游引物 5’ -GCATTAATTTCCTCTGGGTCTGTTTGGT-3’ ASEl，
下游引物 5’ -TTCTCGAGGCCCAGGAAGCGTCCTCTAGGGCTTA3’ XHOl0
[0014]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的步骤2的验证,是采用限制性内切酶Nhel/Sacl和Asel/Xhol进行酶切验证,所得结果分别为718bp和1022bp。
[0015]上述的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱动的SV40T-GFP真核表达载体，其中，所述的步骤3的酶切鉴定，是采用Pstl和Asel进行酶切验证，所得结果分别为2000bp和849bp、2049bp。
[0016]本发明提供的胃黏膜上皮细胞ATP4B启动子驱`动的SV40T-GFP真核表达载体具有以下优点。
[0017]本发明采用GFP做阳性选择报告基因，既对细胞无损伤，又经济简捷，是提高基因转移与筛选效率的理想途径。
[0018]可将所得的真核表达载体导入小鼠受精卵的雄原核中，建立转基因绿色荧光小鼠动物模型，具有可比性、可重复性、可靠性、适用性和可控性、易行性和经济性等特点，可以为胃癌发生机制的研究、胃癌的诊断与基因治疗提供具有实用价值的实验动物模型。



[0019]图1为PCR扩增的ATP4B启动子序列的电泳结果。
[0020]图2为插入ATP4B启动子序列的携带GFP基因序列的载体(ATP-1RES -GFP质粒)进行Nhel/Sacl和Asel/Xhol酶切验证的电泳结果。
[0021]图3为将ATP4B-1RES-GFP载体连接到pMD18_T载体上后再进行Nhel /Xball酶切验证的电泳结果。
[0022]图4为插入 SV40T基因序列的携带ATP4B启动子序列和GFP基因序列的载体(ATP4B-SV40T-1RES-GFP)进行Pstl和Asel酶切验证的电泳结果。

[0023]以下结合附图对本发明的作进一步地说明。
[0024]1.ATP4B启动子的克隆。
[0025]设计引物序列如下:
上游引物:5’-GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3’
下游引物:5’-GAAGCGTCCTCTAGGGCTTA-3’
以小鼠DNA为模板，经PCR扩增后获得ATP4B启动子序列，退火温度为57 °C，大小1022bp,电泳结果如图1所示。
[0026]2.构建 ATP4B-1RES-GFP 质粒。
[0027](I)设计ATP4B引物，应包括Asel和Xholl两个内切酶位点，故设计引物如下: 上游引物:5’-GCATTAATTTCCTCTGGGTCTGTTTGGT-3’ (ASEl)
下游引物:5’-TTCTCGAGGCCCAGGAAGCGTCCTCTAGGGCTTA3’ (XH01)。
[0028](2)取pIRES-GFP载体经限制性内切酶酶切后，去除CMV启动子，经琼脂糖电泳纯。
[0029](3)插入构建好的包含限制性内切酶位点的ATP4B启动子序列，获得ATP4B-1RES-GFP质粒，并用限制性内切酶Nhel/Sacl和Asel/Xhol酶切验证，所得结果如图2所示:Nhel/Sacl酶切得到718bp的条带为正确克隆，Asel/Xhol酶切得到1022bp的条带为正确克隆，即1-4号均为正确条带。
[0030](4)再将ATP4B-1RES-GFP载体连接到pMD18_T载体上，分别用Nhel/Xball内切酶进行验证。结果如图3所示，反向连接得到718bp的条带(TM=55°C，即解链温度为55°C)，正向连接得到318bp的条带(TM=55°C)，均为正确克隆，即使用限制性内切酶Asel/Xholl切下片段后纯化，2、3号均为正确条带。
[0031]3.构建 ATP4B-SV40T-1RES-GFP 质粒。
[0032]取pCDNA3.1- SV40T质粒经BmaHI酶切，获得2700bp的SV40T基因片段，将其插入ATP-1RES-GFP载体，并进行酶切鉴定(采用Pstl和Asel )，以及测序。
[0033]酶切鉴定结果如图4所示，Pstl酶切2000bp条带为正确克隆，Asel酶切849bp和2049bp条带均为正确克隆，即1-4号均为正确条带。
[0034]测序结果如下所示。
[0035]ATP4B-SV40T-1RES-GFP 序列: