专利名称：一种花粉特异性启动子及其表达载体和应用的制作方法花粉作为植物的雄配子体，其发育涉及到从孢子体细胞发育到花粉的成熟的整个过程，这个过程非常复杂，需要大量基因在不同启动子的精确调控下协同表达，其中花粉特异启动子对于花粉的正常发育调控起着重要作用。目前已知的花粉特异性启动子多来自于模式植物，如拟南芥、烟草、水稻等，小麦作为重要的粮食作物，此方面的研究滞后于其他禾本科植物。杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势可以显著提高作物产量和改善品质，因此杂种优势利用在现代和今后的农业生产中占有十分重要的地位。在小麦杂种优势利用过程中，雄性不育系的选育是杂交小麦组合筛选和推广应用的关键。利用传统技术选育小麦雄性不育系，技术复杂，效率不高。而利用基因工程技术创建小麦雄性不育系则是一个快捷、有效的技术和方法。其原理是通过阻断花粉发育过程，从而达到雄性不育的目的。利用花粉特异性启动子驱动细胞内毒素基因等在花粉中特异性表达，进而促使花粉败育，是获得雄性不育系的有效方法。该方法还可以防止花粉漂移带来的生物安全问题。利用转基因技术改良和培育新品种可以带来巨大经济、社会效益和显著的生态效益，因此受到各国家政府和科学家的关注。我国政府也给予了大力支持，2008年，我国启动转基因生物新品种培育科技重大专项；2009年，将农作物生物育种列入国家战略性新兴产业发展规划；2010年，在中央一号文件中明确指出，要在科学评估，依法管理基础上推进转基因新品种产业化。启动子是利用转基因技术中不可或缺的重要调控序列，小麦中花粉特异性启动子的分离和应用将有助于利用转基因技术改良和培育小麦新品种。目前，已分离的花粉特异性启动子有很多，但主要集中在模式植物，我国也有一些专利涉及此方面的内容，如康乃馨CMB2花粉特异性启动子(授权公告号ZL 200710025135. 3)、拟南芥AtA7花药特异性启动子(授权公告号ZL 200710177905. 6)、玉米 Zm401花药绒粘层和花粉特异性启动子(授权公告号ZL 200910080351. 7)等，但未见小麦花粉特异性启动子专利。小麦是世界第一大粮食作物，利用基因工程技术改良小麦品质具有重大的应用前景，启动子的分离特别是花粉特异性启动子的克隆，不仅为小麦基因工程提供重要调控序列，而且可用于小麦雄性不育系和恢复系的创建，为小麦杂种优势利用提供关键材料体系。
本发明目的之一是提供一种花粉特异性启动子序列，来自于小麦基因组DNA，在植物花粉中特异表达。本发明的另一个目的是提供一种驱动外源基因在花粉中特异性表达的新方法。本发明通过反向PCR方法，扩增了花粉特异性表达基因的启动子序列，称之为 PSG076，长度为1401bp，为双链核酸类型，其序列如序列表SEQ ID No. 1所示。通过NCBI数据库检索，未发现有相同或相似性较高的序列。生物信息学分析PSG076序列，发现其含有花粉特异性表达的相关顺式元件(GTGA、AGAAA、Q-eIment和AAATGA)。本发明还提供了含有上述启动子的重组表达载体，所述启动子的下游连接有结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或人工合成的小RNA的表达。所述重组表达载体为植物重组表达载体。 在一个优选的实施方式中，构建的表达盒是由PSG076启动子和⑶S ( β -葡萄糖醛酸酶)基因及来自于胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域组成，所述的表达载体优选的是重组质粒Pl4G。本发明将上述含有所述PSG076启动子序列的重组表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，获得外源基因在花粉中表达的基因工程化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞。在一个优选的实施方式中，将含有所述PSG076启动子序列驱动的表达载体转化小麦幼胚，获得了 GUS基因在花粉中特异性表达的转基因植物。本发明所述的植物宿主细胞或宿主组织可以是植物花粉细胞本身，或它的后代， 蛋白质等组成成分或花粉特性已经改变的植物花粉细胞或植物花粉本身。本发明中所述的宿主细胞或宿主组织及后代细胞是指所有植物或植物组织或由这些细胞或组织发育成熟的整株植株(包括种子)。本发明中所述的外源基因是指任何一段核酸序列，具有编码某种蛋白质或其他活性物质的功能，包括RNA或DNA序列。此核酸序列包括不同于启动子植物种类的异源核酸序列，以及从相同于启动子植物种类中获得的同源核酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)植物的启动子无关。本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，如pBI121等。本发明中所述的转基因技术是指已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如基因枪转化法等。本文标题并不限制本发明的各个方面或实施例。本发明的花粉特异性启动子可用于外源基因在花粉中特异性表达，避免基因在植物其他组织持续表达带来的不利影响；可用于植物花粉生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系和恢复系的创建；可用于花粉败育，避免植物转基因漂移或逃逸带来的生物安全问题。本发明提供了一种花粉特异性启动子，不仅可为了解植物花粉发育调控的分子生物学基础提供科学资料，还可用于植物基因工程研究，特别是在小麦等禾本科作物的基因工程应用中，具有广阔应用前景和农业经济价值。术语“启动子”是指RNA聚合酶及一些反式作用因子识别并与之结合从而正确有效地起始基因转录的一段DNA序列。术语“花粉特异性启动子”是指可驱动目的基因在花粉中特异性表达的启动子，而在其他组织无表达活性或表达活性非常弱。术语“表达盒”是指基因表达需要的最小核苷酸序列框架，包括三个部件启动子、 目的基因和终止子。图1显示的是反向PCR技术的流程图。图2显示的是生物信息学预测小麦PSG076启动子序列所含有的相关启动子元件， 以翻译其实密码子ATG中的A核苷酸为+1进行编号。其中与花粉特异性相关的元件GTGA 和AGAAA用灰色背景框表示，与花粉特异性表达相关的数量元件Q-element和AAATGA用方框表示，起始密码子ATG用粗体表示，转录非翻译区域用下划线表示。图3显示的是PCR检测含载体pl4的克隆菌，泳道1 6都为阳性克隆菌。图4显示的是表达载体pl4G的示意图，载体骨架是pMDIS-T载体，表达框包括 PSG076启动子、GUS基因和nos终止子。图5显示的是表达载体pl4G的酶切鉴定图，其中泳道1为HindIII和BamHI双酶切，获得了约1400bp的PSG076启动子片段，泳道2为BamHI和McI双酶切，获得了约 1800bp的GUS基因片段。图6显示的是转基因小麦的组织培养过程，其中a为轰击前聚集在平皿中央的盾片，b为轰击后的盾片进行分散培养，c为分化培养约3周的小麦再生苗，d为生根培养，e 为生根后转入土中培养，f为温室内抽穗的转基因小麦。图7显示的是转基因小麦的PCR检测图，其中泳道3、5、6、7、8、9为转基因阳性植株，泳道11为PCR阳性对照，泳道12为PCR阴性对照，其它泳道为转基因阴性植株。图8显示的是转基因小麦各组织的⑶S染色图，其中a f分别为根、叶、茎、叶鞘、 未成熟花器官、花粉囊、花粉、雌蕊、种子。Pa为内孚，ima指未成熟花药，Ie为外稃，gl为颖片。从图中看看出，蓝色仅在花粉中可见，在其它组织都无GUS染色。
引物 4 :5，GATCGTCGGGATGGGTGATAG 3，PCR 反应程序先 94°C预变性 5min，然后 94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 2min 共；35 个循环。经PCR获得了 1401bp的PSG076启动子序列。该序列经PLACE和PlantCARE数据库分析，发现该启动子含有与花粉特异性表达相关的调控元件(GTGA、AGAAA)和数量元件 (Q-e Iment 和 AAATGA)(图 2)。实施例2.花粉特异性启动子PSG076序列的分离设计并合成引物5和引物6来分离PSG076启动子序列，为后期分离和载体构建的便利，分别在引物5’端加入了限制性内切酶HindIII位点和BamHI位点(下划线表示酶切位点)引物 5 :5，AAGCTTCGGGAAATCATTAATTGTTGAAGA 3，引物 6 :5，GGATCCAAGAACGGAGGCGAATG 3，PCR 反应程序先 94°C预变性 5min，然后 94°C 30sec,62°C 30sec,72°C 2min 共 35个循环。PCR产物经DNA胶回收试剂盒(天根生化科技公司)回收后连接在测序载体 PMD18-T simple (TaKaRa公司)上。该连接产物含有PSG076启动子，命名为pl4，转化到大肠杆菌Dffia感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(终浓度50yg/ml)的LB固体培养基上过夜培养。挑选LB平板上的单菌落，进行PCR验证，引物为引物5和6。PCR结果见图3所示， 所挑选的6个菌落都为阳性克隆菌，含有目标PSG076启动子片段，选取阳性克隆进行测序验证，测序结果正确的用于实施例3。实施例3.含PSG076启动子pl4G表达载体的构建用质粒抽提试剂盒(天根生化科技公司)提取PBI121质粒，经HindIII和EcoRI 限制性酶切后，获得35S-GUS-nos表达盒，连接在pMD18-T载体(TaKaRa公司)相应酶切位点上，构建获得的载体命名为P35G，转化入Dffia中，经PCR反应筛选阳性克隆菌。PCR反应程序同实施例1，仅将72°C的时间改为lmin，引物为引物7和8，用于检测⑶S基因。引物 7 :5，AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC 3，引物 8 :5，ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA 3，用质粒抽提试剂盒提取实施例2中表达载体pl4，经HindIII和BamHI酶切后的 PSG079启动子片度连接在p35G载体相应的酶切位点，替代原来的CaMV35S启动子，即获得了 pl4G表达载体(图4)。如实施例2所述获得阳性克隆菌，克隆菌经PCR反应进行验证。 PCR反应程序和引物参见实施例2所述。抽提阳性菌的质粒，并用限制性酶酶切进行验证， 如图5所示，获得了含PSG076启动子的表达载体pl4G。实施例4.将含PSG076启动子的表达载体pl4G转化小麦采用基因枪转化技术，将重组表达载体pl4G转入小麦未成熟幼胚中，转化方法参照 Cong 等[Cong L, Wang C, Chen L, Liu H, Yang G, He G (2009)Expression of phytoene synthase1 and carotene desaturase crtl genes result in an increase in the total carotenoids content in transgenic elite wheat(Triticum aestivum L.). J Agric Food Chem57 :8652-8660]。剥取小麦未成熟幼胚，经HgCl2杀菌消毒后，在超净工作台上解剖幼胚获得盾片组织，置于含诱导培养基MSSP2平皿的中央位置，每皿约放50个盾片待基因枪轰击。抽提高纯度的P14G质粒，经金粉包裹后，利用基因枪轰击小麦盾片。小麦盾片经轰击后在诱导培养基上分散培养，暗培养3-5周后获得愈伤组织。接着转入分化培养基中CN 102533761 A光培养4 6周，获得再生小苗植株。然后将再生小麦转入生根培养基中促使其生根。最后将生根良好的小麦植株转入土中，在温室中进行培养至成熟，小麦基因枪轰击后的组织培养如图6所示。实施例5.对实施例4中获得的转基因小麦进行分子检测对实施例4中获得的转基因小麦进行分子检测，以便筛选出阳性转基因小麦，检测方法主要有PCR检测。PCR检测根据PSG076启动子和⑶S基因设计检测引物9和10，以Tl代小麦植株的基因组DNA为模板，进行PCR检测，PCR程序同实施例3。结果如图7所示，9株小麦中有 6株为阳性转基因材料。引物 9 :5，AGCTGCCAGAGTGCATAATCG 3，引物 10 5，CGTAAACGGGGTCGTGTAGATT 3，实施例6.对实施例5中鉴定的转基因小麦进行⑶S组织化学检测⑶S基因的表达特异性检测方法按照Jefferson等的⑶S染色方法[Jefferson RA, Kavanagh ΤΑ, Bevan Mff(1987)GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6:3901—3907]。
GUS染色液——X-Gluc反应液(50mM磷酸钠缓冲液，pH7. 0,0. 5mM铁氰化钾，0. 5mM亚铁氰化钾，0. 5mg/ml X-Gluc，20%甲醇，0. 1% Triton X-100)，将采集的小麦各组织材料浸泡在 X-Gluc反应液中37°C过夜，然后用70%乙醇脱去组织的叶绿体颜色后观察照相。结果如图8所示，仅在转基因小麦的花粉中显蓝色，小麦的其他花器官组织(内孚、外孚、颖片、花粉囊、雌蕊)和营养组织(根、茎、叶)中未见蓝色，表明PSG076启动子可驱动GUS基因在小麦花粉中特异性表达。


本发明公开了一种花粉特异性启动子及其表达载体。实验表明，该启动子可驱动目的基因在转基因小麦的花粉中高效特异表达。应用本发明的启动子可对植物花粉生长发育相关基因进行功能分析和鉴定，还可创建植物雄性不育系、防止植物转基因飘逸等，特别是在小麦等禾本科作物雄性不育系的创建和杂种优势的利用中具有重大应用价值。