专利名称：一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用的制作方法血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了在循环系统中功能性血红蛋白存在的持久性。为了防止四聚体的分解，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定， 聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物身体的严重肾损伤； 此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有少量不需要的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的不含蛋白杂质的四聚体血红蛋白的工艺的需求。现有技术血红蛋白制剂的其他问题包括在哺乳动物中输液后产生血管收缩。已经表明此血管收缩是由于内皮衍生舒张因子与血红蛋白分子的活性巯基结合所引起的。因此，本领域中存在着对形成稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白在输液后不会导致血管收缩。除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定化的四聚体血红蛋白的需求，而所述四聚体血红蛋白须不含磷脂并且能够以工业规模生产。
本发明提供了一种制备高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法，所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响或其他严重的不良反应(包括死亡)。本发明还包括高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白和所述血红蛋白用于氧合体内和离体组织的用途。该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，紧接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来裂解所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂和低含量的二聚体的血红蛋白溶液。使用配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液。在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂和低二聚体血红蛋白溶液中血红蛋白分子的巯基。得到的每个血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子。通过富马酸二_3，5-二溴水杨酸酯(bis-3，5-dibromosalicy fumarate)交联巯基保护的血红蛋白的至少α-α和/或β-β亚单位从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60_70kDa。用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白。通过使用切向流超滤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质。向所述交联四聚体血红蛋白加入0. 2-0. 4% 的浓度的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5%以下。然后将所述无磷脂、低二聚体、巯基保护的高温稳定的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体；所述药学可接受的载体可以是生理缓冲液或水。紧接着此步骤，得到的血红蛋白任选地包装在气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、 乙烯-乙烯醇(PE，EVA，EV0H)输液包装中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。通过上述方法制备的高温稳定的交联血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善肿瘤细胞中的氧合，从而提高对放射线和化疗剂的敏感性。该高温稳定的交联四聚体血红蛋白也用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中)保存心脏。图1描绘了不同物种血红蛋白的氨基酸序列比对，包括牛，人，狗，猪和马。图2描绘了本发明的方法的流程图。图3示意性描绘了本发明的方法中使用的快速细胞裂解设备(instant cytolysis apparatus)0图4是显示在氧合和缺氧环境中血红蛋白与巯基试剂的反应的图。图5描绘了对于交联四聚体血红蛋白的高效液相色谱分析。图6描绘了对交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。图7显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)交联四聚体血红蛋白的圆二色性 (CD)光谱分析。图8显示了交联四聚体血红蛋白的体外化学增敏作用。图9描绘了使用本发明的交联四聚体血红蛋白改善了正常组织中的氧合。图10显示了使用本发明的交联四聚体血红蛋白改善了极度低氧的肿瘤区域中的氧合。图11显示了在用本发明的稳定化的交联四聚体血红蛋白治疗后，严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化。图12是流通柱色谱的洗脱图；血红蛋白溶液处于流过级分中。图13示意性描绘了用于工业规模生产的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。图14是氧合环境中的巯基反应和缺氧环境中的反应之间的比较。图15证明与现有技术血红蛋白相比本发明的交联四聚体血红蛋白的热稳定性更
尚ο图16是用于本发明的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意图。图17是用来测试体外高铁血红蛋白形成的设备的示意图。图18描绘了在图17的设备中聚合血红蛋白和本发明的血红蛋白形成高铁血红蛋白的速率。

6的环中心中所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合于与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。在成人中，最常见类型的血红蛋白是称为血红蛋白A的四聚体，其由称为α2β2 的两个α和两个β非共价结合的亚单位组成，每个亚单位分别由141和146个氨基酸残基构成。α和β亚单位的尺寸和结构彼此非常类似。对于总分子量为约65kDa的四聚体，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90. 14% ； β链中的同一性为84. 35%)。不同之处在于牛血红蛋白中的两个巯基位于β Cys 93处，而人血红蛋白中的巯基分别位于α Cys 104、3Cys93和^Cys 112处。图1显示分别标记为B、H、C、P和E 的牛、人、犬、猪和马血红蛋白的氨基酸序列比对。各种来源的氨基酸的不同之处用阴影表示。图1表明当比较其氨基酸序列时，人血红蛋白与牛、犬、猪和马血红蛋白具有高度的相似性。在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，α链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个α β 二聚体与另一个α β 二聚体的缔合相当弱。该结合具有分裂成两个α β 二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而被肾脏过滤和分泌，结果造成潜在的肾损伤和并导致其在血管内的存留时间的实质性减少。因此，从功效和安全性两方面来看，稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白是必要的。下面概述了制备稳定的血红蛋白的方法；本发明的方法的概况呈现在图2的流程图中。首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括，但不限于，人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离，过滤，和洗涤以去除血浆蛋白杂质。为了从红细胞释放血红蛋白，需裂解细胞膜。尽管多种技术可以用来裂解红细胞， 但本发明利用精确可控的低渗裂解技术，且能够满足工业规模制备的需要。为此，用来裂解红细胞的快速细胞裂解设备可见图3。低渗裂解形成裂解产物溶液，其包含血红蛋白和废截留物。为了能够进行工业规模制备，小心地控制裂解作用使得仅红细胞被裂解却不裂解白细胞或其他细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解设备的尺寸使得红细胞在约30秒内穿越该设备并且所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。去离子水和蒸馏水用作低渗溶液。当然要理解使用具有不同的盐浓度的其他低渗溶液将导致红细胞裂解的时限不同。由于可控的裂解步骤仅破坏红细胞，不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白、磷脂或 DNA从白细胞的释放或细胞性物质的释放最小化。在30秒后即，在含有红细胞的溶液已经穿越快速细胞裂解设备的静态混合器部分后立即加入高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其他裂解技术得到的血红蛋白相比具有较高的纯度和较低水平的污染物诸如不合乎需要的 DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检出限=64pg)和HPLC(检出限=lyg/mL)方法没有在该血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不合乎需要的核酸和磷脂杂质。进行两个超滤过程；一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质， 另一个过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，IOOkDa滤器用于第一超滤过程，而30kDa滤器用于第二超滤过程。流通柱色谱用来去除纯化血红蛋白溶液中的蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来进行柱色谱，所述离子交换柱诸如DEAE柱，CM柱，羟磷灰石柱等。用于柱色谱的典型pH为6-8. 5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH 8.0下去除蛋白杂质。进行酶联免疫吸附测定 (ELISA)以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离能够实现连续的分离方案，从而能够实现工业规模的制备。ELISA结果显示在洗脱的交联四聚体血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G :44. 3ng/mL;白蛋白20. 37ng/mL ； 碳酸酐酶81.2yg/mL)。使用不同类型的柱采用不同的pH值去除蛋白杂质的结果显示在下面的表1中。表1 使用不同的离子交换柱去除不同的蛋白杂质
柱(pH条件)去除百分比(％) 碳酸酐酶白蛋白免疫球蛋白-GDEAE (在 pH 7.5 )___6829.8DEAE (在 pH 7.8 )___6050.9CM (在 pH 6.2 )___3221.8CM (在 pH 8.0 )5.653.266.4羟磷灰石(在ρΗ7.5)4.523.522.8为了防止内皮衍生舒张因子与血红蛋白的半胱氨酸位点的结合导致不合乎需要的血管收缩，使血红蛋白在氧合条件下与巯基试剂进行反应。这与现有技术的教导正相反， 现有技术强调血红蛋白和巯基试剂之间的反应在缺氧条件下进行。本发明证明巯基试剂在氧合条件下与血红蛋白的活性巯基较快地且完全地反应。巯基试剂与血红蛋白的巯基的反应产生碘化物。因此，烷基化反应的完成可以通过测量碘化物释放来监测。在时程试验期间，与缺氧环境相比，在氧合环境中烷基化反应更快和更有效地进行，如图4和图14中所示。与缺氧环境相比，在氧合环境中达到完成反应所需的反应时间减少至5小时以下。较短的反应时间对于工业规模过程是非常重要的。其还减少了由不需要的杂质引起的反应， 该杂质导致终产物的不良反应。在巯基反应过程后，血红蛋白经由富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯(DBSF)进行 α-α和/或β-β交联。为了防止聚合血红蛋白的形成，在缺氧环境中小心地控制反应，血红蛋白与DBSF的摩尔比控制在1 2.5-1 4.0之间，使得得到的α-α和/或β-β交联的血红蛋白是分子量为60-70kDa的四聚体血红蛋白，证明不存在聚合血红蛋白。DBSF反应的收率高，>99%且终产物中的二聚体浓度低；在本发明的上下文中，低二聚体含量是指小于5%和，更优选地，小于2% 二聚体。在一个实施方案中，选择交联使得β-β交联的血红蛋白大于总交联四聚体血红蛋白的50%。在另一个实施方案中，选择交联使得β-β 交联的血红蛋白为总交联四聚体血红蛋白的60%或更高。此外，可以选择条件使得β-β 交联的血红蛋白大于总四聚体血红蛋白的70%。存在一些证据，β-β交联的血红蛋白的氧亲和力比α-α交联四聚体血红蛋白低。因此，可能存在这样的情形，即为增加氧运输的效率，较高百分比的β-β交联的血红蛋白优选于α-α交联的血红蛋白。此外，β-β交联的血红蛋白可能产生较少的α-β 二聚体，较少的α-β 二聚体将有助于减少肾毒性。N-乙酰半胱氨酸以0. 2-0. 4%的浓度加入至α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白从而将高铁血红蛋白的水平保持在5%以下。取决于血红蛋白的最终应用，本发明的纯化的交联四聚体血红蛋白任选地在缺氧环境中包装在气密包装中。本发明中使用的包装使α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白稳定持续两年以上。相反，本发明的血红蛋白在氧合条件下在数天内迅速地转变成无活性的高铁血红蛋白。现有技术血红蛋白溶液已经包装在具有高透氧性的PVC或Mericon 血袋中，由此缩短了产品的寿命。 在本发明的许多实施方案中，包含氧载体的含交联血红蛋白的药物组合物通过静脉注射递送。因此，包装设计和材料选择针对静脉注射应用。EVA/EV0H材料的多层包装用来使透气性最小化并且避免形成无活性的高铁血红蛋白。设计与本发明的纯化的交联血红蛋白一起使用的IOOmL输液袋由厚度为0. 4mm的5层EVA/EV0H层压材料制成，其透氧性为在室温下每个大气压每M小时每100平方英寸0. 006-0. 132cm3 (0. 006-0. 132cm3/100平方英寸Λ4小时/大气压)。此材料是VI类塑料(由USP<88>定义)，其满足体内生物学反应测试和物理化学测试并且适合于制造静脉注射用输液袋。此初级包装袋可特别地用于保护α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白溶液免于长期暴露氧，长期暴露氧导致其不稳定并且最终影响其治疗性能。对于血液产品的二次保护，已经知道使用铝外包装以防止潜在的漏气并且将产品保持在缺氧状态。然而，在铝外包装中有存在针孔的可能性，使其气密性受损并且使产品变得不稳定。因此，本发明使用铝外包装袋作为二次包装，其防止氧合并且还防止暴露于光。外包装袋的组成包括0.012mm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，0. 007mm铝(AL)，0.015mm 尼龙(NY)和0. Imm聚乙烯(PE)。外包装薄膜的厚度为0. 14mm且其氧传递速率为在室温下 0. 006cm3/100平方英寸/ 小时/大气压。此二次包装延长了血红蛋白的稳定时间，从而延长了产品保存期限。高效液相色谱(HPLC)法、电喷雾电离质谱(ESI-MS)法和圆二色性(CD)光谱法用来分析和表征α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白。对于牛血来源，图5通过HPLC 分析分子量分布来显示产物的组成。HPLC分析法用来分别检测四聚体和二聚体的量。HPLC 分析的流动相包含氯化镁(0.75Μ)，其可以分离二聚体、未交联的四聚体和稳定的α-α和 /或交联的四聚体。为了促进血红蛋白离解成二聚体，在相同的离子强度下氯化镁的有效性为氯化钠的约30倍多。ESI-MS允许分析非常大的分子。其是一种电离技术，该技术通过电离蛋白质，然后基于质量/电荷比分离电离的蛋白质来分析高分子量化合物。因此，可以准确地确定分子量和蛋白相互作用。在图6中，ESI-MS分析结果表明稳定的四聚体的尺寸为65kDa。 190-240nm的远紫外⑶光谱揭示了血红蛋白的珠蛋白部分的二级结构。在图7中，纯化的和交联的血红蛋白的光谱的一致性揭示血红蛋白链即使在通过DBSF交联以后被正确地折叠。⑶结果显示交联血红蛋白具有大约42% α-螺旋，38% β-折叠，2. 5% β-转角和 16%无规卷曲。其进一步确定使用DBSF以形成交联四聚体血红蛋白的交联步骤不影响血红蛋白的二级结构。由本发明的方法制备的纯化的交联四聚体血红蛋白的分子量为60_70kDa，并且具有至少一个半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巯基保护基团，使得该血红蛋白不能在半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子。此外，交联四聚体血红蛋白无热原、无内毒素 (< 0. 05EU/mL)且无基质(< 1 % )。本发明的方法适用于交联四聚体血红蛋白的大规模工业制备。另外，交联四聚体血红蛋白与药用载体(例如，水、生理缓冲液、在胶囊中)的组合适合于哺乳动物应用。本发明的交联四聚体血红蛋白用于组织氧合，用于癌症治疗，用于治疗缺氧病症诸如失血性休克，和用于低氧含量环境下的心脏保存(例如，心脏移植物)。交联四聚体血红蛋白的剂量在约0. 3-1. 3g/kg的浓度范围内选择。对于在癌症治疗中的应用，本发明的包含氧载体的药物组合物作为组织氧合剂起作用，以改善肿瘤组织中的氧合，从而提高化学敏感性(例如，对化疗的敏感性)和放射敏感性。图8证明在体外应用包含交联四聚体血红蛋白的组合物后癌症肿瘤细胞的提高的化学敏感性。5种不同的癌细胞系(A) Jurkat (白血病)，(B)HKESCl (食管癌)，(C) C0L0205(结肠癌)，(D)A549/Cisp (肺癌)和(E)MCF-7/ADM(乳腺癌)用多种化疗剂单独， 或与本发明的交联四聚体血红蛋白联合治疗。肿瘤细胞生长的抑制通过ATP肿瘤化学敏感性测定(ATP-TCA)(用于 Jurkat、C0L0205、AM9/Cisp 和 MCF-7/ADM 细胞系)或 MTT 细胞增殖测定(用于HKESCl细胞系)来确定。结果显示通过在所有癌细胞系中添加本发明的交联四聚体血红蛋白极大地提高了化学敏感性，这些癌细胞系包括两个细胞系，A549/Cisp和 MCF-7/ADM，它们对化疗高度耐药。图8中的结果显示作为添加交联四聚体血红蛋白提高化学敏感性的结果，对白血病细胞、食管癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞的治疗功效大大增加。另外，在本发明中证明了本发明的交联四聚体血红蛋白改善正常组织中(图9)和极度低氧的肿瘤组织(图10)(人鼻咽癌(CNE》)中的氧合的能力。沿人CNE2异种移植物的组织轨迹的代表性氧状况显示在图10中。肿瘤块内的氧分压通过与微定位系统(DTI Limited)耦联的光纤氧传感器(Oxford Optronix Limited)直接监测。静脉注射1. 2g/kg 交联四聚体血红蛋白后，中位数PA值分别在3小时内从0. 2mmHg升高至3. 9mmHg，在6小时内升高至10.6mmHg。即使在最低氧的区域中，本发明的包含氧载体的药物组合物显著地增加氧分压。与本发明中制备的包含氧载体的药物组合物相比，没有其他类似的市售产品或任何现有的技术显示这样高的功效。对于在治疗缺氧病症和在心脏保存中的应用，本发明的包含氧载体的药物组合物作为将氧提供至靶器官的血液代用品起作用。在一些实施方案中，该组合物用作用于心脏保存的心脏停搏液。在用0. 5g/kg的本发明的交联四聚体血红蛋白治疗后严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化(参见实施例12b)显示在图11中。在严重失血性休克的大鼠模型中，在用稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后，平均动脉压恢复至安全和稳定的水平，并且保持在基线以下。在用本发明的血红蛋白治疗后，平均动脉压恢复至正常的反应时间甚至比充当阳性对照的施用大鼠全血后的平均动脉压恢复至正常的反应时间还短。上述结果表明在输注本发明的血红蛋白后的血管活性事件有益于维持稳定和血液动力学状态。以前的基于血红蛋白的氧载体多引起血管收缩。例如，如由Katz等，2010所公开，1^111(^11代 产品 (Biopure Co.，USA)导致与基线(96 士 IOmmHg)相比较高的平均动脉压(lM+9mmHg)。本发明的血红蛋白用于输液的应用增加了鼠(从18%增加至75%)和小猎犬(从 46%增加至97%)的休克模型的存活率。通过输注不同量的交联四聚体血红蛋白(参见实施例1 显著地增加严重失血性休克动物模型的存活率。因此本发明的血红蛋白可用于失血性休克的治疗。实施例以下的实施例描述本发明的具体实施方案，但不以任何方式限制本发明的范围。实施例1总过程本发明的方法的示意性流程图显示在图2中。牛全血采集在封闭的无菌容器/袋中，该容器/袋含有作为抗凝剂的3. 8% (w/v)枸橼酸钠溶液。然后将血液与枸橼酸钠溶液立即充分混合以抑制血凝块。通过单采机制(apheresis mechanism)将红细胞(RBC)从血浆和其他较小的血细胞分离并收集。为此步骤“细胞洗涤机”与Y灭菌的一次性离心机转筒(centrifuge bowl) 一起使用。用等体积的0.9% (w/v氯化钠)盐水洗涤RBC。对红细胞的细胞膜进行低渗冲击，来裂解洗涤过的红细胞以释放血红蛋白内容物。图3绘制了一种用于此目的的RBC专用快速细胞裂解设备。在RBC裂解后，使用IOOkDa 膜通过切向流超滤将血红蛋白分子与其他蛋白分离。收集滤液中的血红蛋白用于流通柱色谱，并且通过30kDa膜进一步浓缩至12-14g/dL。进行柱色谱法以去除蛋白杂质。浓缩的血红蛋白溶液首先通过巯基试剂(烷基化反应)在天然氧合条件下改性， 然后将各组分与DBSF反应以形成稳定的α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白分子。实施例2时间&可控的低渗裂解和过滤采集新鲜牛全血并在冷却条件下运输。经细胞洗涤机将红细胞与血浆分离，随后用0. 65 μ m过滤。在用0. 9%盐水洗涤红细胞(RBC)滤液后，通过低渗裂解破裂滤液。通过使用图3中绘制的快速细胞裂解设备来进行低渗裂解。该快速细胞裂解设备包括静态混合器以辅助细胞裂解。含有可控浓度的血红蛋白(控制在12-14g/dL的范围内)的RBC悬浮液与4体积的纯净水混合从而低渗冲击RBC细胞膜。控制低渗冲击的时间以避免不希望的对白细胞和血小板的裂解。低渗溶液经过该快速细胞裂解设备的静态混合器部分持续约30 秒。在30秒后当裂解产物离开静态混合器时通过将裂解产物与1/10体积的高渗缓冲液混合而终止冲击。使用的高渗溶液为0. IM磷酸盐缓冲液，7.4%NaCl，pH 7.4。图3的快速细胞裂解设备可以连续地处理50-1000升裂解产物/小时，和优选地至少300升/小时。在RBC裂解后，红细胞的裂解产物通过0. 22 μ m滤器过滤以获得血红蛋白溶液。聚合酶链式反应法(检出限=64pg)和HPLC (检出限=1 μ g/mL)方法在该血红蛋白溶液中都没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。进行第一次IOOkDa超滤以去除分子量大于血红蛋白的杂质。紧接着进行流通柱色谱以进一步纯化该血红蛋白溶液。然后进行第二次 30kDa超滤以去除分子量比血红蛋白小的杂质，并用于浓缩。实施例3
对无基质血红蛋白溶液的病毒清除研究为了证明本发明所述的产品的安全性，我们通过病毒验证研究证明(1)0.65μπι 渗滤步骤和OUOOkDa超滤步骤的病毒清除能力。我们用按比例缩小的小规模反应体系来实施这两种方法，人为地向反应体系中添加不同模型的病毒，如脑心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)、牛病毒性腹 写病毒(bovine viral diarrhoea virus)禾口牛细小病毒(bovine parvovirus)。在此石if究中使用四种类型的病毒，可见下表2。这些病毒的生物物理学和结构特征不同，并且对物理和化学药剂或治疗的抗性方面具有差异。表

本发明提供了一种高温稳定的和高度纯化的交联的(任选地≥70％β-β交联)的四聚体血红蛋白，其具有高效的氧输送功能，所述四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。将二聚体形式的血红蛋白变性并对来自全血的红细胞进行纯化。在快速细胞裂解设备中进行可控低渗裂解以防止白细胞的裂解。在裂解液中没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。在氧合环境中通过巯基试剂封闭活性巯基。流通柱色谱去除不同的血浆蛋白杂质。将N-乙酰半胱氨酸加入至交联的四聚体血红蛋白以保持低水平的高铁血红蛋白。稳定的血红蛋白保存在带有铝外包装的输液袋中以防止氧侵入形成无活性的高铁血红蛋白。该产品用于组织氧合和癌症治疗。