专利名称：组织特异性启动子及其用途的制作方法异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于具有在植物宿主中起作用的可操作地连接的启动子。启动子序列的选择将决定异源DNA序列在植物宿主中表达的时间和位置。 因此，当需要在植物优选的组织中表达时，使用组织特异性启动子。相反，当需要在全部植物细胞中表达时，使用组成型启动子。例如，通过对植物基因组的遗传操纵，使之含有与异源抗虫基因可操作连接的组织特异性启动子，使得抗昆虫物质在易感植物组织中特异地表达，可以实现植物对昆虫侵袭的抗性增加。异源核苷酸序列在目标组织中的优先表达减少了组成型启动子在全部植物细胞中启动异源核苷酸序列转录所发生的植物资源消耗。光合组织为在植物体中可以进行光合作用或潜在光合作用的部分，例如绿色叶片、叶鞘、果壳等，光合组织通过光合作用利用无机物生产有机物(淀粉)并且贮存能量，以使植物体获得生长发育必需的养分。在某些情况下，人们希望某些重要的功能基因仅在光合组织中特异表达。例如，光合组织作为有机物(淀粉)和能量的供给者使其成为各种昆虫的靶标，包括玉米螟、二化螟、蚜虫、棉铃虫等，这些昆虫通过多种机制对植物造成损害， 包括被昆虫掠夺营养物和水分、昆虫将病毒颗粒引入侵袭组织中并使组织对真菌侵袭易感等；因此需要有与帮助植物抵抗外部侵袭(如昆虫、病毒、真菌、线虫及其类似物)的异源核苷酸序列可操作连接的光合组织特异性启动子。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，简称PEPC) 基因启动子作为光合组织特异性启动子由Hudspeth等(Hudspeth R. L. and Grula J. W.， Plant Molecular Biology 12 :579_589，1989)从美国玉米自交品种B73中分离并进行鉴定以来，至今其相关研究甚少，且B73是美国的早期品种，与中国目前的玉米品种亲缘关系较远，因此需要来源于中国玉米品种的PEPC基因启动子，使异源核苷酸序列能够在光合组织中高效特异表达。发明内容本发明的目的是提供一种组织特异性启动子及其用途，即新的分离自中国玉米品种综31 (Z31)的PEPC基因启动子，使目的异源核苷酸序列能够在光合组织中高效特异表达。为实现上述目的，本发明提供了一种组织特异性启动子，其核苷酸序列包括如下 (a)或(b)的序列(a)具有SEQ ID NO=I自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列；(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。进一步地，所述组织特异性启动子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列
(a)具有SEQ ID NO=I自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
优选地，所述组织特异性启动子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列
(a)具有SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
上述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0. 5% SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中， 在65°C下杂交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含与目的异源核苷酸序列可操作地连接的所述的组织特异性启动子的嵌合基因。
进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述的嵌合基因的表达盒。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述的嵌合基因的重组载体。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述的嵌合基因的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞为植物细胞。
优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
为实现上述目的，本发明还提供了一种在其细胞中含有所述的嵌合基因的植物的光合组织。
进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，包括将与所述的组织特异性启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳定的整合进植物细胞中。
进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
优选地，所述目的异源核苷酸序列在光合组织中表达。更优选地，所述光合组织为叶肉组织。
进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
优选地，所述目的异源核苷酸序列编码除草剂耐性蛋白质。所述目的异源核苷酸序列编码昆虫抗性蛋白质。
为实现上述目的，本发明还提供了一种所述的组织特异性启动子用于在植物光合组织中优先表达目的异源核苷酸序列的用途。
优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动子元件，它们影响转录起始速率。公认地，由于本发明启动子区域核苷酸序列已经确定，从本发明具体启动子区域上游的5’非翻译区内进一步分离和鉴定调节元件属于现有技术。因此，本发明启动子区域进一步包括上游调节元件，它赋予与本发明启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列组织特异性表达，优选是在光合组织中特异性表达，更优选地在叶肉组织中特异性表达。
本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域(例如植物可表达性启动子区域)控制下在细胞内含有被转录成RNA分子(例如mRNA)的DNA区域(“转录的DNA区域”)的任何DNA片段。因此，基因可能含有几种可操作性连接的DNA片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录的DNA区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基因。
本发明分离的启动子序列的特征是提供目的异源核苷酸序列的光合组织特异性表达。所述光合组织为在植物体中可以进行光合作用或潜在光合作用的部分，例如绿色叶片、叶鞘、果壳等，光合组织通过光合作用利用无机物生产有机物(淀粉)并且贮存能量，以使植物体获得生长发育必需的养分。本发明中术语“光合组织特异性”是指为特定目的，目的异源核苷酸序列在植物(例如水稻植物(“水稻光合组织特异性”))光合组织细胞中的高度特异性表达。换言之，目的异源核苷酸序列主要在植物的光合组织中表达，植物的非光合组织中的DNA转录物水平是无法检测到的或是非常低的(每微克总RNA低于约0. 2皮克)。
本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用功能上等价的启动子。具有本质上与含有本发明SEQ ID NO :1自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列、或 SEQ ID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列、或具有启动子活性部分的核苷酸序列的玉米PEPC基因启动子相似的启动子活性的DNA序列，是这些启动子的功能等价物。这些功能等价启动子能在严格条件下与含有上述核苷酸序列的玉米PEPC基因启动子区域杂交。
在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(如基因组文库或cDNA文库)群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探测的基团如32P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法为本领域已知并公开于Sambrook等人(1989)分子克隆实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview, New York)0
序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性， 且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500 个核苷酸。
典型地，严格条件是在pH7. 0至8. 3下盐浓度低于大约1. 5M Na离子，典型地大约 0. 01至1. OM Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10至50个核苷酸)至少大约30°C，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60°C。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35%甲酰胺、IM NaCl、1% SDS (十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37°C杂交，在IX至2XSSC(20XSSC = 3. OM NaCl/0. 3M柠檬酸三钠)中50-55°C洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1. OMNaClU % SDS的缓中溶液中37°C杂交，在0. 5X至IXSSC中55-60°C洗涤。高度严格条件，例如，包括在50% 甲酰胺、IM妝(1、1%503的缓冲溶液中371杂交，在0.155(中60-651洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0. 至的SDS。杂交时间一般少于大约M小时，通常大约 4至12小时。
特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。 对于 DNA-DNA 杂交体，Tm 可以从 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 的方程估算:Tm = 81. 5°C +16. 6 (IogM) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L ；其中 M 是单价阳离子的摩尔浓度，％ GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％ form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50%互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和PH下)。每的错配需Tm降低大约1°C;因此， Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有彡90%的同一性，1可以降低10°C。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5°C，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度0^1、2、3或41的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度 (Tm)6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm) 11、 12、13、14、15或20°C的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen (1993)生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier, New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第 2 章(Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York)。见 Sambrook 等人(1989)分子克隆实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40 % -50 %同源，大约60 %、65 %或 70% 同源，甚至至少大约 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40% -50%、大约60%、65% 或 70% 同源，甚至至少大约 75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更大的序列同一性。
其它功能等价启动子含有这样的核苷酸序列，即能用含有SEQ ID NO=I自第812 位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO=I自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的至少约25、优选至少约50、特别是至少约100个连续核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶链式反应中扩增的核苷酸序列。
还可以构建人工启动子，其包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的5’调控区域的决定启动子的光合组织特异性的内部序列。所述人工启动子可能包含能在植物中表达的另一启动子的“核心启动子”或“TATA盒区域”，例如WO 93/19188中所述的CaMV 35S“TATA盒区域”。含有所述人工启动子的启动子区域的适用性可以通过它们与目的异源核苷酸序列的适当融合以及目的异源核苷酸序列在适宜组织、适当发育阶段的表达的检测进行鉴定。
本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进DNA结构使启动子序列与目的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和调节对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所述嵌合基因在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。这种表达盒提供了大量限制性位点以插入目的异源核苷酸序列，所述目的异源核苷酸序列将受到包含本发明启动子序列的调节区的转录调节。表达盒可另外含有至少一个将共转化进生物体的附加基因。可选择地，附加基因可以在多个表达盒上被提供。
表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因(如编码新霉素磷酸转移酶II (NPT))、磷酸甘露糖异构酶(PMI)的基因和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4_ 二氯苯氧乙酸酯Q，4-D)。
表达盒包括沿5’_3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然植物中不存在所述的导入转录起始区。例如， 嵌合基因包含本发明的启动子序列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连接。
终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源核苷酸序列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的Ti质粒获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶(N0Q终止区。
在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。
在适合的情况下，目的异源核苷酸序列可被优化以增加在转化植物中的表达量。 即可用植物优选的密码子合成基因以改善表达。
本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中已知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA 二级结构。
在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、玉米矮小花叶病毒(MDMV)前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白 (BiP)；来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻译前导序列；烟草花叶病毒(TMV)前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)前导序列。还可以使用其它已知的改进转录效率的元件，例如内含子等。
本发明的启动子序列可用来启动与目的异源核苷酸序列的信使RNA(mRNA)至少部分互补的反义结构的转录。构建反义核苷酸序列以与相应的mRNA杂交。只要反义序列长到可与相应的mRNA杂交并干扰其表达，就可进行反义序列的修饰。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有70%，优选的80%，更优选的85%序列同一性的反义结构。此夕卜， 反义核苷酸序列的一部分可被用来破坏靶基因的表达。一般，可使用至少50个核苷酸、100 个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
本发明的启动子序列还可用于启动正义方向的核苷酸序列的转录以抑制植物中内源性基因的表达。应用正义方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表达的方法为本领域已知。该方法通常涉及用含启动子的DNA结构转化植物，启动子可操作地连接至少一部分相当于内源性基因转录体的核苷酸序列，并驱动其在植物中表达。典型地，所述核苷酸序列与内源性基因转录体的序列具有实质上地序列同一性，优选地超过大约65%序列同一性，更优选地超过大约85%序列同一性，最优选地超过大约95%序列同一性。
本发明的启动子序列被用于目的异源核苷酸序列的组织特异性表达。“异源核苷酸序列”是指非天然地与启动子序列一起存在的序列。虽然所述核苷酸序列与启动子序列是异源的，但对植物宿主可能是同源的或天然的或异源的或外源的。可操作地与本发明的启动子连接的异源核苷酸序列可编码目的蛋白质。这种异源核苷酸序列的实例包括但不限于，编码赋予以下抗性多肽的核苷酸序列非生物应激如干旱、温度、盐度、臭氧和除草剂， 或生物应激如病原体侵袭，包括昆虫、病毒、细菌、真菌和线虫类，并防止产生这些生物体伴随的疾病。
本发明中除草剂耐性蛋白质可以表达对除草剂的抗性和/或耐受性。这些基因包括但不限于，乙酰乳酸合酶(ALS)基因、EPSPS基因、PAT基因、GOX基因、GAT基因等。
本发明中“昆虫抗性”是指植物避免植物-昆虫相互作用所致的症状和损害。即阻止昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病，或可选择地，将由昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病减少到最小或减轻。所述昆虫可以属于鳞翅目 (如玉米螟)、半翅目(如椿象)、鞘翅目(如甲虫)、直翅目(如飞蝗)、同翅目(如蚜虫)、 双翅目(如蝇)等。本领域公知的，目的昆虫抗性蛋白质包括但不限于，芽孢杆菌毒性蛋白； 凝集素类，其中凝集素包括雪花莲凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麦芽凝集素、马铃薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶类，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶1或大豆脂氧化酶；昆虫壳多糖酶等。
吸食树汁或啃食叶片的害虫将病毒从感染的植物传递给健康植物。所述病毒包括但不限于，水稻东格鲁杆状病毒、烟草花叶病毒、甘薯萎黄矮小病毒和甘薯羽状斑点病毒等。因此，优选在光合组织中表达具有抗致病原体活性或使病毒病原体的影响最小化的异源核苷酸序列。
本发明的启动子序列和方法可用于任何目的异源核苷酸序列在植物宿主中的表达调节，以改变植物的表现型。各种目的表现型改变包括但不限于，改变植物的脂肪酸成分、改变植物的氨基酸含量、改变植物病原体防御机制等。上述改变可以通过提供异源产物的表达或增加植物内源性产物的表达而得到。可选择地，上述改变可以通过减少植物中一个或多个内源性产物的表达而得到，特别是酶或辅助因子。上述改变将导致转化植物的表现型改变。
转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后插入植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、 电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。
本发明提供了一种组织特异性启动子及其用途，具有以下优点
1、首次分离。本发明组织特异性启动子首次分离自中国玉米品种Z31的PEPC基因。
2、活性高。本发明组织特异性启动子可以显著地提高目的异源核苷酸序列在植物光合组织中的表达量，如在叶片中由本发明组织特异性启动子驱动的⑶S活性值可高达 9897 士 50(pmol 4-MU/mg 蛋白 /min)，GUS 染色也明显较深。
3、组织专一性强。本发明组织特异性启动子显著地提高目的异源核苷酸序列在植物光合组织中的表达量，而显著地降低了目的异源核苷酸序列在植物非光合组织中的表达量，如在非光合组织的根和花中表达很弱，显著地增强了目的异源核苷酸序列在植物光合组织中表达的组织专一性。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。


图1为本发明组织特异性启动子及其用途的重组克隆载体pT_prZ31PEPC(B&H)构建流程图2为本发明组织特异性启动子及其用途的重组表达载体P90005构建流程图3为本发明组织特异性启动子及其用途的重组表达载体P90007构建流程图4为本发明组织特异性启动子及其用途的转基因玉米植株叶片的GUS染色图5为本发明组织特异性启动子及其用途的转基因玉米植株根的⑶S染色图6为本发明组织特异性启动子及其用途的转基因玉米植株茎的⑶S染色图7为本发明组织特异性启动子及其用途的转基因玉米植株花粉的GUS染色图。

下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫基因及其用途的技术方案。
第一实施例、分离启动子序列
1、DNA 的提取
DNA提取按照常规采用的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法取2克幼嫩的玉米品种Dl (综31)植株的叶片在液氮中研磨成粉后，加入0. 5ml于温度65°C预热的DNA提取 CTAB Buffer (20g/L CTAB, 1. 4M NaCl, IOOmMTris-HCl, 20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，用 NaOH 调pH至8. 0)，充分混勻后，于温度65°C抽提90min ；加入0. 5倍体积苯酚，0. 5倍体积氯仿，颠倒混勻；12000rpm(每分钟转数)转速下离心IOmin ；吸取上清液，加入2倍体积无水乙醇，轻柔晃动离心管，于温度4°C静置30min ； 12000rpm转速下再离心IOmin ；收集DNA到管底；弃上清液，用Iml质量浓度为70%的乙醇，洗涤沉淀；12000rpm转速下离心5min ；真空抽干或在超净台吹干；DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8. 0) 中，保存在温度-20°C条件下。
将上述提取的DNA稀释10倍后作为PCR扩增模板。
2、扩增启动子区域
用玉米品种B73的PEPC基因启动子的已知序列(如序列表中SEQ ID NO :2所示)， 设计引物进行PCR扩增
引物 1 :CAACTAGGTTGCATAGGATTTCATGATTAA，如序列表中 SEQ ID NO 3 所示；
引物 2 :GCTGGGCCCGTGGAGGTC，如序列表中 SEQ ID NO 4 所示。
具体试剂和扩增条件如下
IOx反应缓沖液5μ125mM MgCl24μ1IOmM脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)Ιμ 10μΜ引物12μ110μΜ引物22μ1模板2μ1Taq DNA聚合酶0.5μ1
总体积50μ1
上述反应缓冲液为200mMTris-HCl (PH8. 4)，200mM KCl, 15mM MgCl20
PCR反应条件为94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性0. 5min，58°C退火0. 5min，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸5min。
3、序列测定
取2 μ 1 上述 PCR 扩增产物与 pGEM-T 载体(Promega，Madison，USA，CAT :A3600)进行连接，操作步骤按!Iomega公司产品pGEM_T载体说明书进行。然后连接产物用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen，Beijing, China ；Cat. No :CD501)，其热激条件为 50 μ 1大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ 1连接产物，42°C水浴30秒；37°C培养1小时(200rpm 转速下摇床摇动)，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,琼脂15g/L， 用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7. 5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒将菌液在12000rpm转速下离心lmin，去上清液，沉淀菌体用100 μ 1冰预冷的溶液I 05mM Tris-HCl，IOmM EDTA, 50mM葡萄糖，pH8. 0)悬浮；加入150 μ 1新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH,质量浓度为1 % SDS (十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒 4次，混合，置冰上3-5min ；加入150 μ 1冰冷的溶液III (4Μ醋酸钾，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-lOmin ；于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混勻后室温放置5min ；于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70 %的乙醇洗涤后晾干；加入30 μ 1含foiase (RNA酶)(20 μ g/ml) 的 TE (IOmOTris-HCl，ImM EDTA, PH8. 0)溶解沉淀；于温度 37°C下水浴 30min，消化 RNA ；于温度_20°C保存备用。
提取的质粒经BamHI和NcoI酶切鉴定后，挑选阳性克隆，进行测序验证，确认玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
第二实施例、含有玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的重组表达载体P90005 的构建
1、引物设计及PCR扩增
根据如序列表中SEQ ID NO :1所示的玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列，设计引物
引物 3 :AAGCAAGGATCCGGATTTCATGATTAACAGTG 如序列表中 SEQ ID NO 5 所示(带有BamHI酶切位点)；
引物 4 :GGATGGAAGCTTGGCGCGGCGGGAAGCTAAGC 如序列表中 SEQ ID NO 6 所示(带有HindIII酶切位点)。
以上述含有玉米品种Z31的PEPC基因启动子的质粒的DNA为模板，按照第一实施例中2所述的试剂和PCR扩增条件进行PCR扩增。
2、构建含有玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列的重组克隆载体 pT-prZ3IPEPC(B&H)
取2μ 1第二实施例中所述PCR扩增产物与pGEM-T载体(Promega，Madison, USA, CAT :A3600)进行连接，操作步骤按!Iomega公司产品pGEM_T载体说明书进行， 得到重组克隆载体pT-prZ31PEPC(B&H)，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；Π表示噬菌体fl的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6 RNA聚合酶启动子；T7为T7 RNA聚合酶启动子；prZ3 IPEPC为玉米品种Ti 1的PEPC基因启动子(SEQ ID N0:1第16-2310位)；MCS为多克隆位点)。然后将重组克隆载体 pT-prZ3IPEPC(B&H)用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen，Beijing, China ； Cat. No ⑶501)，其热激条件为50μ 1大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ 1质粒DNA (重组克隆载体pT-prZ3 IPEPC (B&H))，42°C水浴30秒；37°C培养1小时(200rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7. 5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl IOg/ L，氨苄青霉素100!^/1，用妝0!1调？!1至7.5)中于温度37 °C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。
提取的质粒经BamHI和HindIII酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-prZ3IPEPC(B&H)中插入的玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列为序列表中SEQ ID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列。
进一步地，PEPC是C4植物光合作用途径中最重要的酶之一。通过plantcare对玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列进行分析，其含有大量与光合作用相关的顺式作用元件，比如 ACE、Box4、CATT-motif、G-box、GAG-motif、GATA-motif、I-box、MNFl、Spl、as-2-box 等，主要集中在SEQID NO 1的第812-2272位之间。
3、构建含有玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的重组表达载体P90005
限制性内切酶BamHI和HindIII分别酶切重组克隆载体pT_prZ31PEPC (B&H)和表达载体p90001 (载体骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供))，将切下的玉米品种Z31 的PEPC基因启动子片段插到p90001的BamHI和HindIII位点之间，构建成重组表达载体 P90005，其构建流程如图2所示(Kan 卡那霉素基因；RB 右边界Wbi 玉米W^iquitin (泛素)基因启动子；PMI 磷酸甘露糖异构酶基因；prZ31PEPC 玉米品种Dl的PEPC基因启动子(SEQ ID NO :1第16-2310位)；⑶S β -葡萄糖苷酸酶基因(SEQ ID NO 7) ；Nos 终止子；LB 左边界)。
将重组表达载体ρ90005用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen， Beijing, China ；Cat. No :CD501)，其热激条件为:50 μ 1大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ 1质粒DNA (重组表达载体p90005)，42°C水浴30秒；37°C培养1小时(200rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7. 5)上于温度37°C条件下培养12小时， 挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7. 5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体P90005在BamHI和HindIII位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示核苷酸序列，即玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列。
4、构建含有玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的重组表达载体p90007 (正对昭)
按照本发明第二实施例中2所述的构建含有玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的重组克隆载体pT-prZ31PEPC (B&H)的方法，利用已知的玉米品种B73的PEPC基因启动子序列构建含有玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的重组克隆载体pT-prB73PEPC(B&H)。 对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-prB73PEPC(B&H)中插入的玉米品种 B73的PEPC基因启动子序列为序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，即玉米品种B73 的PEPC基因启动子序列正确插入。
按照本发明第二实施例中3所述的构建含有玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的重组表达载体P90005的方法，利用已知的玉米品种B73的PEPC基因启动子序列构建含有玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的重组表达载体p90007，其构建流程如图3所示 (载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供)；Kan 卡那霉素基因；RB 右边界；Ubi 玉米WDiquitin基因启动子；PMI 磷酸甘露糖异构酶基因；prB73PEPC 玉米品种B73的 PEPC基因启动子(SEQ ID NO 2)；⑶S β -葡萄糖苷酸酶基因(SEQ ID NO 7) ；Nos 终止子；LB 左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体Ρ90007中插入的玉米品种Β73的PEPC基因启动子序列为序列表中SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，即玉米品种 Β73的PEPC基因启动子序列正确插入。
5、重组表达载体转化农杆菌
对已经构建正确的重组表达载体p90005和p90007用液氮法转化到农杆菌 LBA4404(Invitrgen, Chicago, USA ；Cat. No :18313-015)中，其转化条件为100 μ L 农杆菌 LBA4404、3 μ L质粒DNA (重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶BamHI和NcoI酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体P90005和p90007结构完全正确。
第三实施例、转入玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的玉米植株的获得
按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综3(Z;3)的幼胚与第二实施例中5所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中3和4构建的重组植物表达载体P90005 和p90007中的T-DNA(包括玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列、玉米品种B73的PEPC 基因启动子序列、PMI基因和GUS基因)转入到玉米染色体组中，获得了转入玉米品种Z31 的PEPC基因启动子序列的玉米植株和转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的玉米植株(正对照)，同时以野生型玉米植株作为负对照。
对于农杆菌介导的本发明组织特异性启动子的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将玉米品种Z31的PEPC基因启动子传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1 侵染步骤)，所述启动子可操作地与目的异源核苷酸序列相连。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD66tl = 0. 4-0. 6，侵染培养基(MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮 (AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5. 3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2 共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮 (AS)100mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0，4_D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5. 8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4. 3g/L、MS 维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0，4_D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5. 8) 中至少存在一种已知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂 (步骤3 恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4 选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5mg/L、2，4_ 二氯苯氧乙酸0，4-0)1!^/1、琼脂88/1，？!15.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后， 愈伤组织再生成植物(步骤5 再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤ang/L、甘露糖5mg/L、琼脂8g/L，pH5. 8)上，25°C 下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2. 15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、琼脂8g/L，ρΗ5· 8)上，25°C下培养至约IOcm 高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
第四实施例、玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列的活性测定
实验一、⑶S基因拷贝数的鉴定
分别取转入玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列的玉米植株和转入玉米品种B73 的PEPC基因启动子序列的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测⑶S基因的拷贝数。 同时以野生型玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
检测GUS基因拷贝数的具体方法如下
步骤11、分别取转入玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列的玉米植株、转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成勻浆，每个样品取3个重复；
步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
步骤13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientif ic)测定上述样品的基因组DNA浓度；
步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为 80-100ng/y 1 ；
步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是
引物 5 (GF) GAGGACATCTCGGTTGTGACC 如序列表中 SEQ ID NO 8 所示；
引物 6 (GR) TGCCTTGAAAGTCCACCGTATAG 如序列表中 SEQ ID NO 9 所示；
探针(GP):CTTCAATGGCCCAACCGGGACTG 如序列表中 SEQ ID NO 10 所示；
PCR反应体系为
所述50X引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45 μ 1，100 μ M浓度的探针50 μ 1和860 μ 1 1 X TE缓冲液，并且在4°C，贮藏在琥珀试管中。
PCR反应条件为
JumpStart Taq ReadyMix (Sigma) 50χ引物/探针混合物基因组DNA 水 UdH2O)10μ1 Ιμ 3μ1 6μ1步骤温度时间2195 0C5 分钟2295 0C30 秒2360 0C1 分钟24回到步骤22，重复40次
利用SDS2. 3 软件(Applied Biosystems)分析数据。
实验结果表明，玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列和玉米品种B73的PEPC基因启动子序列已经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入玉米品种Z31的PEPC 基因启动子序列的玉米植株和转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的玉米植株均获得了含有单拷贝GUS基因的转基因玉米植株。
实验二、⑶S活性的鉴定
分别取转入玉米品种Z31的PEPC基因启动子序列的玉米植株和转入玉米品种B73 的PEPC基因启动子序列的玉米植株的叶片、根、茎和花各IOOmg作为样品，参照Jefferson 等(Jefferson, R. A. , Kavanagh, Τ.Α.and Bevan, Μ. W. GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. ,1987, 3901-3907)的方法，用4-甲基伞形酮通过荧光法测定PEPC驱动的⑶S活性。同时以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验每一组织设3次重复，取平均值。
测定⑶S活性的具体方法如下
步骤31、分别称取转入玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的玉米植株和转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列的玉米植株的叶片、根、茎和花各lOOmg，加入500μ 1 提取缓冲液(50mM NaPO4 (pH7. 0)、lmM 二硫苏糖醇(DTT)、10mM EDTA、0. 十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)、0. 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100))在研钵中研成勻浆；
步骤32、在温度4°C、转速4000rpm下离心IOmin后，收集上清液，并置4°C下保存；
步骤33、在 250 μ 1 预热(37°C、至少 30min)的反应缓冲液(50mM NaPO4 (ρΗ7· 0)、 ImM 二硫苏糖醇(DTT)、10mM EDTA、0. 十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)、0. 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、ImM 4-甲基伞形酮酰-β -葡萄糖苷酸(MUG))中加入50 μ 1所述上清液，混勻，于温度37°C下反应15min后，取出30 μ 1加入到270 μ 1反应终止液 (m/v)碳酸钠)中终止反应；
步骤34、制作 4-MU 的标准曲线(0、50、100、250、500、1000、1500 和 2000pmol 4-MU 稀释于2%碳酸钠)，用SpectraMax M2测定各样品的Ex365/Em455值；
步骤35、取所述上清液30 μ 1，用水定容至360 μ 1，取出30 μ 1后加入 100 μ IBCA(二喹啉甲酸)反应物(BCA蛋白定量试剂盒)，于温度37°C下反应30min后，再于室温下冷却IOmin ；
步骤36、同时以牛血清白蛋白(BSA)制作标准曲线(0、25、50、75、100、150、200和 250 μ g/ml)，用SpectraMax M2测定各样品的560nm光吸收值；
步骤37、用4-甲基伞形酮G-MU)的皮摩尔数与蛋白质含量及时间的比值(pmol4-MU/mg蛋白/min)表示GUS活性。
同时以以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。
转基因玉米植株⑶S基因的表达量的实验结果如表1所示。分别测得转入玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的玉米植株(DlPEPC)、转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列(B73PEPC)、野生型玉米植株(WT)和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株(NGM)的叶片中 GUS 活性值(pmol 4-MU/mg 蛋白/min)为 9897士50、9675士73、0士 13 和 0士 11 ；转入玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的玉米植株、转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列、野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株的根中GUS 活性值(pmol 4-MU/mg 蛋白/min)为 121 士 15、144士 12、0士21 和 0士23 ；转入玉米品种 Z31 的PEPC基因启动子序列的玉米植株、转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列、野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株的茎中⑶S活性值(pmol 4-MU/mg蛋白/min)为3321 士52、3123士46、0士沘和0士洸；转入玉米品种Dl的PEPC基因启动子序列的玉米植株、转入玉米品种B73的PEPC基因启动子序列、野生型玉米植株和经荧光定量 PCR鉴定为非转基因的玉米植株的花中⑶S活性值(pmol 4-MU/mg蛋白/min)为99士 13、 132士 15、0士 16 和 0士 18。
表1、四种植株的GUS活性测定平均结果


本发明涉及一种组织特异性启动子及其用途，组织特异性启动子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列(a)具有SEQ ID NO1自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列；(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明组织特异性启动子首次分离自中国玉米品种Z31的PEPC基因；同时，显著地提高目的异源核苷酸序列在植物光合组织中的表达量，而显著地降低了目的异源核苷酸序列在植物非光合组织中的表达量，显著地增强了目的异源核苷酸序列在植物光合组织中表达的组织专一性。