专利名称：玉米萌发类似蛋白基因启动子及其应用的制作方法 桶状蛋白(cupin)是一类含有β-折叠结构域的蛋白质，广泛分布于原核及真核生物体内，包括一些酶以及与糖和其它化合物结合的蛋白，种类繁多。高等植物中(主要发现于作物中)的萌发蛋白(Germins)和萌发类似蛋白(Germin-likeproteins，GLPs)即属于桶状蛋白家族。小麦萌发蛋白(wheat germin)是桶壮蛋白中研究最透彻的一种，是一种糖蛋白，由于在小麦种子萌发时合成，所以命名为萌发蛋白。小麦萌发蛋白具有草酸氧化酶和过氧化物歧化酶活性，在植物细胞中分布于外质体(apoplast)及细胞壁，除了在草酸代谢中具有重要作用外，还可能为细胞壁形成中的分子交联提供过氧化氢。又因为它还有过氧化物歧化酶活性，所以有人推测萌发蛋白参与了植物对抗非生物胁迫的反应。萌发类似蛋白是一类不同于萌发蛋白，但又有相似之处的蛋白质，和萌发蛋白有比较高的同源性，最高90％，平均50％左右。自从1991年在大麦根中发现萌发类似蛋白以来，科学家已经在水稻、大麦、拟南芥等植物中克隆到了多种萌发类似蛋白基因。除了少数几个以外，大部分萌发类似蛋白的功能现在还不清楚。功能已经清楚的几个萌发类似蛋白是1998年Neutelings，G.，J.M.Domon等发现的松树GLP蛋白(Neutel ings，G.，J.M.Domon，and H.David 1998Plant Mol.Biol.381179-1190)，具有草酸氧化酶活性；1999年Toshiaki Yamahara，Tadahiko Shiono等发现的藓类GLP蛋白(BuGLP)(Toshiaki Yamahara，TadahikoShiono，and Toshio Satoh 1999.J.Biol.Chem.Vol 274 No.47 33274-33278)，具有过氧化物歧化酶活性；大麦glp1基因(Hvg lp1)，编码核苷酸-糖磷酸二酯酶(Milagros Rodriguez-Lopez，Edurne Baroja- Fernandez，and JavierPozueta-Romero 2001 FEBS Letters 490 44-48)。
本发明的目的是提供来自玉米的萌发类似蛋白的启动子序列。玉米萌发类似蛋白基因启动子命名为ZMp1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸； 3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。ZMp1是玉米萌发类似蛋白编码基因ZMglp1的启动子。Northern杂交证明ZMglp1基因只在玉米特异器官表达。序列表中的DNA序列1是由1400个碱基组成的核苷酸序列。其保守启动子区为自5’端第1347到第1396位碱基。含有本发明启动子的表达载体、细胞系均属于本发明的保护范围。本发明启动子的发现和其功能的阐明，在植物特别是玉米育种中具有重要的意义。


图1为基因组DNA文库的筛选，显示噬均斑。
图2为Southern杂交图。
图3为cDNA-AFLP指纹图谱。
图4为cDNA-AFLP指纹图谱。
图5为Northern杂交的印迹。
图6为Northern杂交的印迹。
图7为Southern杂交的印迹。

本发明选取杂交玉米品种中单306作材料。5月份室外栽培，采取3周龄的玉米根、茎、叶提总RNA，做第一次Northern杂交，采取抽穗期的根、茎、老叶片、抽穗前的最后一片未完全伸展的幼嫩叶片、授粉两周后的种子和雌花序轴提取总RNA作第二次Northern杂交。
实施例1、玉米基因组DNA文库筛选为了得到完整的基因及其启动子，发明人从stratagene公司购买了玉米基因组DNA Lambda FIX II文库，该文库以野生密苏里17株系DNA构建，插入片段的长度约为9-23Kb。以BG840509去est数据库比对，最后根据这些cDNA片段拼接出了一段长度1131碱基的玉米cDNA，1131片段的5’端25个碱基来自BG842559正链上的1-25号碱基，1131中间部分来自BG840509，其3’端331个碱基来自BG841903负链上的331-1号碱基，根据1131序列在其两端设计引物A和B，A为5’-CACACTCGGGTAAAGCTATCTC-3’，B为5’-CAGATTAACAGCATGCGGCACT-3’，利用这两个引物，从我国品种中单306的基因组DNA以及cDNA中分别成功扩增出一段序列Fab，分别克隆到PUCTM载体上测序，发现它们完全一样，长1064个碱基，利用随机引物标记的Fab片段筛选玉米基因组文库(具体方法见文库的说明和《分子克隆》)。和这些书上不同之处在于每个平皿转一张尼龙膜(hybond)，转膜的时间是40秒，然后浸没在1.5M NaCl，O.5M NaOH中变性2分钟，在1.5M NaCl，0.5Tris-HCl(pH8.0)中中和5分钟，最后在0.2M Tris-HCl(pH7.5)，2XSSC溶液中淋洗25秒。紫外光交联45秒。经过多次筛选，得到了一个阳性克隆，如图1所示，头一轮筛选中得到的阳性噬菌体克隆以合适的浓度在NZY板上恢复和培养。噬菌斑转移到杂交尼龙膜上，用放射性标记的Fab片段杂交。提取了噬菌体DNA，并用噬菌体多克隆位点上的酶XbaI和NotI单切，NotI可将插入片段切出，电泳可见其长度在10K以上，XbaI则可将插入片段切成几段，便于作亚克隆。之后，做southern杂交以确定携带该基因的片段结果如图2所示，图中泳道1是经Not I消化的λDNA，泳道2是经XbaI消化的λDNA，并利用32P标记的Fab片段杂交。该片段是利用引物A和引物B(B)扩增出来的，A为5’-CACACTCGGGTAAAGCTATCTC-3’，B为5’-CAGATTAACAGCATGCGGCACT-3’。M是λDNA Hind III分子量标准。图片A中泳道1和泳道2的上部带(a)是λ噬菌体的左臂；下部的带(b)是插入DNA；带c是λ噬菌体的右臂；其余的带(d，e，f)是插入DNA经消化后的片段。用低熔点琼脂糖法回收阳性克隆片段并将其克隆到XbaI单切的PBS质粒上，用T3引物测序，最终将ZMglp1基因及其启动子ZMp1(序列表中的序列1)的序列测出。
实施例2、RNA提取和反转录采用热酚法提取总RNA，抽提缓冲液成分为0.1MliCl，1M Tris-HCl pH8.0，0.1MEDTA，1％SDS，用前加等体积Tris饱和酚pH8.0，80℃预热，取2克组织在液氮中研磨，然后加入到15毫升预热的抽提缓冲液中，混匀，80℃反应5分钟，加7.5毫升氯仿异戊醇，振荡，离心12000rpm 5分钟取上清，加等体积氯仿异戊醇再抽提一遍，最后上清加等体积4MLiCl，4℃沉淀1小时，12000rpm离心10分钟。以总RNA做转录模板，转录前，用DNaseI除去RNA中残存的DNA。利用德国保林曼公司(boehringer Mannheim biochemical)的cDNA合成试剂盒(Cat.No.1117831)进行反转录，每个反应加50微克总RNA做模板，反应步骤见试剂盒说明。反应完后，加RNaseA除去RNA，以备下一步分析。
实施例3、cDNA酶切片段长度多态性分析(CDNA-AFLP)购买了life technologies公司的AFLPTMAnalysis SystemI和AFLP StarterPrimer试剂盒(Cat.No.10544-013，10483-014)来做AFLP，详细步骤见试剂盒说明。分别取250ng根、茎、叶cDNA在25微升体系中用EcoRI和MseI 37℃双切2小时，70℃变性内切酶，加24微升EcoRI和MseI接头及缓冲液，再加1微升连接酶，20℃连接2小时。产物稀释10倍，取5微升作模板，做第一轮PCR，引物依据EcoRI和MseI接头设计，在3’端带有一个选择性碱基，这样只有大约1/16的cDNA片段被扩增，第一轮的PCR产物经过稀释，又作为模板进行第二轮PCR，此次两端接头引物各带有3个选择性碱基，之前EcoRI引物用γ-32p标记，PCR产物用genomyxLRTMDNA半自动测序仪在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，60W，50℃，3.5小时，电泳结束后，干胶半小时，然后在压片夹内于-70℃暴光48小时。结果如图3、图4所示，图3中C为对照。叶(泳道4，7，10，13，16)、茎(泳道2，5，8，11，14，17)和根(泳道3，6，9，12，15，18)的cDNA通过含有3个选择性核苷酸AGG的EcoR I引物及含有3个选择性核苷酸的Mse I引物扩增出来。Mse I引物所含的选择性核苷酸分别为CTT(泳道1，2，3)，CTG(泳道4，5，6)，CTC(泳道7，8，9)，CTA(泳道10，11，12)，CAT(泳道13，14，15)和CAG(泳道16，17，18)。图4中，根(泳道1，4，7，10，13，16)、茎(泳道2，5，8，11，14，17)和叶(3，6，9，12，15，18)的cDNA通过含有3个选择性核苷酸ACC的EcoR I引物及含有3个选择性核苷酸的Mse I引物扩增出来。Mse I引物所含的选择性核苷酸分别为CAT(泳道1，2，3)，CTA(泳道4，5，6)，CTC(泳道7，8，9)，CTG(泳道10，11，12)，CTT(泳道14，15，16)和CAC(泳道16，17，18)。差异显示带自图中可以看出。在放射自显影照片上，找到了8条叶片cDNA特异扩增的条带，比对照片将它们切下来，溶于50微升TE，在100℃煮10分钟。
用第二次PCR引物再次扩增，产物分别克隆到pUCTMT-vector上，用蓝白斑和PCR方法筛选。
实施例4、Northern杂交分析幼苗根、茎、叶总RNA各20微克，在1.2％变性琼脂糖胶电泳，20XSSC转到Hybond尼龙膜上，用紫外光交联仪(Vilber Lourmat UV crosslinker)将RNA和膜交联在一起。用PCR方法标记回收片段做探针(模板DNA0.25ng，EcoRI和MseI引物各30ng，dATP，dTTP，dGTP各0.5mM，Taq酶0.5U，总体积25微升)。杂交结果如图5所示，图中泳道1，玉米幼苗根；泳道2，茎；泳道3，叶；上述部位的总RNA与32P标记的ZMglp1及18S rRNA(b)杂交，结果表明ZMglp1在幼苗叶片特异表达。在另一个Northern杂交分析中，将抽穗期前后的根、茎、幼嫩叶片、老叶片、雄蕊花序、雌蕊花序轴、未成熟种子总RNA各20微克上样电泳，转至Hybond尼龙膜，交联方法同上，用同样的探针杂交，结果如图6所示，图中，泳道1根；泳道2茎；泳道3幼叶；泳道4老叶；泳道5雄蕊；泳道6穗轴；泳道7未熟种子，将它们的总RNA与32P标记的ZMglp1片段(a)及18S rRNA(b)杂交证明，ZMglp1在幼嫩叶片大量表达，在老叶、雄蕊花序、雌蕊穗轴少量表达，而在根、茎和未成熟种子中不表达。
原位杂交结果表明，ZMglp1基因在栅栏组织和气孔保卫细胞中表达，而在表皮细胞中不表达。
实施例5、Southern杂交为了确定玉米ZMglp1基因及其启动子ZMp1的拷贝数，提取了玉米基因组DNA，并用BamHI、EcoR V、Hind III和XbaI酶切，各上样20微克电泳，之后转到Hybond杂交膜上，用紫外光交联，方法同上。在基因的中止密码下游设计引物B1(B1为5’-AGCAAGCACGCGTTCCATTC-3’，用引物A和B1扩增出该基因上相对保守的序列Fab1，以它为模板，用随机引物法合成同位素标记的探针进行杂交，结果如图7所示，图中，泳道1用BamH I消化基因组DNA；泳道2用EcoR V消化基因组DNA；泳道3用Hind III消化基因组DNA；泳道4用Xba I消化基因组DNA；MLambda DNAEcoRI/HindIII分子量标准。杂交时利用32P标记的片段做探针，该片段是利用引物A和引物B1扩增出来的。结果显示，对于BamHI和XbaI，只有一个条带，而对于HindIII则有两个条带，EcoRV无条带，说明，在单倍体基因组中，ZMglp1基因及其启动子ZMp1至少有两个拷贝。
序列表<160>1<210>1<211>1400<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>1tctagattga taaacctcac atgtcacgca tgtaataagt tccgaccaaa ccagatgatg60catatgtttc attacagtac tagtttaata tcaaaatagt ttaataatca tacacatttt120tttatacaga tggtgtgaca gtgatggcga gtatgcacag gcgcgcggcg tggctaaggg180gtgcgggcag atggttgcgt ggtggcgggc ggtcgcctgg cactgtgcgg tctaacgaga240tggggacggg cgcgacaaga cgatggtagg taggtgcaag agtaggagcg agcacgaggg300atgggcaaca agtggtcagg caggtgatga cgacgtgatg gggagggcat aagtgtagaa360gacgagcagc gaccacaaca ataaaaccct acatttccga cggccaaagt cgtcggacat420aagcactaag ccgtcggaaa tagcttattt ttatgactga aagcttattt ccaacggtac480ctgtctctcg gtcgtaacgg gtcagaaata aacttatttc cgacggcggt cgtcgaaaat540aagctatgtc tgatggccga aagagaccgt cagcatttaa cctcgataac ggtattaccg600gttgttaatg gggtcacttc tcttatgtcc gatggtttag tggagaccgt cggacataag660atgaggatag atacgagcac gatttataga ccattattat tttggatcga cggttaggat720ttaaccacta aatagcctct tattttttgg ttggccagcc tacaatccta aaaaaattag780actatatttt tgacgatgag cctcaagaca ccaaaataaa tctgttattt tcagcagact840ccaataactg ccaaaaaata ctttattttt tacaactaaa caataataga ccgtcgaaaa900taatagattt attttcgatg ggctttgtat tttggccatc caatactata ttaatcgcag960taaactgtcg tttttctgta gagtgctggt ctagtcggga gcatatcgct atcttcgtaa1020aaaaatgtat cgcgtgtcct atccatagcc cgtcccgatc aatgtaacaa tgcagagcaa1080gacgaggcct tttgctcatc aaagctctgg tcccatttct tccatcctgg aggacattgc1140atgcaccagc tggcaacgct tgtctattgc ctcctttcgt ccaaatatcc ctagcagcgc1200catgccgacg aacactagcc gcatgcctct catcctaacc aaatttcact cacgtacgtt1260aacagcagtt aacgtacgcg cgctgtcatt ttttcctctg cgtgcatata cacatacact1320gaatcactga tacactacgc ccttcttcct tcttcctata taaagaggcc ctagctccaa1380gtctacaatg caacagatac1400


本发明公开了玉米萌发类似蛋白基因启动子及其应用，目的是提供来自玉米的萌发类似蛋白的启动子序列。玉米萌发类似蛋白基因启动子命名为ZMp1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明启动子的发现和其功能的阐明，在植物特别是玉米育种中具有重要的意义。