专利名称：提高植物对病源、干旱和高盐逆境胁迫抗性的方法随着植物基因组学和多种研究手段的发展，对植 物抗逆的分子机理有了较多的了解，逆境诱导信号转导途径较清楚的至少有3条一是依赖于ABA的传导途径；二是独立于ABA的胁迫诱导基因的表达；三是部分依赖于ABA的信号途径，如拟南芥似泛划基因(Yamaguchi SK et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103，1988-1993，2006)。除此之外，现在还发现包括油菜素内酯、乙烯、茉莉酸、水杨酸等物质在植物抗旱耐盐胁迫中也扮演着重要角色(Kaschani F et al. , Curr. Opin. Chem. Biol. , 11,88-98,2007 ；Catinot J etal. , FEBS Lett. ，4，473-478，2008)。利用合适的外源性化学物质调控大田生长作物中某些基因的表达，对于农业生产和粮食生产相当关键，尤其是对于以下几类在转基因植物中有较高应用价值的基因(1)增加目的营养物质在种子、根、茎中的积累；(2)在植物生长发育周期内某一时段产生某产物并集聚于某一植物组织内以便于收集或/和分离；(3)在病原攻击的位置启动对于某一虫害有特异毒性的毒素的表达；(4)提高植物抵抗多种逆境尤其是干旱，盐碱的能力；(5)对目标植物的生长周期进行调节。第二点可使生物反应器具有更高的效率，而第四点能更好的提高大田作物忍受恶劣天气的能力，保障正常生长。烯丙异噻唑probenazole (3-allyloxy-l, 2-benzisothiazole-l, I- dioxide,PBZ)，是防治稻瘟病的优良试剂，是目前日本杀菌剂中用量最大的品种之一。PBZ本身以及其代谢物不具有生物活性，并不影响稻瘟病的生长和对植物的侵染能力，它主要是通过激活植物自身的系统获得抗性的抗病机制而使植物产生抗病性(Michiaki Lwata, The RoyalSociety of Chemistry Pesticide Outlook, 28-31, 2001)。PBZ 可以诱导拟南芥和烟草等双子叶植物产生系统获得抗性，在水稻等单子叶植物中可通过类似的抗病反应诱导植物产生抗病性。本发明研究小分子物质PBZ时首先发现了 PBZ能够提高拟南芥对多种逆境胁迫的抗性，并随即对这一现象展开了系统的研究。形态学观察、顺式元件诱导变化、基因芯片分析和突变体阻断分析等手段最终确定了 PBZ诱导提高拟南芥对多种逆境胁迫抗性的大致信号途径，为进一步通过筛选和利用小分子物质提高植物在生长生活中的综合优势提供了可能。
本发明的目的是提供一种能够提高植物多种逆境胁迫(包括病源、干旱和高盐等逆境胁迫)抗性的方法。本发明提供的提高植物多种逆境胁迫(包括病源、干旱和高盐等逆境胁迫)抗性的方法，采用化学诱导剂一烯丙异噻唑进行诱导，即对植物施加化学诱导剂PBZ，施加的方式可以为喷施PBZ溶液。喷施时，PBZ溶液浓度控制为O. 3—0.6禮，优选浓度为O. 5mM。植物材料为营养生长后期的植物材料。为了增强化学诱导剂PBZ施加的效果，本发明还对植物组织或细胞导入拟南芥AtNPRl基因或拟南芥基因。本发明中，所述的拟南芥基因，具有SEQ ID NO: I编码的DNA序列的多核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO :2氨基酸序列的多核苷酸系列。拟南芥AtNPRl编码蛋白，是具有SEQ ID NO: 2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明中，所述的拟南芥基因，具有SEQ ID NO: 3编码的DNA序列的多核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO :4氨基酸序列的多核苷酸。拟南芥AtICSl编码蛋白，是具有SEQ ID NO: 4氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。本发明的上述基因在植物提高植物多种逆境胁迫抗性中发挥重要作用。本发明还提供一种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，具体步骤如下 (1)用重组DNA结构转化植物； (2)用化合物PBZ处理转基因植物； (3)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。本发明中，所述的植物可以为水稻、玉米等。
图I为在干旱胁迫处理16天后，野生型拟南芥分别在PBZ处理和水处理下的抗旱性表现。图2为在干旱胁迫处理后复水，野生型拟南芥分别在PBZ处理和水处理下的存活情况。图3为在300mM NaCl处理下，野生型拟南芥分别在PBZ处理和水处理下的抗盐性表现。图4为在干旱胁迫处理18天后，野生型拟南芥和转基因拟南芥分别在PBZ处理和水处理下的抗旱性表现。其中，(a) PBZ处理的野生型拟南芥材料；(b)水处理的野生型拟南芥材料；(c) PBZ处理的转似况7基因的拟南芥材料；(d)水处理的转似况7基因的拟南芥材料。图5为在干旱胁迫处理18天后，AtICSl转基因拟南芥分别在PBZ处理和水处理下的抗旱性表现。图6为在干旱胁迫处理13天后，野生型玉米分别在PBZ处理和水处理下的抗旱性表现。图7为在干旱胁迫处理13天后，野生型玉米分别在PBZ处理和水处理下的相对含水量情况。
图8为在干旱胁迫处理13天后，野生型玉米分别在PBZ处理和水处理下的丙二醛积累情况。图9为在干旱胁迫处理下，野生型水稻分别在PBZ处理和水处理下的抗旱性表现。

取拟南芥叶片约O. lg。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加Iml TRIzoIe(invitrogen公司),混勻后,室温放置15分钟,加O. 2ml氯仿:异戍醇(24:1),剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经O. 1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备用。I. 2 cDNA第一链合成和反转录PCR
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2ug制备的总RNA，0. 5ul Rnaseinhibitor,加DEPC处理过的去离子水至8. 5ul, 2ul 的01igo(dT)18 primer. 65°C 5min,室温放置 IOmin, 13000rpm 离心 5s。再依次加入 4μ1 5XFirst-Strand buffer,0. 5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-I dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37°C反转录I小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心5秒钟，存放于-20°C待用。I. 3 AtNPRl和AJC57全序列的获得
根据拟南芥数据库给出的序列，设计了 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6作为克隆全序列的PCR反应的引物，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8作为克隆全序列的PCR反应的引物。PCR反应体系为50ul，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，58°C复性40s，72°C延伸60s，循环35次。72°C充分延伸lOmin。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD-19-T载体后，由上海英骏公司测序，获得A tNPRl和A tICSl的序列。实施例2、拟南芥J tNPRl和A tICSl转基因分析。2. I LBA4404农杆菌感受态细胞制备
1)在含利福霉素40ug/ml，链霉素100ug/ml的YEB固体培养基上划线，28°C培养48h-72h ；
2)挑单菌落到含利福霉素40ug/ml，链霉素100ug/ml的YEB液体培养基中28°C培养至 0D600 0. 5 ；
3)冰上冷却菌液，5000rpm,4°C 10分钟收集菌体；
4)ImM Hepes pH 7. O洗涤3次，再用10%甘油洗涤一次；
5)悬浮菌体于3ml10%甘油中，分装至Ij I. 5ml离心管中，每管40ul。2. 2农杆菌转化
I)200ng质粒DNAjP 40ul农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行电转化；U I. 8 KV R 200 Ω C 25 uF
2)电击后添加800ulSOC液体培养基，28°C培养Ih ；
3)4000rpm,10分钟收集菌体，悬浮于200ul SOC中，涂在含100 ug/ml壮观霉素，利福平40ug/ml，链霉素100ug/ml LB固体培养基上，28°C倒置培养48h_72h。2. 3农杆菌介导的拟南芥转化
拟南芥基质培养
基质组分蛭石黑土珍珠岩=9 : 3 : 0.5 营养液组分


本发明属于植物分子生物学和基因工程技术领域，具体为一种提高植物对病源、干旱和高盐逆境胁迫抗性的方法。本发明采用化学诱导剂—PBZ(烯丙异噻唑)进行诱导，即对植物施加化学诱导剂PBZ，施加的方式为喷施PBZ溶液；喷施时，PBZ溶液浓度控制为0.3—0.6mM；为了提高施加化学诱导剂PBZ的效果，还对植物组织或细胞导入拟南芥AtNPR1基因或拟南芥AtICS1基因。