专利名称：一种用针状纳米材料增加细胞透性的方法由细胞膜和细胞壁组成的细胞屏障将细胞与外部环境分隔开来，限制了极性分子、亲水性分子与生物大分子的转运，可逆的增加细胞屏障的透性是使很多在正常情况下难以通过扩散进行跨细胞屏障转运的物质通过细胞屏障进行扩散转运的前提(Mazurkiewicz, US6107095 ;Hapala,1997, Crit.Rev.Biotechnol., 17,105)。通常用ble (博来霉素)与NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)等在正常情况下无法进行跨细胞屏障转运的物质来评价细胞透性增加的效果(Shimizu, 1996, Biol Phardm Bull, 19,1279)。使物质通过细胞屏障的方法对医药开发及生物技术都有重要意义，因此科研工作者在这一领域做了大量研究工作，并开发了许多通过物理或化学处理增加细胞透性的方法(主要是使细胞外物质进入细胞内)。这些增加细胞透性的方法可分为三类:生物学方法、化学法与物理方法。生物学方法可以最大限度的保证细胞存活率并对被转移的分子具有严格选择性，但是只能用于有限的物种及有限的分子种类(Hapala, 1997, Crit.Rev.Biotechnol.,17,105);化学法对细胞膜的破坏通常是不可逆的，会导致细胞死亡(Hapala，1997，Crit.Rev.Biotechnol., 17,105),而温和的化学法如 Ca+配合热激(Mandel and Higa, 1992,Biotechnology, 24,198)效率 非常低而且操作复杂；目前研究最多应用最广泛的是物理法，物理方法可用于许多类型的细胞而且一般操作比较简单。通过物理学方法增加细胞透性的方法主要有以下几种(Canham，US 6770480):1.显微注射:直接把物质注射到细胞内，这种方法可以有效地控制物质进入细胞的数量并保证很高的成功率，但对操作人员要求很高，每次只能处理一个细胞(Canham，US6770480 ；Soreq andSeidman, 1992,Methods Enzymol, 207, 225)。这种方法无法用于小型的细胞(Ando and Anonymous, US 07479388)。2.激光打孔:利用激光照射使细胞屏障产生损伤，溶液中的物质通过扩散作用进行转运(Ando and Anonymous, US 07479388)。但这种技术除了需要精密的仪器外效率也很低，每次只能作用于一个细胞，即使通过散射也只能作用于10X25mm的范围(Turovets,1993，Biotechniques, 15，1022)，而且只能作用于表面的细胞。因此这种技术很少被应用，而是采用更经济的物理手段。3.基因枪:用高速颗粒突破细胞屏障，将吸附在颗粒上的核酸或其他物质送入细胞(Klein，1987，Nature，327，70)，也可以直接加速被转运物质的颗粒或液滴轰击到细胞内(Mazurkiewicz, US6107095)。基因枪法也可以通过增加细胞屏障的透性使物质可以通过细胞屏障进行扩散转运(Sanford，US 5478744,2570)。这种方法用途广泛可以转运多种类型的物质(Sanford, 1993, Methods Enzymol, 217,483),并可以用于E.coli等小型细胞(Smith, 1992, Journalof General Microbiology, 138, 239)。但这类方法需要有精密的仪器来精确的控制颗粒的大小与速度以避免杀死细胞同时有足够的动能突破细胞屏障(Ginaven and Facciotti, US 5457041)，由于直接面对喷射口的细胞才能被颗粒突破细胞屏障因此处理效果不均匀，处理的细胞数量有限。4.电穿孔:通过高压电击使细胞膜产生小孔，基因等物质的溶液通过这些小孔进行转运(Rubinsky and Huang, US 07718409)。这是一种高效转运非透性分子的方法，由于是以扩散的方式转运分子，转运快速而且不受分子化学性质影响(适用于亲水分子、两性分子与大分子)，而且 可以通过调整电场强度、电场持续时间及电击次数控制细胞存活率(Sixou and Teissie, 1993, BioelectrochBioener, 31, 237)。电穿孔法是目前最常用的增加细胞透性的方法(Rubinsky and Huang7US 07718409)，并用于基因治疗和研究以及药物转运(Gehl, 2003, Acta Physiol Scand, 177,437)。但电穿孔法只对处于电极连线之间的细胞有穿孔效果；由于需要产生高强度的电场(对悬液一般为0.5kV/cm(Golzio,2002, ProcNatl Acad SciUSA，99，1292))每次处理的细胞数量有限；为了提高细胞存活率及穿孔效率需要对电压波形、电击强度、电击频率与处理时间进行精确控制，因而需要有精密的仪器。5.通过剪切力增加细胞透性:通过对细胞屏障的机械损伤增加细胞透性。主要方式有将细胞与玻璃珠混合后轻微震动(Mcneil，1989，Method Cell Biol，29，153)、将细胞与膜去稳定剂混合后震荡(Shimizu and Kawazoe, 1996, Biol Pharm Bull, 19,1279)或将细胞通过注射器反复吹吸(Clarke and Mcneil, 1992, J Cell Sci，102，533)。这些方法操作简单而且不需要精密的仪器，前两种方法还可以用于同时处理大量样品，但增加细胞透性的效率很低、细胞存活率低而且只适用于无细胞壁且细胞体积较大的动物细胞。6.细胞内吞作用:这是一种物理与生物学相结合的方法，将被转运物质与磷酸钙共沉淀，共沉淀产物可以通过胞吞作用进入细胞(Graham and van der Eb, 1973, Virology,52,456 ;Wigler，1979，Cell，16，777)。也可以将物质包被于脂质体中使物质进入细胞(Mizuguchi,1996, Br J Cancer，73，472)。这类方法可以同时处理大量细胞，但成功率很低，只适用于无细胞壁的细胞。研究发现在固体表面涂布针状纳米材料与细胞的混合液时，针状纳米材料通过滑动摩擦力可以刺穿细胞，这种现象被称为Yoshida效应(Yoshida, 2007, Recent PatBiotechnol，l，194)。这一发现被用于质粒转化并对其原理进行了推论(谭海东，2010，生物工程学报Chinese Journal of Biotechnology, 26,1379 ；Yoshida, 2008, ApplMicrobiolBiotechnol,80, 813 ;Tan,2010, InternationalJournal of Molecular Sciences,11,4962)，但产生Yoshida效应的滑动摩擦力只能在固体表面产生使这一发现无法同时作用于大量细胞，一次操作只有不到250个细胞获得质粒，而且操作时需要把细胞涂布在固体表面，增加了操作程序。以上所述的增加细胞透性的方法都无法高效经济的同时处理大量细胞，直到Rojas-Chapana等人开发了用多壁碳纳米管增加细胞透性的方法(Giersig,DE102004063150)，该方法通过微波照射细胞与碳纳米管的悬浊液，使碳纳米管尖端带电，碳纳米管与细胞表面的静电力推动针状碳纳米管在细胞屏障上产生小孔实现物质转运(Ro jas-Chapana, 2005, Lab on a Chip 5, 536)。该方法与通过剪切力增加细胞透性的方法相比效率更高并可以有效的保证细胞存活率；由于在细胞悬液中进行而不再局限于悬液表面，可以对一定体积悬液中的细胞同时进行处理，提高了处理效率。但过量的微波辐射会导致细胞大量死亡必须严格地控制处理时间与碳纳米管含量，而且微波辐射在液体中传播时会逐渐减弱导致处理效果不均匀，因此样品数量要控制在一定体积内，样品体积也受到微波处理设备的限制。
本发明涉及一种提高细胞透性的方法，更具体地讲，是通过搅拌产生的机械力使针状纳米材料在细胞屏障上产生可被细胞自我修复的小孔，增加细胞透性。为实验上述目的，本发明采用的技术方案为:一种利用针状纳米材料增加细胞透性的方法，使用物理方法刺穿细胞膜或细胞壁和细胞膜，在细胞表面形成直径0.02-0.12 μ m的小孔，产生0-94%的细胞透性增加效率。所述物理方法是在液态环境下，于液体中加入针状纳米材料，通过搅动产生的机械力使针状纳米材料刺穿细胞膜、或细胞壁和细胞膜，在细胞膜、或细胞壁和细胞膜上产生小孔，使细胞获得透性；针状纳米材料在细胞屏障上产生的小孔是可被细胞修复的，从而保证细胞的存活率；随细胞透性增加效率提高，细胞存活率降低。针状纳米材料指直径在0.02-0.12 μ m、长度在0.34-2.30 μ m之间的材料，或表面带有符合上述规格的针状物的材料；针状纳米材料与细胞以悬浮液的状态混合。 所述针状纳米材 料为海泡石。标准条件:菌体密度为10D、搅动时间为lmin、震荡强度为3000rpm，海泡石浓度为0.5%，不外加甘油改变粘度。进行下述验证:悬浮液中针状纳米材料浓度越高，透性增加效率越高；菌体密度为10D、搅动时间为Imin、震荡强度为3000rpm时，混合液中加入针状纳米材料海泡石的浓度在0.25% -0.75% (质量比)之间变化时，透性增加效率在81% -94%之间变化，细胞存活率在80% -69%之间变化；悬浮液中细胞浓度越高，透性增加效率越高，但透性增加效率越小；海泡石浓度为0.5%、搅动时间为lmin、震荡强度为3000rpm时，混合液中细胞密度在0.50D-20D之间变化时，透性增加效率在95% -88%之间变化，细胞存活率在73% -78%之间变化。悬浮液粘度越高，透性增加效率越低；悬浮液粘度可通过添加甘油来改变，粘度提高以增加体系甘油浓度来实现；海泡石浓度为0.5%、菌体密度为10D、搅动时间为lmin、震荡强度为3000rpm时，悬浮液粘度在54 X KT3Pa.s_65X KT3Pa.s之间变化时，透性增加效率在91% -83%之间变化，细胞存活率在74% -77%之间变化。所述搅动产生的机械力是通过直接搅动悬浮液本身或震荡装有悬浮液的容器产生足够使针状纳米材料刺穿细胞屏障的机械力。通过搅直接搅动悬浮液本身产生足够使针状纳米材料刺穿细胞屏障的机械力时，搅动强度越大，透性增加效率越高；海泡石浓度为0.5 %、菌体密度为10D、搅动时间为2min时，搅动悬浮液强度在800rpm-400rpm之间变化时，透性增加效率在28 % -38 %之间变化，细胞存活率在98% -89%之间变化。通过震荡装有悬浮液的容器产生足够使针状纳米材料刺穿细胞屏障的机械力时，震荡强度越大，透性增加效率越高；海泡石浓度为0.5 %、菌体密度为10D、搅动时间为Imin时，震荡强度在1000rpm-2000rpm之间变化时，透性增加效率在63% -90%之间变化，细胞存活率在84% -73%之间变化。搅动悬浮液时，连续搅动时间越长，透性增加效率越高；海泡石浓度为0.5%、菌体密度为10D、震荡强度为3000rpm时，当震荡时间在lmin-5min之间变化时，透性增加效率在93% -96%之间变化，细胞存活率在74% -54%之间变化。细胞透性验证方法:本发明使用NAD (辅酶I)或ble (博来霉素)这两种无法通过自由扩散跨膜运输的物质验证细胞透性增加效果。NAD的转运可以通过HPLC检测细胞内NAD数量的变化，ble的转运可通过ble对细胞的致死效果检测。其中NAD购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司(产品编号DH207)，ble购自Invitrogen公司(产品编号R250-01)。透性增加效率评价方法:本发明实施过程中发现，外加不同浓度的NAD时，通过增加透性吸收了 ble而死亡的细胞比例在0-95%之间变化时，该比例总是与NAD转移量成正t匕，因此通过增加透性吸收了 ble而死亡的细胞比例可以定量反映整个细胞群体获得的透性效率。因此本发明中将透性增加效率定义为(放置30min后加ble的菌落数-搅动后马上加ble的菌落数)/放置30min后加ble的菌落数。其中(放置30min后加ble的菌落数-搅动后马上加ble的菌落数)反映了可逆的增加了透性的细胞数，即存活细胞；放置30min后加ble的菌落数反映了没有获得透性的细胞数和可逆的增加了透性的细胞数。增加了透性的细胞的存活率定义为(放置30min后加ble的菌落数-搅动后马上加ble的菌落数)/ (不搅动处理直接加ble的菌落数-搅动后马上加ble的菌落数))。以上公式中(不搅动处理直接加ble的菌落数-搅动后马上加ble的菌落数)反映了被增加了透性的细胞数。本发明中透性增加效率及细胞存活率通过ble处理后平板计数结果计算获得。本发明搅动混合液从而产生机械力的方式包括但不局限于:漩涡震荡仪震荡处理、摇床中200rpm摇动培养、磁力搅拌器带动混合液中磁子搅拌。其中漩涡震荡仪使用KMC-1300V韩国Vision漩涡震荡仪，转速可在0_3000rpm之间调节；摇床使用哈尔滨东联电子技术开发有限公司HZQ-Q全温振荡器，转速可在40-350rpm之间调节；磁力搅拌器使用金坛市岸头良友实验仪器厂JB-4定时双向电子恒温磁力搅拌器，转速可在0-200rpm之间调节。本发明采用的针状纳米材料包括但不局限于:购自德国KremerPigmente有限公司的海泡石(产品编号58945)。海泡石是一种水合硅酸盐，分子式为H4Mg2Si3Oltl，外观是乳白色粉末。其颗粒为平均长度2 Pm、平均直径20nm的纤维，其中大于10 y m的颗粒不超过5%，90%以上的颗粒小于5 ii m。根据扫描电镜分析其直径在0.02-0.12 u m之间，长度在0.34-2.30iim之间(Yoshida，2007，Recent PatBi otechnol, 1,194) 因此使用海泡石在细胞膜或细胞壁和细胞膜上产生的小孔直径在0.02-0.12um之间。本发明考察的细胞类型包括但不局限于:原核生物中埃希氏菌属的Escherichiacoli BW25113 (E.coli)与真核生物中酵母属的 Saccharomyces cerevisiae BY4741 (S.cerevisiae)。本发明通过在PBS中加入不同浓度的甘油获得不同粘度的混合液，对应粘度系数参照文献(刘竹琴，2005,延安大学学报(自然科学版)Journal of YananUniversity (Natural Science Edition)，24, 58)，其中 50 甘油粘度为 54 X ICT3Pa s,60%甘油粘度为58X 10s，70%甘油粘度为65X 10S。本发明的有益效果是:本发明提供的方法对设备没有严格要求，只要能搅动混合液从而产生机械力就可以；本发明提供的方法选用的针状纳米材料容易获得、使用安全、价格合理；本发明提供的方法不依赖于细胞类型、大小、形状、数量以及是否有细胞壁；本发明提供的方法通过搅拌悬液产生的机械力使针状纳米材料刺穿细胞屏障来增加细胞透性，因而处理样品是不受体积限制；本发明提供的方法中细胞透性增加的强度可通过调整搅拌速度、调整纳米材料加入比例进行调整；本发明提供的方法可直接在培养过程中使用，不需要中断培养过程或将样品从培养容器中取出；本发明提供的方法可以有效地保证细胞存活率，不影响细胞生长。图.1为针状纳米材料与E.coli的混合悬液经过搅拌处理使E.coli细胞透性增力口，使正常情况下不可跨细胞屏障转运的NAD通过自由扩散进行转运。图1中斜线形柱表示针状纳米材料与E.coli细胞的混合悬液中加入不同浓度的NAD但不搅拌，因此NAD无法进行跨细胞屏障转运；实心柱表示针状纳米材料与E.coli细胞的混合悬液中加入不同浓度的NAD后搅拌，NAD可以随浓度梯度扩散。图2表示针状纳米材料与E.coli细胞的混合悬液经过搅拌处理后通过扩散转运的NAD的量，图中各点对应图1中各NAD浓度下搅拌的样品的菌体中NAD含量与静置的样品的菌体中NAD含量的差值。图2说明NAD是通过扩散进行转运的。图.3为在不同的时间加入NAD，E.coli菌体中NAD的量的变化。图3说明针状纳米材料含量为0.5%，漩涡震荡器处理Imin时，针状纳米材料在E.coli细胞屏障上形成的小孔需要20min修复。图4为针状纳米材料与S.cerevisiae细胞的混合悬液经过搅拌处理后通过扩散转运的NAD的量，图中各点对应各NAD浓度下搅拌的样品的菌体中NAD含量与静置的样品的菌体中NAD含量的差值。图4说明NAD是通过扩散进行转运的。图5为海泡石对E.coli在M9培养基中的生长的影响。三角曲线表示IOmL M9培养基中加入200 ii L水后37°C培养E.coli的生长曲线，方形曲线表示IOmL M9培养基中加A 200 u L 2.5%灭菌海泡石后37°C培养E.coli的生长曲线。

1.5mL离心管中，每管lmL，其中三管加入20 y L浓度0.1M的NAD，15支离心管用漩涡震荡仪3000rpm搅动lmin。搅动后未加NAD的管中取三管立即加入20 y L浓度0.1M的NAD，15支离心管在30°C放置，分别间隔10min、20min、30min取三管未加NAD的管加入20 y L浓度
0.1M 的 NAD。每只管加入NAD后立即在30°C放置20min。离心机4000rpm离心5min去上清，用900iiL PBS重悬后，离心机4000rpm离心5min去上清,用900 ii L PBS重悬后，离心机13200rpm离心5min去上清。加入800 u L溶菌酶37°C裂解30min,加入400 u L氯仿用镟润震荡仪3000rpm处理lmin, 13200rpm离心IOmin将上清转移到2mL管,冻干。冻干样品中加入200 u L 50mM醋酸铵，用HPLC检测NAD浓度，从而得到菌体中NAD的量。实施例结果见图3。根据图3，搅拌前加NAD与搅拌后立即加NAD相比，菌体中的NAD的量相差不大，说明本专利提到的方法中NAD主要通过扩散进行转运，不需要事先吸附在海泡石上，因此本专利提到的方法适用于转运所有可在溶液中自由扩散的物质，这种物质不需要被海泡石吸附。根据图3，针状纳米材料在E.coli细胞屏障上形成的小孔是可以修复的，修复过程中NAD的转运速度越来越慢，在30°C时细胞屏障在20min内可以完成修复。如果处理强度大于细胞屏障的修复速度，连续处理时间过长会导致细胞透性过大从而导致细胞死亡，因此，当需要通过较高的处理强度处理细胞时，可以通过间歇性地处理细胞来保证细胞存活率。实施例2 说明搅动海泡石与细胞的混合液可以可逆地增加细胞透性，针状纳米材料在细胞屏障上形成的小孔是可修复的，随着修复细胞透性降低。实施例3:在30°C IOOmL YEPD中培养S.cerevisiae至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至OD6tltl = 10。取5mL 上述菌液加入 100 y L 不同浓度的 NAD (0，25mM，50mM，75mM，0.1M,0.125M)和500 u L质量浓度5%的海泡石轻微混匀。每种NAD浓度分装到6支1.5mL离心管中，每管900iiL，其中三管用漩涡震荡仪3000rpm搅动lmin，另外三管不搅动。将每种NAD浓度的六支管在30°C放置20min。离心机4000rpm离心5min去上清，用900 y L PBS重悬后，离心机4000rpm离心5min去上清，用900 u L PBS重悬后，离心机13200rpm离心5min去上清。加入IOOmg玻璃珠用细胞破碎仪破碎细胞，加入400 ii L氯仿用漩涡震荡仪3000rpm处理lmin,离心机13200rpm离心IOmin将上清转移到2mL管,冻干。冻干样品中加入200 u L50mM醋酸铵，用HPLC检测NAD浓度，从而得到菌体中NAD的量。实施例结果见图4。根据图4，处理样品时胞外NAD浓度低于ImM时，搅拌处理的样品因为NAD渗出而比未搅拌样品的NAD浓度低；处理样品时胞外NAD浓度高于1.5mM时，搅拌处理的样品因为NAD进入细胞而比未搅拌样品的NAD浓度高，说明NAD根据浓度梯度扩散；细胞内外NAD浓度差异越大NAD在细胞屏障修复前转运的量越多，说明NAD的扩散符合浓度差异越大扩散速度越快的规律。实施例3说明搅动海泡石与细胞的混合液可以有效地增加真核细胞的透性。实施例4:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。 在15支50mL离心管中，取ImL上述菌液加入4mL水和5mL质量浓度I %的海泡石，加入0.2mL 0.125M的NAD轻微混匀。其中12管用漩涡震荡仪3000rpm搅动不同时间(0.5min、lmin、2min、5min)，另外 3 管不揽动。每支管取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。每支管再取90iiL混合液在30°C放置30min后，加入IOiiL 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在4°0静置301^11后稀释1000倍，取50111涂布低盐1^(似(:1 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。15支管中剩余样品在30°C放置20min。离心机4000rpm离心5min去上清，用900 V- L PBS重悬后，离心机4000rpm离心5min去上清，用900 ii L PBS重悬后，离心机13200rpm离心5min去上清。加入800 y L溶菌酶37°C裂解30min,加入400 y L氯仿用镟润震荡仪3000rpm处理lmin,离心机13200rpm离心IOmin将上清转移到2mL管,冻干。冻干样品中加入200 u L 50mM醋酸铵，用HPLC检测NAD浓度，从而得到菌体中NAD的量。不振荡时，对应细胞透性增加效率为0，NAD转移量0 ;当震荡时间为0.5min时，对应细胞透性增加效率为78%，NAD转移量8.1nmol ;当震荡时间为Imin时，对应细胞透性增加效率为89%，NAD转移量9.2nmol ;当震荡时间为2min时，对应细胞透性增加效率为92%, NAD转移量9.4nmol ;当震荡时间为5min时，对应细胞透性增加效率为95%，NAD转移量 9.4nmol0
实施例4 说明外加NAD浓度为2.5mM时，细胞透性增加效率在0-95%之间变化时，细胞透性增加效率与NAD转移量成正比。实施例5:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。在15支50mL离心管中，取ImL上述菌液加入4mL水和5mL质量浓度I %的海泡石，加入0.2mL 0.15M的NAD轻微混匀。其中12管用漩涡震荡仪3000rpm搅动不同时间(0.5min、lmin、2min、5min)，另外 3 管不揽动。每支管取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。每支管再取90iiL混合液在30°C放置30min后，加入IOiiL 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在4°0静置301^11后稀释1000倍，取50111涂布低盐1^(似(:1 0.5%)平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。15支管中剩余样品在30°C放置20min。离心机4000rpm离心5min去上清，用900 V- L PBS重悬后，离心机4000rpm离心5min去上清，用900ii L PBS重悬后，离心机13200rpm离心5min去上清。加入800 y L溶菌酶37°C裂解30min,加入400 y L氯仿用镟润震荡仪3000rpm处理lmin,离心机13200rpm离心IOmin将上清转移到2mL管,冻干。冻干样品中加入200 u L 50mM醋酸铵，用HPLC检测NAD浓度，从而得到菌体中NAD的量。不振荡时，对应细胞透性增加效率为0，NAD转移量0 ;当震荡时间为0.5min时，对应细胞透性增加效率为81%，NAD转移量12.4nmol ;当震荡时间为Imin时，对应细胞透性增加效率为91%，NAD转移量13.6nmol ;当震荡时间为2min时，对应细胞透性增加效率为94%, NAD转移量13.9nmol ;当震荡时间为5min时，对应细胞透性增加效率为96%，NAD转移量 13.7nmol0 实施例5说明细胞透性增加效率在0-94%之间变化时，细胞透性增加效率与NAD转移量成正比。随着细胞透性增加效率进一步提高，由透性增加导致的不可修复的损伤增加导致NAD转移量下降。结合实施例4，不同浓度NAD的转移量均与胞透性增加效率成正比，因此细胞透性增加效率可作为评价细胞透性的标准。实施例6:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。在IOmL圆底烧瓶中，取ImL上述菌液加入4mL水和5mL质量浓度10A的海泡石:
a.取90 ii L混合液加入10 ii L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。b.取5mL混合液于IOmL圆底烧瓶中，加入Icm长磁子,用磁力搅拌器不同转速搅拌(搅拌强度为800rpm、600rpm、400rpm)搅动样品2min，取90 y L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。c.b中剩余样品在30°C放置30min后，取90 y L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在41:静置30111111后稀释1000倍，取501^涂布低盐1^(恥(:1 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。当搅拌强度为800rpm时，对应细胞透性增加效率为38%，细胞存活率为89% ;当搅拌强度为600rpm时，对应细胞透性增加效率为33%，细胞存活率为91% ;当搅拌强度为400rpm时，对应细胞透性增加效率为28%，细胞存活率为98%。实施例6结果说明通过搅动悬浮液产生足够使针状纳米材料刺穿细胞屏障的机械力时，搅动强度越大，透性增加效率越高。实施例1:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。在1.5mL离心管中，取100 y L上述菌液加入400 y L水和500 y L质量浓度1%的海泡石:a.取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。b.取ImL混合液于1.5mL离心管中，用漩涡震荡仪不同震荡强度(3000rpm、2000rpm、IOOOrpm)搅动样品lmin，取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。c.b中剩余样品在30°C放置30min后，取90 y L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在41:静置30111111后稀释1000倍，取501^涂布低盐1^(恥(:1 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。当震荡强度为3000rpm时，对应细胞透性增加效率为90%，细胞存活率为73%;当震荡强度为2000rpm时，对应细胞透性增加效率为83%，细胞存活率为75%;当震荡强度为IOOOrpm时，对应细胞透性增加效率为63%，细胞存活率为84%。实施例7结果说明通过震荡装有悬浮液的容器产生足够使针状纳米材料刺穿细胞屏障的机械力时，震荡强度越大，透性增加效率越高。实施例8:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。在1.5mL离心管中，取100 ii L上述菌液加入400 ii L水和500 ii L质量浓度1%的海泡石:a.取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。b.取ImL混合液于1.5mL离心管中，用镟润震荡仪3000rpm搅动不同时间(lmin、2min、5min),取90 y L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。c.b中剩余样品在30°C放置30min后，取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在41:静置30111111后稀释1000倍，取501^涂布低盐1^(恥(:1 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。当震荡时间为Imin时，对应细胞透性增加效率为93%，细胞存活率为74% ;当震荡时间为2min时，对应细胞透性增加效率为95%，细胞存活率为68% ;当震荡时间为5min时，对应细胞透性增加效率为96%，细胞存活率为54%。实施例8结果说明搅动悬浮液时，连续搅动时间越长，透性增加效率越高。实施例9:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。在1.5mL离心管中，取IOOii L上述菌液加入400 ii L水和500 y L不同质量浓度(0.5%A%A.5% )的海泡石:a.取90 y L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。b.取ImL混合液于1.5mL离心管中，用镟润震荡仪3000rpm搅动样品lmin,取90 u L混合液加入10 ii L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。c.b中剩余样品在30°C放置30min后，取90 ii L混合液加入10 y L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在4°〇静置301^11后稀释1000倍，取501^涂布低盐1^(恥(:1 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。当混合液中海泡石浓度为0.25%时，对应细胞透性增加效率为81%，细胞存活率为80% ;当混合液中海泡石浓度为0.5%时，对应细胞透性增加效率为92%，细胞存活率为72% ;当混合液中海泡石浓度为0.75%时，对应细胞透性增加效率为94%，细胞存活率为69%。 实施例9结果说明悬浮液中针状纳米材料浓度越高，透性增加效率越高。实施例10:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 20。用 PBS 稀释成 OD600 = 5、10。在1.5mL 离心管中，取 IOOii L OD6tltl = 5、10、20 的菌液加入 400 y L 水和 500 y L 质量浓度I %的海泡石:a.取90 ii L混合液加入10 ii L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。b.取ImL混合液于1.5mL离心管中，用镟润震荡仪3000rpm搅动样品lmin,取90 y L混合液加入10 ii L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。c.b中剩余样品在30°C放置30min后，取90 ii L混合液加入10 u L100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在4°C静置30min后稀释1000倍，取IOOii L涂布低盐LB (NaCl 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。当混合液中菌体密度为0D_ = 0.5时，对应细胞透性增加效率为95%，细胞存活率为73% ;当混合液中菌体密度为OD6tltl = I时，对应细胞透性增加效率为93%，细胞存活率为73% ;当混合液中菌体密度为OD6tltl = 2时，对应细胞透性增加效率为88%，细胞存活率为78%。实施例10结果说明悬浮液中细胞浓度越高，透性增加的细胞数量越高，但透性增加效率越小。实施例11:在37°C100mL LB中培养E.coli至对数期，收集菌体用PBS洗两遍，用PBS重悬菌体至 OD600 = 10。在1.5mL离心管中，取IOOii L上述菌液加入800 ii L不同浓度的PBS配制的甘油(体积比浓度分别为62.5%、75%、87.5% )和100 y L质量浓度5%的海泡石:a.取90 y L混合液加入10 U L lOOmg/mL博来霉素，4°C静置30min。b.取ImL混合液于1.5mL离心管中，用漩涡震荡仪3000rpm搅动样品lmin，取90 u L混合液加入10 u L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。c.b中剩余样品在30°C放置30min后，取90 y L混合液加入10 y L IOOmg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在4°C静置30min后稀释1000倍，取50iiL涂布低盐LB(NaCl 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得不搅动处理直接加ble的活菌数、搅动后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。当混合液中甘油浓度为50%时，对应细胞透性增加效率为91%，细胞存活率为74% ;当混合液中甘油浓度为60%时，对应细胞透性增加效率为89%，细胞存活率为76% ；当混合液中甘油浓度为70%时，对应细胞透性增加效率为83%，细胞存活率为77%。实施例11结果说明悬浮液粘度越高，透性增加效率越低。实施例12:在40mL M9培养基中加入400iiL对数期的E.coli，分到四支50mL管中，每管9mL菌液，其中两管加入500 u L水，另外两管加入500 u L 5%灭菌海泡石，37°C摇床中200rpm摇动培养，检测菌体密度变化，两管结果取平均值确定生长曲线。实施例结果见图5。根据图5，海泡石会减缓搅动培养的细胞的生长但影响很小；会缩短细胞的稳定期使细胞加速进入衰亡期，但影响效果很小。实施例12说明海泡石可以用于细胞液体培养过程，在正常培养条件下海泡石几乎不影响细胞生长。实施例13:在40mL M9培养基中加 入400 u L对数期的E.coli和2mL质量浓度5%灭菌海泡石，分装成四管，每管IOmL菌液，37°C摇床中200rpm摇动培养，分别在lOmin，30min，lh，8h时取出一管。取90 ii L菌液加入IOii L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min ;其余样品在30°C放置30min后，取90 ii L混合液加入10 u L 100mg/mL博来霉素，4°C静置30min。样品在4°C静置30min后稀释100倍(8h时的样品稀释1000倍)，取50 y L涂布低盐LB (NaCl 0.5% )平板，过夜培养后菌落计数，获得取样后马上加ble的活菌数与放置30min后加ble的活菌数，每种样品测三次取平均值。由于无法确定用摇床培养IOmin时，对应细胞透性增加效率为31% ;用摇床培养30min时，对应细胞透性增加效率为79% ;用摇床培养Ih时，对应细胞透性增加效率为59% ;用摇床培养8h时，对应细胞透性增加效率为32%。实施例13说明海泡石可以在细胞液体培养过程中增加细胞透性，当细胞生长速率高于细胞透性增加速率时细胞透性增加效率降低。本发明通过搅动针状纳米材料与细胞的混合悬液,针状纳米材料在细胞膜或细胞壁和细胞膜上刺出可修复的小孔，达到增加细胞透性的目的。该方法的优点在于操作简单、处理的样品不受体积限制、无需昂贵精密的仪器、可以高效地使细胞获得透性并且保证细胞存活率。适用于增加细胞透性。


本发明公开了一种用针状纳米材料增加细胞透性的方法。通过搅动针状纳米材料与细胞的混合悬液，针状纳米材料在细胞膜或细胞壁和细胞膜上刺出可修复的小孔，达到增加细胞透性的目的。该方法的优点在于操作简单、处理的样品不受体积限制、无需昂贵精密的仪器、可以高效地使细胞获得透性并且保证细胞存活率。适用于增加细胞透性。