专利名称：与分泌者血型状态相符的益生双歧杆菌组合物的制作方法双歧杆菌构成婴儿的主要肠内微生物丛，而它们在成人群体中也很丰富，构成正常肠内微生物丛的最多10%，但其数量在老年人中开始下降。每个个体中通常寄居有I 4种双歧杆菌物种(M他to等，J Appl Microbiol 2004;98:459-470) 0除了个体间差异外，双岐杆菌物种的组成在不同年龄群中也有所不同。长双歧杆菌婴儿生物变体、短双歧杆菌以及两歧双歧杆菌是婴儿中最普遍的物种，而长双歧杆菌长生物变体、青春双歧杆菌、两歧双岐杆菌和链状双岐杆菌是成人中最普遍的物种。此外还报导了双岐杆菌的数量(Mueller等，Appl Environ Microbiol 2006;72:1027-1033)和物种组成(MMa励等，2004)在各地理区域间的变化。通常认为，双歧杆菌是促进健康的细菌，通常使用肠中双歧杆菌的数量增加来作为使用以肠健康为目的的产品(例如益生菌和益菌素)的干预性研究的終点。双岐杆菌属的菌株被用作益生菌。然而，由于该属的稳定性方面的技术难题，目前市面上仅能获取到很少的特殊物种和菌株，主要为动物双歧杆菌乳亚种。双岐杆菌或含有双岐杆菌的菌株混合物在例如减轻以下病症的症状方面已显示出很有前景的结果肠易激综合征(Brenner 和 Chey, Rev Gastroenterol Disord. 2009;9:7-15)、炎性肠病(Macfarlane 等，Crit Rev Clin Lab Sci. 2009;46:25-54)、腹湾(Chouraqui 等，JPediatr Gastroenterol Nutr. 2004; 38:242-3)、特应性湿疫(Yoo 等，Proc Am Thorac Soc2007;4:277-282)和感冒(deVrese 等，Clin Nutr. 2005; 24:479-480)。除了上述的稳定性问题外，另ー个难题是下述事实一部分研究受试对象通常对测试益生菌或益菌素无应答(Fuccio 等，J Clin Gastroenterol 2009;43:506-513 ;Fuimori 等，J.GastroenterolHepatol 2007;22:1199-1204)。这些个体通常被称作“非应答者”。非应答性背后的原因尚不知晓。双歧杆菌的主要拓殖部位是结肠，但其也存在于口腔中；而且，已从人乳中分离出双岐杆菌(Martin 等，Appl Environ Microbiol. 2009，75:965-969)。双岐杆菌的主要能量源是不可消化的食用糖和内源性粘液。双歧杆菌能够降解作为底物的包括人乳寡糖在内的各种寡糖以及存在于粘液中的复合糖。已显示数种双歧杆菌粘附于肠粘液(He等，Microbiol Immunol 2001,45, 259-262) 据显示，通过补充岩藻糖可增强两歧双歧杆菌与粘液的粘附(Guglielmetti 等,Curr Microbiol. 2009; 59:167-172)。哺乳动物(包括人)肠中的大量多样的微生物株和物种，以及证明了肠中微生物物种组成并不会直接预示其功能性效果的发现，已表明难以预测单一益生菌或正常菌群物种的功能(Tap等，EnvironmMicrobiol 2009,11,2574-2584)。生态系统的复杂性实在过高。对宿主遗传因素在决定正常肠微生物丛组成中的作用也知之甚少。已报道了细菌和病毒的某种单ー病原性物种与血型抗原的结合。特别而言，幽门螺杆菌与胃中的 Lewis b (Leb)抗原结合(Boren 等，Science 1993; 262:1892-1895),诺洛病毒(Norovirus)与 ABHja Leb 抗原结合(Huang 等，J Virol. 2005; 79:6714-6722)。肺炎链球菌能够结合A和B血型抗原并利用聚糖(Higgins等，J Mol Biol. 2009; 388: 299-309) 0血型抗原并不存在于所有个体的粘液中。这些据称具有“非分泌者”血型的个体不具有在合成分泌血型抗原时所需的功能性FUT2基因(Henry等，Vox Sang1995;69 (3) : 166-182)，因此并不分泌分泌物中和粘膜上的ABH抗原。而具有血型“分泌者”的那些个体则具有粘膜上的抗原。在多数群体中，非分泌者个体的频率远低于分泌者状态的频率，约15% 26%的斯堪的纳维亚人属于非分泌者类别(Eriksson等，Ann HumBiol. 1986; 13 (3) : 273-85)。可以将分泌者/非分泌者状态看成是正常血型系统，且能够用标准血液采集操作规程(Henry等，1995)来确定该表型。已鉴定出了如下基因型在欧洲人群体中引起非分泌者(NSS)表型的FUT2基因大突变(Silva等，Glycoconj 2010;27:61-8)。已表明非分泌者表型在遗传上与下述现象相关例如，克罗恩氏病风险增加(McGovern等，Hum Molec Genet 2010; 19:3468-76)，血液中的高维生素 B12 水平(Tanaka 等，Am J Hum Genet 2009;84:477-482)，对 HIV 病毒感染的易感性(Ali 等，J Infect Dis 2000; 181:737-739),实验性阴道念珠菌病(Hurd 和 Domino Infection Immunit2004;72:4279-4281)，哮喘风险增加(Ronchetti 等，Eur Respir J 2001;17:1236-1238),泌尿道感染风险增加(Sheinfeld等，N Engl J Med 1989; 320:773-777)，ETEC引起的腹泻的风险增加(Ahmed等，Infect Immun. 2009; 77:2059-2064)，和动物出血性疾病病毒(Guillon 等，Glycobiology 2009;19:2ト28)。
本发明的目的涉及根据在至少ー个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不常见的双歧杆菌谱而定制的微生物组合物或益生菌组合物。本发明的另ー个目的涉及根据在至少ー个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在非分泌者血型表型个体中不常见的双歧杆菌来定制微生物组合物或益生菌组合物的方法。此夕卜，本发明的ー个目的是益菌素、分子化合物或额外的支持性细菌菌株用于提高所述微生物组合物或益生菌组合物在肠内的数量和/或扩大其在肠内的生长和/或功能性的应用。本发明的又ー个目的是个体的分泌者血型状态作为补充富含双歧杆菌的益生菌的标准的应用。本发明的再ー个目的涉及通过确定个体的分泌状态来评估该个体对补充富含双歧杆菌的益生菌的需求的方法。本发明的又一目的是个体的分泌者血型状态在估算得到想要的效果所需的双歧杆菌补充剂量中的应用。本发明的再ー个目的是提供通过确定个体的分泌状态来鉴定该个体具有罹患胃肠病症的风险的方法。本发明的其他目的是用于治疗和/或预防诸如炎性肠病、腹泻、呼吸道感染、肠易激综合征和/或遗传性过敏症/过敏症等疾病的益生菌组合物。据认为，这些疾病或病症与个体中不平衡的粘膜微生物丛有夫。本发明是基于以下观察做出的与具有分泌者表型的个体相比，具有非分泌者血型表型的个体的肠内细菌种群中的双歧杆菌的量和多样性均有所减少。此外，本发明还基于以下观察非分泌者个体的双歧杆菌种群显示出变化了的功能性，例如，在上胃肠道环境的严酷条件中存活率降低。可以将这些观察用作对个体中特别是非分泌者个体中的双歧杆菌肠内种群进行靶向调节的基础，从而得到更高多祥性和/或更多量的双歧杆菌物种或菌株。換言之，所述调节的目的在于使非分泌者的双歧杆菌的多祥性和/或量与分泌者个体中通常所见的多祥性和/或量相似。因此，本发明提供一种用于优化益生菌组合物中的细菌尤其是双岐杆菌的含量的新颖且有效的方法。这种组合物在用于非分泌者血型表型个体中时特别有效。 本发明的目的是通过独立权利要求中所述的方法和应用来实现的。从属权利要求中描述了本发明的优选实施方式。本发明的其他目的、细节和优点将从以下附图、详细说明和实施例中变得明显。图I显示了 7个非分泌者个体和7个分泌者个体的粪便样品中的双歧杆菌多祥性的DGGE凝胶图像。M=标记物。姆条泳道表示单ー样品。图2图示了基于对双歧杆菌信息的DGGE分析的三维PCA图。图3图示了显示出DGGE条带位置的双歧杆菌DGGE信息的PCA双标图，所述条带位置对第一和第二主成分的贡献最大，第一和第二主成分一起解释了方差的56. 3%。插入图示出了条带位置，其对主成分的贡献最大。点表示非分泌者样品，星表示非分泌者样品，方 块则表不分泌者状态未知的样品。图4图示了分泌者个体和非分泌者个体之间的基于双歧杆菌DGGE信息检验的香农(Shannon)多祥性指数。显示了非分泌者个体和分泌者个体之间的P值和t检验。图5图示了根据对序列的Blast捜索得到的双歧杆菌DGGE凝胶的条带位置的身份。用数字标注了已切出且经测序的条带。粗体字显示了条带位置，其在非分泌者中要么缺失要么很少检出。条带位置的身份用箭头示于凝胶旁边，数字的顔色表示了属于同一条带位置且具有相同序列的条带条带位置26. 6%(青春双歧杆菌)包括经测序的条带15、24、27和29 ;条带位置29. 7% (两歧双岐杆菌)包括经测序的条带6、16、20和32 ;条带位置53. 5%(长双歧杆菌)包括经测序的条带1、3、7、9、12、21和33 ;条带位置55. 0%(双歧杆菌物种)包括经测序的条带4和18 ;条带位置62. 2%(未经培养的双歧杆菌)包括经测序的条带1、5、13、19、25、31和37 ;条带位置63. 7% (链状/假链状双歧杆菌)包括经测序的条带22和34。基于单ー序列的条带位置的身份如下(黒色)8=双歧杆菌物种(链状双歧杆菌)，11=青春双歧杆菌，17=未经培养的双歧杆菌(反刍双歧杆菌)，30=未经培养的双歧杆菌(青春双歧杆菌)，36=未经培养的双歧杆菌(反刍双歧杆菌)。括号中的菌株名称表示与所示序列的亲缘关系最接近的可培养菌株(如果存在)。图6显示了非分泌者个体、分泌者个体和分泌者状态未知的个体的归ー化后的DGGE信息图。灰色框中的数字和垂直线表示条带位置，垂直线上的星形符号表示被分级划入这些条带位置的条带。图7图示了双歧杆菌DGGE信息的PCA图，其显示了对来自非分泌者个体(n=14)和分泌者个体(n=57)的样品的聚类(左)以及对第一和第二主成分贡献最大的DGGE条带(右)。来自非分泌者个体的样品在分泌者样品中形成了独立的聚类(由圆圈表示)。 图8图示了非分泌者个体和分泌者个体中的双歧杆菌的多祥性(A)和丰度(B)。表明了使用ANOVA测得的非分泌者个体和分泌者个体之间的显著差异。该分析排除了未发生双歧杆菌扩增的样品(I个非分泌者个体和6个分泌者个体)。图9图示了用qPCR定量的非分泌者个体(14)和分泌者个体(57)中的细菌、双歧杆菌和双歧杆菌群的检出频率(左)和箱线图(右)。表明了 Wilcoxon检验中非分泌者和分泌者之间的显著差异。

条带位置基因雨名称I
7,5%双歧杆菌基因型I
3.5%双歧杆菌基因型2
12.6%双歧杆菌基因型3
17.7%双歧杆菌基_型5
24.9%双歧杆菌基因: 8
26.6%青春双歧杆菌
31.2%双歧杆菌基因型9
33.0%双歧杆菌基因型10
39.3%双歧杆菌基因型11
44.5%双歧杆菌基因型13
45.7%双歧杆菌基因型14
46.1%双歧杆菌基因型15
57.3%双歧杆菌基因型19
63.7%链状/假链状双歧杆菌
69.3%_双歧杆菌基因型21_下表2中列出了至少在ー个非分泌者个体中存在的双歧杆菌DGGE基因型。条带位置详见图6。表2.经发现至少在ー个非分泌者个体中存在的双歧杆菌基因型
条带位置31因型名称；
16.3%双歧杆菌基因W 4
20.4%双歧杆菌基闪型6
22.3%双歧杆菌基因型7
29.7%两歧双歧杆菌43.8%_双歧杆菌基因型12 _
47.3%双歧杆菌基闪型16
49.5%双歧杆菌基因型17
55.0%双歧杆菌基因型18
62.2%双歧杆菌基因型20
53.5%长双歧杆菌根据DGGE基因型和分离出的菌株，本发明人能够鉴定出非分泌者个体和分泌者个体中更详细的双歧杆菌组成，即，鉴定出物种和诊断性16S rRNA核苷酸序列的条带位置。简言之，本发明人从显示粪便样品信息的DGGE凝胶中切出条带位置，对条带中的DNA片段进行测序，并在序列数据库中为它们寻找亲缘关系最接近者。此外，为了筛选出与所观察到的粪便样品的DGGE条带具有相似的16S rRNA基因片段解链行为(S卩，序列)的菌株，在DGGE中对从非分泌者个体和分泌者个体的粪便样品中分离出的菌株进行了分析。根据DGGE条带中的序列和具有对应条带的双歧杆菌菌株，将条带并进一歩将条带位置与双歧杆菌物种关联起来。表3和表4分别示出了在非分泌者个体中和仅在分泌者个体中检测到的基因型的双歧杆菌物种和诊断性16S rRNA片段序列。下表3中列出了经发现至少在ー个非分泌者个体中存在的双歧杆菌菌株。
表3.经发现至少在ー个非分泌者个体中存在的双歧杆菌菌株


本发明涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌谱而定制的微生物组合物或益生菌组合物。本发明还涉及根据在至少一个具有分泌者血型表型的个体的肠内存在但在具有非分泌者血型表型的个体中不常见的双歧杆菌来定制微生物组合物或益生菌组合物的方法。