专利名称：神经调节蛋白用于预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的方法和组合物的制作方法缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注，本来是医师们的目的所在，而且事实上在大多数情况下也确能收到良好的治疗效果。但在一定条件下再灌注反而引起更加严重的后果。这不仅见于临床，而且也为不同种属(兔、大鼠、豚鼠、狗、猪等)的大量动物实验所证明。这是一种反常现象，称之为再灌注损伤(ischemia reperfusioninjury, IRI)。自从I960年Jennings第一次提出心肌缺血再灌注损伤的概念以来，其已经成为心血管研究的热点问题。心肌持续性缺血导致组织损伤和细胞死亡，早期再灌注能够减轻心肌缺血的损伤程度，但是大量的动物实验和临床观察，再灌注后在改善心肌供血的同时又加重了单纯心肌缺血所造成的损伤，出现心律失常、梗死面积扩大、持久性心室收缩功能低下等状况。IRI的生化特征是在缺血过程中氧气损耗，造成细胞内钙离子浓度上升，之后再灌注过程中会发生再充氧并伴随着活性氧的产生(Piper HM, et al. , Annals ofThoracic Surgery 2003,75 :644 ；Yellon DM,et al. ,New England Journal of Medicine2007,357 :1121)。心梗所带来的50 %左右的心脏损伤可能是由于再灌注损伤造成的(Yellon DM, et al. , New England Journal of Medicine2007, 357 :1121)。病理变化可出现心肌细胞水肿、细胞膜和细胞器膜完整性破坏、肌纤维出现破坏性断裂超微结构的改变、微血管损伤和无再灌注现象等。因此，心肌缺血再灌注损伤成为影响患者缺血/再灌注后心脏结构和功能恢复的主要因素。由于近年医学的发展进步；使缺血再灌注损伤愈益受到重视。例如断肢再植和器官移植就存在缺血肢体和器官的再灌注问题。又如动脉搭桥术后、溶栓疗法之后，休克治疗之后均可能发生缺血与再灌注损伤。缺血再灌注损伤的机制目前仍不是非常明确。可能的机制包括氧自由基的堆积(RuizGinesJA 等，J Cardiovasc Pharmacol, 2000, 35 (I) :109-113), I丐离子超载(ShenAC 等，Am J Pathol,1972,67(3) :441-452 ;Sjaastad I 等，Acta Physiol Scand,2002,175(4) :261-269),能量代谢障碍(谷天祥等，中华心血管病杂志，2001，29 (7) =420-423 ；Nordlie MA 等，J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2006,11 (I) : 17-30),中性粒细胞的聚集(Hoffman JW 等，J Extra Corpor Technol, 2004,36(4) :391-411)等等。针对这些机制，可采取的用于防治缺血再灌注损伤的手段包括尽早恢复血流，减少缺血时间；灌注时低压、低流、低温；清除自由基，比如外源性S0D、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(allopurinol)、维生素E、维生素C、过氧化氢酶、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)等自由基清除剂；改善缺血组织代谢，比如补充糖酵解底物如磷酸己糖保护缺血组织，外源性ATP恢复细胞膜功能，氢醌、细胞色素C延长缺血组织的可逆性改变期限，添加免疫抑制剂也可降低损伤，如环孢素A，他克莫司，吗替麦考酚酯，另外单克隆抗体如巴利普单抗，赛尼哌、莫罗莫那和皮质类固醇等。尽管有可选择的治疗手段，但是临床结果并不令人满意。因此迫切需要一种新的更加有效的治疗方法和治疗试剂用来预防、治疗或延迟各种缺血带来的缺血再灌注损伤。神经调节蛋白(Neuregul in, NRG ；Heregulin, HRG),属于表皮生长因子样(EGF-Iike)家族，是一类结构上相似的生长分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4以及它们的异构体，行使了一系列的生物学作用刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌(LessorT 等.J Cell Biochem. 1998 ;70 (4) :587-595);诱导神经脊细胞分化为 Schwann 细胞(Topilko P 等，Mol Cell Neurosci. 1996 ;8 (2-3) :71-75);刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成(AltiokN等，EMBO J. 1995 ；14(17) =4258-4266);以及促进心肌细胞成活和DNA合成(Zhao YY 等，J Biol Chem. 1998 ;273 (17) : 10261-10269)。用 NRG 基因严重缺陷的小鼠胚胎做的活体研究证明NRG对于心脏和神经发育是必需的。NRG的受体属于EGF受体家族，包括EGFR，ErbB2,ErbB3和ErbB4，它们在多种细胞功能比如细胞生长、分化和存活中发挥了重要的作用。它们属于络氨酸激酶受体，有胞外的配体结合功能区、跨膜区和胞内的络氨酸激酶功能区组成。当NRG结合到ErbB3或ErbB4的胞外区后，引起其构象改变从而导致ErbB3/ErbB4或ErbB2/ErbB3异二聚体的形成或ErbB4/ErbB4同二聚体的形成,并且引起其C末端的磷酸化。磷酸化的C末端可以进一步结合胞内的下游信号蛋白，激活AKT和(或)ERK信号通路，并最终引起一系列的细胞反应比如刺激或抑制细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞黏附。在这些受体中，在心脏组织表达的主要是 ErbB2 和 ErbB4(Zhao YY 等，Circ Res. 1999 ；84(12) :1380-1387)。已有的证据表明，NRG-I的EGF样结构域，包含50到64个氨基酸，足以结合并激活受体(Culouscou JM 等，J Biol Chem. 1995 ；270(21) : 12857-12863)。NRG-1 β 可以以较高的亲和力结合到ErbB3和ErbB4。而ErbB2可与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体,其与配体的亲和力高于ErbB3或ErbB4同源二聚体与配体的亲和力。神经发育学的研究证实交感神经系统的形成需要NRG-I β、ErbB2和ErbB3的信号传导(Britsch S等，Genes Dev. 1998 ；12(12) :1825-1836)。而干扰NRG-I β或ErbB2或ErbB4的表达将由于心脏发育的缺陷引起胚胎死亡(Gassmann M等，Nature. 1995 ；378(6555) :390-394)。最近的研究强调，NRG-1 β、ErbB2和ErbB4不仅对心脏发育至关重要，同时对成年心脏的功能维持也起到非常重要的作用(Kuramochi Y 等，J Mol Cell Cardiol. 2006 ；41 (2) :228-235)。NRG-1 β 被证明可以加强成年心肌细胞肌小节的形成。在多种心衰动物模型中发现，NRG-IiiEGF样结构域的摄入可以显著提高心脏功能，防止心功能的恶化(Liu等，JAm Coll Cardiol. 2006 ；48 1438-1447)。在临床试验中，NRG也显示了对各种病因引起的慢性心力衰竭患者的治疗作用，显著提高了其心脏功能(CN200910057390. 5)。在大脑缺血再灌注动物模型中，NRG-I也显示了对脑细胞显著的保护性作用，抑制脑细胞凋亡，增强神经功能，减小梗死面积(LiQ等，Neurosci Lett. 2008 ；443(3) =155-159) 虽然有证据表明，心脏缺血再灌注诱导了NRG-I的释放，激活心肌细胞NRG/ErbB信号通路(Kuramochi Y等，J Biol Chem. 2004 ；279(49) :51141-51147) JSNRG-I在心脏缺血再灌注损伤中的作用仍然没有清楚地阐明。本发明提供了上述需求的方法和组合物。本发明提供了预防、治疗和/或延缺血再灌注损伤的方法和组合物。
A.发明概述本发明是基于NRG对心脏发育至关重要，对成年心脏的功能维持也起到非常重要的作用的科学发现；基于NRG可以加强心肌细胞肌小节和细胞骨架以及细胞间连接的形成的科学发现；基于NRG在各种动物模型和临床试验中可以提高心衰动物或病人的心脏功能的科学发现；基于NRG在大脑缺血再灌注动物模型中显示对脑细胞的保护作用的科学发现。NRG，NRG多肽，NRG突变体或其它具有NRG样功能的复合物都属于本发明的范畴。 本发明的第一个方面，是提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺血再灌注损伤的药物制剂。在一个优选的实施方案中，缺血再灌注损伤是心脏缺血再灌注损伤。该药物制剂包含有效量的NRG或其功能片段，或编码NRG或其功能片段的核酸，或提高NRG产量和/或功能的物质，以及药学上可以接受的载体、赋形剂等。本发明的第二个方面，是提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺血再灌注损伤的方法。在一个优选的实施方案中，缺血再灌注损伤是心脏缺血再灌注损伤。该方法包括对需要或希望预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的哺乳动物特别是人施用有效量的NRG或其功能片段，或编码NRG或其功能片段的核酸，或提高NRG产量和/或功能的物质，从而达到预防、治疗或延迟缺血再灌注损伤的效果。本发明的另一个方面，是提供了一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺血再灌注损伤的组合物/复合物。该组合物/复合物包含了本发明提供的药物制剂，包含有有效量的NRG或其功能片段，或编码NRG或其功能片段的核酸，或提高NRG产量和/或功能的物质，以及其它预防、治疗或延迟缺血再灌注损伤的预防或治疗药物。在一个优选的实施方案中，缺血再灌注损伤是心脏缺血再灌注损伤。本发明还提供了一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺血再灌注损伤的药盒，其中包含了一次或多次使用剂量的上述预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的药物制剂或组合物/复合物，以及如何使用该药物制剂或组合物的说明书。在一个优选的实施方案中，缺血再灌注损伤是心脏缺血再灌注损伤。本发明所提供的药物制剂或组合物，可以在缺血再灌注损伤发生前、发生时或发生后给予。当用于预防时，一般在缺血再灌注损伤发生前给药。当用于治疗时，一般在缺血再灌注损伤发生后给药。在一个实施方案中，本发明所提供的药物制剂或组合物，在缺血发生之前给药。在一个实施方案中，本发明所提供的药物制剂或组合物，在心脏缺血发生后，再灌注之前给药。在另一个实施方案中，本发明所提供的药物制剂或组合物，在再灌注发生后给药。B.释义除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。除非特别指明，在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。此处所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能够结合并激活ErbB2、ErbB3,ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括神经调节蛋白的异构体、神经调节蛋白中的EGF样功能域、包含神经调节蛋白EGF样功能域的多肽、神经调节蛋白的突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体的神经调节蛋白样的基因产物。神经调节蛋白还包括NRG-I, NRG-2, NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG样功能的复合物。优选的，神经调节蛋白是可以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。作为例子，但并非为了限制的目的，本发明的神经调节蛋白是NRG-I β 2异构体的一个片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了 EGF样功能域。该片段的氨基酸序列为SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTCDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ ID NO :1)。本发明所用神经调节蛋白可以激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；促进心肌细胞的分化、存活以及DNA合成。神经调节蛋白还包括那些具有并不实质性影响生物学功能的保守性突变的神经调节蛋白突变体。本技术领 域中普通技术人员熟知，非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变(参见Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition, 1987,The Bejacmin/Cummings Pub. co. ,p. 224)。本发明所用神经调节蛋白可以从天然的来源分离得到，或者通过重组技术、人工合成或其它手段得到。此处所用“EGF样功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所编码的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段，并且与下述参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似性W0 00/64400 ;Holmes等，Science,256 :1205-1210(1992);美国专利 5，530，109 和 5，716，930 ；Hijazi 等，Int. J. Oncol.，13 :1061-1067(1998) ；Chang 等，Nature, 387 :509-512(1997) ；Carraway 等，Nature, 387 512-516(1997) ;Higashiyama 等，J. Biochem.，122 :675-680 (1997);以及 WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF样功能域结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-I的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域是指NRG-I的第177-226位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-2的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-3的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-4的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含美国专利5，834，229中描述的氨基酸序列Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp LeuSer Asn Pro。缺血再灌注损伤是指经历缺血后细胞、组织或器官重获血流灌注或氧供后，对细胞、组织或器官所产生的损伤作用。缺血再灌注损伤会影响多种组织和器官。本发明提供的方法和组合物能治疗缺血再灌注损伤,如心脏缺血再灌注损伤,脑缺血再灌注损伤，肾缺血再灌注损伤，肝缺血再灌注损伤，皮肤缺血再灌注损伤，肠缺血再灌注损伤，小肠缺血再灌注损伤，胃缺血再灌注损伤,肺缺血再灌注损伤,胰缺血再灌注损伤,骨骼缺血再灌注损伤，腹肌缺血再灌注损伤，四肢缺血再灌注损伤，肠系膜缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤可能由，举个例子来说，自然事件导致(如心梗之后血流的恢复)、外科创伤导致，或一次或多次外科手术或治疗干预措施导致，该手术或干预发生过缺血后细胞、组织或器官的血流恢复。上述所述的外科手术或治疗干预措施包括，如冠状动脉搭桥术、冠状血管成形术、器官移植手术、断肢再植术、溶栓治疗、休克疗法和心脏体外循环手术。对于因治疗干预措施导致的缺血再灌注损伤的治疗，如外科手术，优选的治疗是本发明提供的组合物/复合物在治疗干预措施之前施用给接受治疗的受试者；如，受试者可在治疗干预措施前5、10、20、30分钟或1、2、3、4、12、24、48小时或一星期前给药治疗。相应地，本发明提供的组合物/复合物也可在治疗干预措施进行时施用给受试者；如，受试者进行治疗干预措施时可连续施用本发明提供的组合物/复合物或在治疗干预措施过程中分一次或几次进行(如15分钟一次)。再者，本发明提供的组合物/复合物在治疗干预措施之后施用给接受治疗的受试者；如，受试者可在治疗干预措施前5、15、30分钟或1、2、3、4、12、24、48小时或一星期后给药治疗。此处所用的“有效剂量”是指在施用的条件下，无论体外体内或间接体内，该一定剂量能够获得预期要求的效果，如，举例来说，一定剂量能够抑制或治疗个体的缺血再灌注 损伤。本领域技术人员能根据情况采取合适的方法测量治疗的效果。在某些实施方案中，本发明的组合物的有效剂量意味着能够有效降低心梗面积的剂量。在某些实施方案中，NRG的有效剂量是指从 O. I μ g/kg 到 lmg/kg,从 O. I μ g/kg 到 10 μ g/kg,从 0· 3 μ g/kg 到 I μ g/kg,从 10 μ g/kg 到 100 μ g/kg,从 5 μ g/kg 到 20 μ g/kg,从 10 μ g/kg 到 30 μ g/kg。在某些实施方案中，NRG的有效剂量是指从2U/kg到20000U/kg，从2U/kg到200U/kg，从6U/kg到20U/kg,从 200U/kg 到 2000U/kg，从 100U/kg 到 400U/kg，从 200U/kg 到 600U/kg。在某些实施方案中，NRG的有效剂量是指从O. I μ g/kg/d到lg/kg/d,从O. I μ g/kg/d到10 μ g/kg/d,从 0. 3 μ g/kg/d 到 I μ g/kg/d,从 10 μ g/kg/d 到 100 μ g/kg/d,从 5 μ g/kg/d 到 20 μ g/kg/d,从10 μ g/kg/d到30 μ g/kg/d。在某些实施方案中，NRG的有效剂量是指从2U/kg/d到 20000U/kg/d，从 2U/kg/d 到 200U/kg/d，从 6U/kg/d 到 20U/kg/d，从 200U/kg/d 到 2000U/kg/d,从 100U/kg/d 到 400U/kg/d，从 200U/kg/d 到 600U/kg/d。此处所用“活性单位”或“ 1U”是指能诱导50%最大活性反应的剂量。具体来说，为了测定某一活性实际的活性单位必须测定EC50值。比如某一批次的神经调节蛋白的EC50为O. 05 μ g/ml,那么活性单位即为O. 05 μ g/ml。进一步说,如果I μ g测定物的活性单位也可以用20U(l/0.05)表示。EC50的测定方法可以使用本发明中所使用的方法测定，亦可以通过其它本技术领域中所知的方法测定。这种活性单位测定的方法对于基因工程产物和临床药物的质量控制非常重要，它使得同一药物的不同批次以及不同的药物之间可以通过统一的标准来定量。在某些例子中，纽兰格林的单位是通过用激酶受体活化酶联免疫吸附法(KIRA-ELISA)测量纽兰格林的活性而确定的，如W003/099300和Sadick et al.，1996，Analytical Biochemistry, 235 :207-14中详细描述的，其内容通过引用而完整地合并于此。简言之，该方法测量了纽兰格林诱导的贴壁的乳腺癌细胞系MCF-7的ErbB2活化和磷酸化。用Triton X-100裂解液来溶解膜蛋白，其中的受体被包被在ELISA孔中的与ErbB3或ErbB4无交叉反应的ErbB2特异性抗体(如H4)捕获。受体的磷酸化程度通过抗磷酸化酪氨酸抗体ELISA测定。本发明的组合物可以以静脉输液、口服、腹腔内给药或皮下给药等途径施用。静脉给药是优选的施用方式。在某些实施方案中，本发明的组合物采取持续滴注的方法施用，每天滴注至少I小时，或4小时，或10小时，或12小时，18小时以上，甚至24小时。同样，本发明的组合物也可以以特定剂量表或“治疗周期”的形式施用。本组合物的每天的剂量和剂量表在前面已详细描述。治疗周期可以持续2天、5天、7天、10天、2周、3周、4周、2个月、3个月或6个月。本发明的组合物的剂型可采取单次剂量或多次剂量密闭容器，如安瓶和药瓶。本发明的组合物能与其他预防、治疗和/或延迟缺血再灌注损伤的药物联用以达到预防、治疗和/或延迟缺血再灌注损伤。上述药物包括但不仅限于，自由基清除剂比如外源性S0D、别嘌呤醇(allopurinol)、维生素E、维生素C、过氧化氢酶、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO);改善缺血组织代谢的药物，比如糖酵解底物磷酸己糖，外源性ATP，氢醌、细胞色素C和免疫抑制剂，免疫抑制剂包括环孢素A，他克莫司，吗替麦考酚酯，另外单克隆抗体如巴利普单抗，赛尼哌、莫罗莫那和皮质类固醇等。当本发明的组合物作为复合物同其他药物联用以预防、治疗和/或延迟缺血再灌注损伤时，该组合物可以在联用的药物 前施用，或同时施用，或在联用的药物后施用。

图I显示各组大鼠心脏切面TTC染色结果。切面中白色区域(TTC未染区)为梗死区域。A、B、C、D分别代表A组、B组、C组和D组。

0.178±0. 047，B 组(10ug/kg/h rhNRG-1)大鼠心肌梗死面积比为 0. 130±0. 049，与 A 组相t匕，梗死面积相差显著(P < O. 05),明显减小。C组(30ug/kg/h rhNRG-1)大鼠心肌梗死面积比为O. 121±0. 047，与A组相比，梗死面积相差显著(P < O. 05)，明显减小。D组(重组人胸腺素-β4)大鼠心肌梗死面积比为O. 151±0. 030，与各组相比，无显著差异。(详见表2及图I)。表I.实验分组及给药情况


本发明涉及神经调节蛋白用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人缺血再灌注损伤的方法和组合物。本发明通过大鼠再灌注损伤模型，证明神经调节蛋白可以在缺血再灌注过程中减小梗死面积，提示神经调节蛋白可以用于预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤。