专利名称：生产高水平二十碳五烯酸的重组微生物宿主细胞的制作方法二十碳五烯酸[“ΕΡΑ ;顺式-5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸；ω-3]的临床和药物价值是众所周知的(美国专利申请公布2009-0093543-Α1 )。类似地，相对于从天然的微生物源或通过分离从鱼油和海洋浮游生物生产ΕΡΑ，利用重组方法在微生物中生产EPA的优点也是被充分认可的。尽管文献报道了负责EPA的生产的ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生物合成途径的多个部分在其中被引入植物和非含油酵母的许多最近的例子，申请人的受让人的主要努力聚焦在含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)(美国专利7，238，482 ;美国专利7，932，077 ;美国专利申请公布2009-0093543-Α1 ;美国专利申请公布2010-0317072-Α1)的使用上。含油酵母被定义为天然地能够合成和积聚油的那些酵母(其中油的积聚为细胞干重的至少25%)，或经过遗传工程改造，使得它们变得能够合成和积聚油的那些酵母(其中油的积聚为细胞干重的至少25%)。更具体地，美国专利7，932，077展示了通过表达下列基因:Λ9延伸酶、Λ8去饱和酶、Λ 5去饱和酶、Λ 17去饱和酶、Λ 12去饱和酶和C16/18延伸酶，在重组解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytic a)菌株中，占总脂肪酸[“TFA”]9%的EPA的生产而没有Y -亚麻酸[“GLA”；gj-6]的共合成。美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了通过表达下列基因:Λ 9延伸酶、Λ 8去饱和酶、Δ 5去饱和酶、Δ 17去饱和酶、Δ 12去饱和酶、C16/18延伸酶和二酰基甘油胆碱磷酸转移酶，在重组解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株中产生占TFA至多55.6%的EPA的优化的重组解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株。美国专利申请公布2010-0317072-A1描述了进一步优化的重组解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株，其产生包含占TFA高至50%的EPA的微生物油，并且具有以TFA的重量百分比测量的EPA对以TFA的重量百分比测量的亚油酸至少3.1的比率。除了表达如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所详述的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因之外，这些改进的菌株的特征还在于:I)包含至少一种复合酶，其中所述复合酶包含多肽，所述多肽具有至少一个脂肪酸Λ 9延伸酶，所述脂肪酸Λ 9延伸酶连接至少一个脂肪酸Λ 8去饱和酶[“DGLA合酶”]；2)任选地包含至少一种编码酶的多核苷酸，所述酶选自丙二酰-Cok合成酶或酰基-CoA溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”];以及3)包含至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达已被下调。尽管有以上引用的公开，就允许除高的总脂质含量外，还有占总脂肪酸的高重量％的EPA生产，同时使中间体脂肪酸如亚油酸[“LA”; ω-6]的生产和最终的油产物中的副产物脂肪酸最小化的EPA商业生产而言，菌株的改善依然是必要的。通过工程化改良的优化的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株，申请人已解决了上述问题,其中所述改良使得能够生产包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少25重量％的EPA的微生物油。
在第一实施例中，本发明涉及重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞产生油，所述油包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少25重量％的二十碳五烯酸。在第二实施例中，本文公开了油，所述油包含以总脂肪酸的重量百分比测量的至少45重量％的二十碳五烯酸。优选地，上述的两种油中任一种具有以总脂肪酸的重量百分比测量的二十碳五烯酸对以总脂肪酸的重量百分比测量的亚油酸至少2.4的比率。在第三实施例中，本文公开了重组微生物宿主细胞，其包含:(a)至少一种包含多肽的复合酶，所述多肽具有至少一种Δ9延伸酶，所述Λ9延伸酶连接至少一种△ 8去饱和酶；(b)至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达已被下调；和·(c)至少两种多肽，所述多肽具有至少溶血磷脂酸酰基转移酶[“LPAAT”]活性；(d)至少一种多肽，所述多肽具有至少磷脂:二酰基甘油酰基转移酶[“PDAT”]活性。在第四实施例中，所述重组微生物宿主细胞还可以包含至少一种突变Λ9延伸酶多肽，其中所述突变Λ 9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ IDΝ0:1与SEQ ID NO: 3具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自:i)L35F 突变；ii)L35M 突变；iii)L35G 突变；iv)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突变；vi) L35G、W132T 和 1179 突变；vii)L35G、S9D、Y84C 和 I179R 突变；viii)L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突变；ix)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突变；X) K58R 和 I257T 突变；xi)D98G 突变；xii)L130M 和 V243A 突变；以及xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y 和 I257T。优选地，所述至少一种突变Λ9延伸酶多肽包含L35G取代，并且在与SEQ ID NO: 3的Λ 9延伸酶活性进行比较时，所述突变Λ9延伸酶多肽具有改善的Λ9延伸酶活性。优选地，所述至少一种复合酶具有选自下列的特性:(a)选自下列的接头:SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10;以及(b)基本上由选自下列的序列组成的氨基酸序列:SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO:16。优选地，所述至少两种溶血磷脂酸酰基转移酶中的至少一种选自:(a)基本上由选自下列的序列组成的氨基酸序列:SEQ ID NO: 18、SEQ ID N0:20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 25;以及(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23的氨基酸序列进行比较时具有至少43.9%的氨基酸同一性，并且所述多肽还包含至少一种选自SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27的1-酰基-sn_甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序。优选地，所述至少一种磷脂:二酰基甘油酰基转移酶选自:(a)基本上由选自下列的序列组成的氨基酸序列:SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30 ；以及(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID N0:29和SEQ IDNO:30的氨基酸序列进行比较时具有至少90%的氨基酸同一性。优选地，所述宿主细胞属于耶氏酵母属(Yarrowia)。在第五实施例中，本发明涉及制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，其包括:a)培养本发明的任一个宿主细胞，其中产生包含二十碳五烯酸的微生物油；以及b)任选地回收所述步骤(a)的微生物油。在第六实施例中，本发明涉及进一步加工由本发明的方法制备的油。牛物保藏下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

本文公开了含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的工程化菌株，其能够产生微生物油，所述微生物油包含以干细胞重量的重量百分比测量的大于25重量%的二十碳五烯酸[“EPA”](ω-3多不饱和脂肪酸)。