专利名称：大豆苷元-羟丙基-β-环糊精包合物及其制备方法大豆苷元(Daidzein)，又名黄豆苷元，来源于天然植物大豆和野葛，分子式为C15HltlO4，为异黄酮类化合物，是一种天然的植物雌激素。1972年由我国人工合成，其化学成分为8- β -D葡萄精-4，7- 二羟基异黄酮。大豆苷元的化学结构和天然或合成雌激素、抗雌激素化合物相近，研究表明其具有雌性激素样活性和弱的抗雌激素作用，因而在抗肿瘤、心脑血管、抗骨质疏松、抗氧化等方面表现出良好的治疗和预防作用(Bingham S A, Atkinson C，Liggins L，et al. Phyto-estrogens where are we now. Brit J Nutr，1998，79 :393. ；Kurzer M S，Xu X. Dietary phytoestrogens. Annu Rev Nutr. 1999，17 :353.；Sotchell K D,Cassidy A. Dietary isoflavones biological effects and relevance tohuman health. J Nutr，1999，129 :758S. ；Clarks0n T B.Soy phytoestrogens what willbe their role in post-menopausal hormone replacement. Menopause，2000，7 :71.)。药理作用研究表明大豆苷元能扩张冠状动脉，降低心肌耗氧量，使冠脉脑血管血流量增加，对高血压病人的头痛、头晕、颈项强痛等症状有明显的改善作用，可明显缓解心绞痛抗心律失常，抗氧化，增强机体的免疫力，降血糖，可改善更年期症候群，强化钙质吸收，预防和治疗神经感觉性耳聋和突发性耳聋。此外还能扩张心脑及外周血管,解除血管痉挛,改善微循环；降低TXA2/PGI2，抑制血小板聚集，降低血液粘滞度；临床上治疗心绞痛、高血压疗效显著，是心血管疾病的良药(叶和杨，邱峰，曾靖等.大豆苷元抗心律失常作用的研究.中国中药杂志，2003，28 (9) 853.;周继，李玉白，唐明德.大豆苷元对大鼠骨代谢的影响探讨·南华大学学报医学版.2005，33 (3) :342. ；ffang H Z, Zhang Y, Xie L P，et al. Effectsof genistein and daidzein on the cell growth，cell cycle, and diferentiation ofhuman and routine melanoma cells. J Nutr Biechem. 2002，13 :421.)。大豆苷元疗效确切，毒性很低，适合长期用药，具有开发价值。但由于其属异黄酮结构，水溶性相当差，脂溶性也不理想，因而生物利用度差，极大影响了该药物在制剂上的应用和人体内的吸收利用(黄绮红，胡容融.葛根黄豆苷元分散片的制备及其溶出度测定.广东药学院学报，2001，17(2) 87.) ο环糊精包合技术作为一种很好的增溶技术，已应用于大豆苷元的包合，文献(葛月宾，陈大为，谢莉萍，王洪钟，郑桂兰，张荣庆.大豆苷元-羟丙基-β -环糊精包合物的研究.中国中药杂志，2006,31(24) :2039-2041.)采用溶液搅拌法制备大豆苷元-羟丙基-β -环糊精包合物。试验表明羟丙基-β -环糊精能显著提高大豆苷元的溶解度，但是，该制备方法是在PH为12.0的溶液中进行，大豆苷元易产生氧化现象，易引起溶剂残留，该制备方法的另一缺陷是对大豆苷元的包合率不高，制得的包合物如用于注射，会因为制备时所处的高碱性环境而导致产物的PH范围不能满足要求。公开号为CN1978509A的中国专利公开了一种将大豆苷元与环糊精及其衍生物制备成包合物的技术，其发明是将环糊精与水混合，加入I O. I摩尔比的大豆苷元加热至50 80°C,滴加氢氧化钠或氢氧化钾碱溶液至体系全溶,热过滤,于35 50°C下搅拌用盐酸或磷酸调PH值至中性析出固体物，冷却，过滤，干燥得固体包合物。该发明制备了包合态的大豆苷元/环糊精组合物，提高了大豆苷元的溶解度。但是该发明是加入无机碱使大豆苷元成盐后，将盐型大豆苷元包合后再酸化，使盐型包合物转化为大豆苷元包合物。其操作复杂繁琐，大豆苷元在成盐过程中易被氧化，制备过程中加热时间过长及加碱过量均会影响包合物的产品质量及产率。为解决上述制备工艺的缺陷，本发明引入超临界流体技术制备大豆苷元-羟丙基-β -环糊精包合物。超临界流体技术，例如超临界溶液之快速膨胀(RESS)，气体饱和溶液之沉淀(PGSS)，气体反溶剂(GAS)以及超临界流体强制分散法(SEDS)目前已被药物加工及制剂制备广泛应用，该技术适用性强、应用效果显著。近年来，超临界流体技术已成功应用于环糊精对药物的包合，该技术在载药系统中的应用受到研究者普遍关注。该包合方法的机制为以具有优越传质能力及高溶剂化性能的超临界CO2为包合介质，当其通过药物与 环糊精的混合物时，由于它具有降低某些有机化合物的熔点特性，将使包合材料与客体物质形成超临界溶液，从而促使包合过程的进行。与传统包合物制备方法相比，超临界流体包合法解决了溶剂残留问题，制备过程中不使用任何有机溶剂；另外操作步骤简便，可一步得到所需粒子的包合，同时可显著提高包合率。
本发明要解决的技术问题在于提供一种大豆苷元-羟丙基-β -环糊精包合物及其制备方法，该大豆苷元-羟丙基-β -环糊精包合物采用超临界流体技术制备，不仅制备方法简单，而且制得的包合物不存在溶剂残留。本发明要解决的另一个技术问题在于使制得的包合物在不含溶剂残留的基础上，进一步提高其包合率。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案本发明提供一种大豆苷元-羟丙基-β-环糊精包合物，其组成是羟丙基-β-环糊精和大豆苷元；所述羟丙基环糊精与大豆苷元的摩尔比是I : I O. I;所述包合物由下述方法制备将所述的大豆苷元与羟丙基-环糊精充分混合后置于50°C 200°C的反应釜中，再将超临界CO2流体导入所述反应釜中，加压，待所述大豆苷元与羟丙基-β -环糊精反应一段时间后快速解压，干燥即得所述包合物。所述超临界CO2流体的压力为IOMPa 40MPa。本发明将所述大豆苷元与羟丙基-β-环糊精充分混合后置于50°C 150°C的反应釜时，进一步添加有机酸或有机碱可以提高所述包合物的包合率，所述有机酸为柠檬酸，所述有机碱为赖氨酸，并且所述有机酸或有机碱与所述大豆苷元的摩尔比为I : I。所述大豆苷元与羟丙基-β -环糊精在所述超临界CO2流体中的反应时间为3 24小时。本发明还公开一种大豆苷元-羟丙基_β -环糊精包合物的制备方法，其步骤是(I)将所述的大豆苷元与羟丙基环糊精充分混合后置于反应釜中，所述反应釜的温度被控制在50°C 200°C之间；(2)将超临界CO2流体导入所述反应爸中,加压；(3)待所述大豆苷元与羟丙基-环糊精在所述超临界CO2流体中反应一段时间后快速解压，即得所述包合物。所述制备方法的步骤⑵中，所述超临界CO2流体的压力为IOMPa 40MPa。进一步地，为提高所述包合物的包合率，所述步骤(I)中可以将所述大豆苷元与羟丙基-β -环糊精充分混合后置于50°C 150°C的反应釜中，并添加有机酸或有机碱，所 述有机酸为柠檬酸，所述有机碱为赖氨酸，并且所述有机酸或有机碱与所述大豆苷元的摩 尔比为1:1。所述大豆苷元与羟丙基-环糊精在所述超临界CO2流体中的反应时间为3 24小时。本发明首先采用传统制备方法(研磨法、超声法、共沉淀法、溶液搅拌法)分别对大豆苷元进行羟丙基-β-环糊精包合物的制备，以所制备的包合物的溶解度、包合率、包合物载药量及收率做评价指标选择优化的传统制备方法，并对传统制备方法进行制备工艺、条件参数优化，确定最佳条件。其次，对超临界流体技术制备大豆苷元包合物进行初试，然后进行各条件参数影响因素考察，得到超临界方法制备大豆苷元-羟丙基-β -环糊精包合物的最佳工艺参数。最后，将传统方法-溶液搅拌法与新技术-超临界流体得到的包合物进行系统的理化特性(粒径、存在形态、热动学、表面形态、溶解度等)考察，确定本发明的制备优势。本发明的超临界固体包埋过程可描述如下将一定量的大豆苷元与Hp-β -⑶充分混合后置于一定温度的反应釜中，再导入一定压力的超临界CO2流体至反应釜，将大豆苷元与Hp-β -CD在超临界CO2流体中反应一定时间后快速解压，得干燥包合物。与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果1)本发明主要用于制备大豆苷元的羟丙基-β -环糊精包合物，可以显著提高大豆苷元溶解度，易于进行口服或注射制剂的制备；2)本发明的包合物制备方法简单易行，无环境污染，易于推广应用；3)本发明所制备的包合物其包合率高，粒径大小可控，稳定性好，无有机溶剂残留，易与其他药用辅料配伍或进一步加工。
图I是大豆苷元在Agilent高效液相色谱仪下的光谱图；图2是本发明用超临界流体技术于150 V条件下制得的包合物，在Agi Ient高效液相色谱仪下的光谱图；图3本发明用超临界流体技术于180°C条件下制得的包合物，在Agilent高效液相色谱仪下的光谱图；图4是本发明用超临界流体技术于200°C条件下制得的包合物，在Agilent高效液相色谱仪下的光谱图；图5是用红外光谱法鉴定的大豆苷元、羟丙基-β_环糊精、两者物理混合物、超临界处理后的大豆苷元、溶液搅拌法制得的包合物、本发明超临界流体固体包埋技术制得的包合物之间的红外图谱对比图；图6是用电镜扫描(200倍)的大豆苷元、羟丙基环糊精、两者物理混合物、超临界处理后的大豆苷元、溶液搅拌法制得的包合物、本发明超临界流体固体包埋技术制备的包合物之间的微粒形态对比图；图7是用激光粒度分析仪测量的大豆苷元、羟丙基-β_环糊精、两者物理混合物、超临界处理后的大豆苷元、溶液搅拌法制得的包合物、本发明超临界流体固体包埋技术制备的包合物之间的粒径分布对比图；图8是大豆苷元、羟丙基-环糊精、两者物理混合物、超临界处理后的大豆苷元、溶液搅拌法制得的包合物、本发明超临界流体固体包埋技术制备的包合物之间的X射线衍射对比图；图9是大豆苷元与羟丙基-β -环糊精的TGA分析图； 图10是大豆苷元、羟丙基-环糊精、两者物理混合物、超临界处理后的大豆苷元、溶液搅拌法制得的包合物、本发明超临界流体固体包埋技术制备的包合物之间的差示扫描量热分析对比图。

溶解度(mg/ml)~ 包合率(％)~ 包合物载药量(％) 收率(％) 研磨法19.9310. 782.85256. 30
超声法4. 5422.4900.690052.86
共沉淀法O. 1604102. 517.8385.20
溶液搅拌法 23.6518. 504. 17770.91从上述表I可知，共沉淀法的包合率、包合物载药量、收率虽然是最好的，但其溶解性却是最差的。而溶液搅拌法所制备的包合物的溶解性最好，且包合物的包合率、包合物含量及收率均优于研磨法及超声法，因此在传统技术中溶液搅拌法是制备大豆苷元-羟丙基_β -环糊精包合物的最佳方法。由溶液搅拌法制得的包合物其包合率可达18. 50%，这种传统技术能否进一步优化以得到更高的包合率？以及优化效果如何？本发明继续对传统技术的最佳方法(溶液搅拌法)进行了实验。I. 6溶液搅拌法制备工艺的单因素影响实验溶液搅拌法制备大豆苷元-羟丙基-环糊精包合物的影响因素较多，包括温度、搅拌时间、PH值、羟丙基-β -环糊精与大豆苷元的摩尔比、羟丙基-β -环糊精浓度、搅拌速度以及干燥方法，本发明通过实验对上述因素分别进行考察。I. 6. I搅拌时间的影响设定羟丙基环糊精与大豆苷元的摩尔比为I : 1，羟丙基环糊精的浓度为10%，水溶液ρΗ12· 0，水浴温度为40°C，磁力搅拌速度为lOOrpm，平行三份样品，以包合物载药量、包合率、收率为评价指标，分别考察搅拌4h、8h、24h后制备的包合物，结果见表2。
表2不同搅拌时间的考察结果
时间(h)包合率(％)|载药量(％)|收率(％)~
~16. 333 9862.07
~818.46TM64.452412. 11Γ9362.44结果显示搅拌时间对包合物的包合率及载药量均有影响，而对收率的影响不大。搅拌时间过短或过长，包合率及包合物载药量均有不同程度的降低。I. 6. 2水浴温度的影响如I. 6. I所述，固定其他处方工艺条件，搅拌时间设为24小时，改变水浴温度，以包合物载药量、包合率、收率为评价指标，分别考察水浴温度为25°C、40°C、50°C、60°C时制备的包合物，结果见表3。表3不同水浴温度的考察结果
温度(°c)~ 包合率(％)|载药量(％)|收率(％)~
258 32Γ3752.86 40 12. 11 Γ93 62.44 50 10.94 Γ 4 60. 34 60 11. 75 2 95 59.80结果显示水浴温度对包合物的包合率及包合物载药量均有影响，适当的水浴温度有利羟丙基-β -环糊精对大豆苷元的包合。I. 6. 3羟丙基-环糊精浓度的影响如1.6. I所述，固定其他处方工艺条件，搅拌时间设为24小时，改变羟丙基-β -环糊精的浓度，以包合物载药量、包合率、收率为评价指标，分别考察羟丙基-β -环糊精浓度为10%、20%、30%时制备的包合物，结果见表4。表4不同羟丙基-环糊精浓度的考察结果
羟丙基-P-环糊精浓度(％)包合率(％)|载药量(％) 收率(％)~
~1011.892 8862.44
2013.813ΤΤ 65.81
308 88Γ0 66.83
结果显示羟丙基-β_环糊精的浓度对包合物的包合率及包合物载药量均有影响，适当的羟丙基-环糊精浓度有利于提高包合物的包合率及载药量。I. 6. 4搅拌速度的影响如I. 6. I所述，固定其他处方工艺条件，搅拌时间设为24小时，改变搅拌速度，以包合物载药量、包合率、收率为评价指标，分别考察搅拌速度为lOOrpm、200rpm、300rpm制备的包合物，结果见表5。表5不同搅拌速度的考察结果


本发明公开一种大豆苷元-羟丙基-β-环糊精包合物及其制备方法，所述包合物的组成是羟丙基-β-环糊精、大豆苷元，所述羟丙基-β-环糊精与大豆苷元的摩尔比是1∶1～0.1，所述包合物由以下方法制备将羟丙基-β-环糊精与大豆苷元按1∶1～0.1的摩尔比充分混合后，置于50℃～200℃的反应釜中，再将超临界CO2流体导入所述反应釜中，压力达到10MPa～40MPa，待所述大豆苷元与羟丙基-β-环糊精反应3-24小时后快速解压，即得所述包合物。本发明可以显著提高大豆苷元的溶解度，制备的包合物包合率高、粒径大小可控、稳定性好、无有机溶剂残留，易于进行口服或注射制剂的制备。