专利名称：醛化鹅新鲜红细胞及其在无细胞百日咳ha试验中的应用的制作方法百日咳(pertussis, whooping cough)是一种儿童急性呼吸道传染病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续几个月，如无并发症出现，一般无高热或有轻度发热。本病最重要的并发症是继发感染，癫痫发作，脑病和死亡。百日咳在发病初期传染力极强，不易诊断，因此进行疫苗接种是预防和控制百日咳最经济最有效的手段。目前市场上的百日咳疫苗主要有全菌体百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗两种，后者免疫效果好且副作用低，因此被广泛使用。在无细胞百日咳发酵培养中，常用的检测方法是HA试验(在微量凝集板上，每孔加人生理盐水50 u L，然后第I孔加入百日咳菌液50 u L，混匀.依次倍比稀释至第10孔，同时另作生理盐水对照，之后每孔各加人50 UL 1%新鲜红细胞悬液。同时振荡Imin混勻，室温下静置15min后观察结果)。在HA试验中，需要使用的1%鹅新鲜红细胞存在质脆易碎，保存期短的缺点。
本发明的任务是提供一种醛化鹅新鲜红细胞及其制备方法和醛化鹅新鲜红细胞在无细胞百日咳HA试验中的应用。实现本发明的技术方案是本发明提供的醛化鹅新鲜红细胞是按以下方法制得的产物步骤一用注射器吸取鹅静脉血约2 6mL，放入装有IOmL生理盐水的离心管中混匀，离心机1500 2000 r/min 4°C，离心8分钟，弃上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500 2000 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500 2000r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜后得到的沉淀物即为鹅新鲜红细胞，将所得鹅新鲜红细胞于4°C保存备用；步骤二 取鹅新鲜红细胞lmL，缓慢加入经4°C预冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速摇匀，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌，反应40min后取出，得到鹅新鲜红细胞浓度为2.5% (体积比mL / mL)的醛化鹅新鲜红细胞悬液；步骤三将浓度为2. 5% (体积比mL / mL)的醛化鹅新鲜红细胞悬液用0. 9%无菌氯化钠溶液稀释到浓度为0. 8%的醛化鹅新鲜红细胞悬液。本发明提供的醛化鹅新鲜红细胞的制备方法，包括以下步骤步骤一用注射器吸取鹅静脉血约2 6mL，放入装有IOmL生理盐水的离心管中混匀，离心机1500 2000 r/min 4°C，离心8分钟，弃上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500 2000 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500 2000r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜后得到的沉淀物即为鹅新鲜红细胞，将所得鹅新鲜红细胞于4°C保存备用；步骤二 取鹅新鲜红细胞lmL，缓慢加 入经4°C预冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速摇匀，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌，反应40min后取出，得到鹅新鲜红细胞浓度为2.5% (体积比mL / mL)的醛化鹅新鲜红细胞悬液；步骤三将浓度为2. 5% (体积比mL / mL)的醛化鹅新鲜红细胞悬液用0. 9%无菌氯化钠溶液稀释到浓度为0. 8%的醛化鹅新鲜红细胞悬液，此醛化鹅新鲜红细胞悬液置于4 °C冰箱中放置保存,有效期为90天；上述制备方法步骤二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液将25%戊二醛用0. 9%无菌氯化钠溶液稀释成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中备用。本发明提供的醛化鹅新鲜红细胞可用于无细胞百日咳HA试验。实验资料I、采血用注射器吸取鹅静脉血约2 6mL，放入装IOmL生理盐水的离心管中混匀。2、分离鹅红细胞将离心管中的血液经离心机4°C，1500 2000 r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500 2000 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜。从沉淀物加入生理盐水至离心移去上清液，此过程重复2次。最后得到的沉淀物即为鹅新鲜红细胞，将所得鹅新鲜红细胞于4°C保存备用。3、制备醛化鹅新鲜红细胞本实验采用两种方法进行醛化。第一种方法取沉淀鹅新鲜红细胞lmL，缓慢加入4°C预冷的I. 25_5%戊二醛溶液40ml,迅速摇勻，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌4(T60min,反应结束后，离心洗漆三次，沉淀加生理盐水得到醛化鹅新鲜红细胞悬液。第二种方法用生理盐水配成5%鹅新鲜红细胞悬液15mL，缓慢加入I. 25_5%戊二醛生理盐水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌4-6h，反应结束后离心洗涤三次，沉淀加生理盐水得到醛化鹅新鲜红细胞悬液。通过实验选择一种醛化鹅红细胞的方法，为无细胞百日咳的HA试验提供有效的试验试剂,使试验效果更加准确。本发明实验从醛化鹅新鲜红细胞制备方法、工作浓度、保存时间三个方面进行了研究，最终确定上述第一种醛化方法优于第二种醛化方法，第一种醛化方法的具体条件为I.25%戊二醛醛化40min，醛化鹅新鲜红细胞工作浓度为0. 8%，用于无细胞百日咳的HA试验，取得与用0. 8%新鲜鹅红细胞一致的试验结果，但本发明以醛化鹅新鲜红细胞取代新鲜鹅红细胞后，使鹅红细胞保存期变长，实验结果更稳定，克服了现有技术中存在的鹅新鲜红细胞质脆易碎，保存期短，实验结果不稳定的缺点。
醛化鹅新鲜红细胞的制备及最佳醛化时间确定第一种醛化方法取沉淀鹅新鲜红细胞lmL，缓慢加入4°C预冷的I. 25_5%戊二醛溶液40mL,迅速摇勻，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌,反应40min后取出20mL混合液，得到醒化40min的醒化鹅新鲜红细胞悬液。反应60min后取出20mL混合液,得到醒化60min的醛化鹅红细胞悬液。两种2. 5%鹅红细胞浓度的醛化红细胞悬液分别稀释得到0. 8%鹅红细胞浓度的醛化鹅细胞悬液。第二种醛化方法5%鹅红细胞悬液15mL缓慢加入2. 5 %戊二醛生理盐水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌lh，取4mL，用生理盐水洗涤5次，每次2000 r / min，离心10 min，弃去上清液，配成5%的悬液.4°C保存备用，得到醛化Ih的醛化鹅红细胞。剩余溶液继续分别搅拌2 h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗涤，配成0. 8%的悬液，4°C保存备用。分别得到醛化2h、5h、6h的醛化鹅红细胞。两种方法同时用0. 8%鹅新鲜红细胞悬液做对照，用三批大罐培养百日咳杆菌菌液(批号分别为:201111Z088-YD2; 201111Z090-YD2; 201111Z092-YD2)重复做血凝试验，评价出最优的醛化鹅新鲜红细胞时间。醛化鹅红细胞的优化试验溶血性观察将新鲜鹅红细胞悬液与醛化后的鹅红细胞悬液分别放置4°C保存，每日观察并记录鹅红细胞保存期内的溶血现象。 不同戊二醛浓度醛化鹅红细胞及不同醛化鹅细胞浓度的血凝试验对比将25%的戊二醛溶液分别1:4 ;1:9 ;1:19稀释成5%、2. 5%、1. 25%浓度戊二醛生理盐水溶液三份。第一种醛化方法分别取ImL沉淀鹅红细胞3份，分别加入到40mL5%、2. 5%、I. 25%浓度戊二醛溶液中反应，置于4°C冰箱中用磁力搅拌器搅拌，醛化反应时间按最佳醛化时间进行，反应结束后，离心洗涤三次，沉淀加生理盐水分别配制成2%，I. 67%，1%，0. 8%鹅红细胞浓度的醛化鹅细胞悬液。第二种醛化方法5%、2. 5%、I. 25%浓度戊二醛生理盐水溶液各40mL分别缓慢加入到40mL5%细胞浓度的红细胞中反应，醛化反应时间按最佳醛化时间进行，反应结束后，离心洗涤三次，沉淀醛化红细胞分别配制成2%，I. 67%，1%，0. 8%鹅红细胞浓度的悬液，两种方法同时用0.8%新鲜鹅红细胞悬液做对照，用三批大罐培养百日咳杆菌菌液(批号分别为201111Z088-YD2; 201111Z090_YD2; 201111Z092_YD2)重复做血凝试验.评价出最优的戊二醛反应浓度及醛化细胞工作浓度。实验结果I、溶血性观察结果将新鲜鹅红细胞于4°C条件下放置保存，7d出现部分溶血.第IOd已经全部溶血，而醛化鹅红细胞不出现溶血，性质不变。在醛化红细胞保存的90天中，戊二醛醛化的鹅红细胞均不出现溶血现象。2、最佳醒化时间确定表I第一种醛化方法醛化鹅红细胞实验结果(操作完成后20min后观察)


本发明提供了一种醛化鹅新鲜红细胞及其制备方法和醛化鹅新鲜红细胞在无细胞百日咳HA试验中的应用。本发明醛化鹅红细胞方法的具体条件为1.25%戊二醛醛化40min，醛化鹅红细胞工作浓度为0.8%，用于无细胞百日咳的HA试验，取得与0.8%新鲜鹅红细胞一致的试验结果，但以醛化鹅红细胞取代新鲜鹅红细胞后，鹅红细胞保存期变长，实验结果更稳定，克服了现有技术需要使用的1%鹅新鲜红细胞存在的质脆易碎，保存期短的缺点。