专利名称：快速获得马铃薯转基因植株的方法 在我国和世界上，马铃薯(Solanum tuberosum L.)是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。由于马铃薯为同源四倍体无性繁殖作物，其基因分离复杂、隐性基因表现频率较低、花粉常常出现不育、杂交结实较难，通过常规育种方法进行改良耗时较长，且难度较大。因此，利用遗传转化技术进行马铃薯的遗传改良具有重要的意义。在本发明做出以前，马铃薯的遗传转化主要是通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法而实现的。自从证明马铃薯对农杆菌侵染比较敏感之后，已有许多实验表明用农杆菌侵染能够得到正常的转基因马铃薯。目前，农杆菌介导的马铃薯遗传转化技术已日趋成熟，以马铃薯茎段、叶片、块茎、微型薯、下胚轴、子叶、愈伤组织和试管薯为受体的农杆菌转化均已获得成功。但农杆菌介导的马铃薯遗传转化仍存在以下问题有待解决如转化程序复杂，即先经过诱导愈伤组织，再诱导分化，分化芽后转入生根培养基上诱导生根(De Block M，Theor Appl Genet，1988，76767-774)；基因型的限制，不同品种间转化频率差别较大(Stiekema W J等，Plant Cell Rep，1988，747-50；Tavazza R，等，Plant Sci，1988，59175-181；Sheerman S和Bevan M W.Plant Cell Rep，1988，713-16；Wenzler H等，Plant Science，1989，6379-85)；转化频率较低，大多数低于20％(Ishida B K等，Plant Cell Rep，1989，8325-328；Visser R G F等，Plant Mol Biol，1989，12329-337)；周期较长，一般为5-8周(Beaujean A等，Journal of Experimental Bot，1998，491589-1595；Trujillo C等，Plant Cell Rep，2001，20637-641)和非整倍体(如染色体数为47或49条)转基因植株的产生(Ooms G等，Theor Appl Genet，1987，73744-750；Ishida B K，等，Plant Cell Rep，1989，8325-328)等。
本发明的目的在于克服现有马铃薯转基因技术存在的缺陷，以CaMV 35S启动子和马铃薯块茎特异蛋白class I patatin基因SK24-1(谢从华等，GenBank accessionAF498099)构建的重组质粒pBSAP为转化载体，建立一种快速获得转基因马铃薯植株的方法。本发明通过以下技术方案实现本发明以马铃薯试管薯为转基因的受体，该试管薯的快速繁殖技术已经由本申请的主要发明人柳俊和谢从华于2002年10月11日提出了一项发明专利申请“一种高效生产马铃薯试管薯的方法及其培养盒”(专利申请号为02131125.0)。利用该发明能够在短期内诱导任何能结薯的马铃薯获得大量的试管薯，从而为建立马铃薯试管薯高效转基因技术奠定了基础。更进一步地以下的描述详细地公开本发明创造，本发明的要点是一种利用农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化方法。其特征在于A、以马铃薯试管薯为外植体进行转化和再生；B、将所述的外植体与所述的农杆菌共培养，将目的基因pBSAP导入马铃薯受体；C、所述的马铃薯受体不经过愈伤组织诱导步骤直接转入固体分化培养基诱导出抗性芽；D、将所述的抗性芽转入选择性生根培养基上诱导长出正常的根，获得马铃薯转化植株；E、借助PCR、PCR--Southern和Northern杂交方法鉴别转基因植株，最终获得完整的转基因马铃薯植株。上述外植体是指将所述的马铃薯试管薯切成一定厚度的薄片，先将该薄片置于所述的农杆菌菌液中浸染，再将浸染后的薄片转入所述的固体培养基上培养，该固体培养基按以下配制MS基本培养基附加1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)和1-3mg/L玉米素(ZR)、30g/L蔗糖，pH＝5.8。以上所述的最佳固体培养基按以下配比配制MS基本培养基附加1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤(BA)和2mg/L玉米素(ZR)、30g/L蔗糖，pH＝5.8。所述的培养条件如下在28℃暗培养2天。然后再转移到如上所述的培养基附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的选择培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、温度23±1℃下培养，至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS基本培养基附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择培养基上诱导生根，进一步培育成完整的转基因马铃薯植株。
具体操作步骤如下将含有表达载体pBSAP的农杆菌LBA4404接种于附加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB(Sambrook J等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)培养基中，于28℃、240r/min摇床上培养至OD600为0.5左右。然后于5000r/min离心6分钟，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮。将马铃薯试管薯切成1-2mm厚的小圆片，在上述农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入MS附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、2mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH＝5.8的固体分化培养基中，于28℃暗培养2天。然后再转移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的同种培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、温度23±1℃下培养。至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择性生根培养基上，10天后长出正常的根。从而获得完整的转基因植株。
转基因植株PCR、PCR-Southern杂交检测按Edwards K等(Nucl Acids Res，1991，191349)报道的方法从转基因马铃薯叶片中提取植物总DNA。用转化植株的总DNA为模板，未转化植株作为负对照，以nptII基因的两个引物5-GCTATGACTGGGCACAACAG-3和5-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃，3分钟；94℃，45秒，50℃，45秒，72℃，1分钟，36个循环；72℃延伸5分钟。预期扩增片段大小为676bp。PCR产物电泳后转至尼龙膜，质粒pBSAP PCR扩增产物电泳回收的676bp片段，经地高辛(DIG)标记后作为探针进行杂交。采用Roche公司生产的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I试剂盒进行探针标记、膜杂交和显色处理。操作步骤按试剂盒说明书进行。
转基因植株Northern杂交检测用异硫氰酸胍法(Chomczynski P等，Anal Biochem，1987，162156-159)抽提转基因马铃薯和对照的总RNA，以DIG标记的反义patatin mRNA探针与总RNA杂交。探针标记、Northern杂交及检测采用Roche公司生产的DIG Northern杂交及检测试剂盒。操作步骤按试剂盒说明书进行。
本发明的效果是应用本发明的转基因技术，对大多数马铃薯四倍体栽培品种和二倍体种可在3-4周(个别材料为5周)内获得转基因植株，对基因型的依赖性较小，不同基因型之间差异较小，转化周期短(一般为3-4周)，转化频率可达40％以上，比目前利用马铃薯叶片、茎段和块茎等其它外植体的转化频率提高了20％以上。本发明的转化步骤简单，植株再生不需经过愈伤组织诱导步骤(没有传统的脱分化过程)，从试管薯薄片上可直接再生小芽。即一步培养法可获得转基因植株。这样不仅缩短了成株的培养时间，而且也节约了培养成本。本发明的效果再现性(重复性)好，经过分子生物学和遗传性检验，在转基因植株中检测不到染色体数目的其他变异。表1显示了两个马铃薯四倍体栽培品种“鄂马铃薯3号”和“甘农薯2号”在四种植株再生培养基上转化频率的比较，其中以培养基编号为SRM3的转化频率最高。
表1“鄂马铃薯3号”和“甘农薯2号”在不同培养基上的转化频率培养基1)接种外植体数(块)2)再生芽的外植体数(块) 转化频率(％)3)G2E3 G2 E3G2E3SRM1 8472 40 4.6 0.0SRM2 100 82 22 1022.0 11.9SRM3 7590 33 4143.9 45.5SRM4 9792 28 3228.4 34.3注1)培养基组成如下SRM1为MS培养基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、30g/L蔗糖，pH5.8。SRM2为MS培养基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、1mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH5.8。SRM3为MS培养基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/LBA、2mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH5.8。SRM4为MS培养基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、3mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH5.8。
2)G2和E3分别代表马铃薯品种“甘农薯2号”和“鄂马铃薯3号”。
3)转化频率为3周后能产生卡那霉素抗性芽的外植体数占接种的总外植体数的百分数。
附图及其说明


图1是本发明方法中农杆菌介导的马铃薯试管薯转基因流程图；图2是本发明中马铃薯栽培品种“鄂马铃薯3号”转基因试管薯薄片在卡那霉素选择培养基上直接再生小芽的情形；图3是本发明中马铃薯栽培品种“鄂马铃薯3号”转基因植株在卡那霉素选择培养基上生根。图中数字1表示未转基因的对照“鄂马铃薯3号”；数字2-5表示4个不同的转基因马铃薯单株的特征；
图4是本发明中转基因“鄂马铃薯3号”植株的PCR检测。图中数字1表示分子量标准DNA markerΦX174 Hae III digest(TaKaRa)；数字2表示质粒阳性对照；数字3表示未转基因植株的阴性对照；数字4-13表示10个不同的转基因马铃薯单株；图5是本发明的转基因“鄂马铃薯3号”植株PCR-Southern杂交检测。图中数字1表示质粒阳性对照；数字2表示未转基因的阴性对照；数字3-10表示8个不同的转基因马铃薯单株。
图6“鄂马铃薯3号”转基因植株Northern杂交检测。图中数字1表示未转基因的阴性对照；数字2-9表示8个不同的转基因马铃薯单株。

实施例1将含有表达载体pBSAP的农杆菌LBA4404接种于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培养基中，于28℃、240r/min摇床上培养至OD600为0.5左右。然后于5000r/min离心6分钟，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮。在无菌条件下将马铃薯四倍体栽培品种“鄂马铃薯3号”试管薯切成1-2mm厚的小圆片，在上述农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入编号为SRM3的固体分化培养基中，该培养基组成及配比如下MS培养基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、2mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH＝5.8。于28℃暗培养2天。然后再转移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的同种培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培养。培养2-3周，从块茎薄片上开始直接再生出抗性小芽(如图2所示)。至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择性生根培养基上，10天后长出正常的根(如图3所示)。共接种90块外植体，产生抗性芽的外植体数为41块，转化频率可达45.5％。以抗性植株和未转基因对照植株叶片的总DNA为模板，npt II基因的两个特异引物5-GCTATGACTGGGCACAACAG-3和5-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3进行PCR扩增，结果得到676bp的特异性扩增条带，而未转化的植株中无该片段的产生(如图4所示)。为了进一步鉴定PCR产物是否为676bp的nptII基因片段，排除假阳性的存在，将PCR产物电泳转膜进行Southern杂交，以质粒正对照扩增产物回收的片段作为探针，结果表明产物确实是目的基因片段(如图5所示)，从而证明此反义class I patatin基因SK24-1已成功地整合到马铃薯基因组中。Northern杂交分析表明此反义class I patatin基因SK24-1在转基因植株中已正常转录(如图6所示)。
实施例2将含有表达载体pBSAP的农杆菌LBA4404接种于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培养基中，于28℃、240r/min摇床上培养至OD600为0.5左右。然后于5000r/min离心6分钟，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮。在无菌条件下将马铃薯四倍体栽培品种“甘农薯2号”试管薯切成1-2mm厚的小圆片，在上述农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入编号为SRM3(见实例1)的固体分化培养基中，该培养基组成及配比、蔗糖浓度和pH与实施1所述相同。于28℃暗培养2天。然后再转移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的同种培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培养。至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择性生根培养基上，10天后长出正常的根。共接种75块外植体，产生抗性芽的外植体数为33块，转化频率可达43.9％。转基因植株的PCR检测、PCR-Southern blot和Northern杂交与实施例1所述结果相同。
实施例3将含有表达载体pBSAP的农杆菌LBA4404接种于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培养基中，于28℃、240r/min摇床上培养至OD600为0.5左右。然后于5000r/min离心6分钟，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮。在无菌条件下将马铃薯四倍体栽培品种“N552”试管薯切成1-2mm厚的小圆片，在上述农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入编号为SRM3(见实例1)的固体分化培养基中，该培养基组成及配比、蔗糖浓度和pH与实施1所述相同。于28℃暗培养2天。然后再转移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的同种培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培养。至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择性生根培养基上，10天后长出正常的根。共接种101块外植体，产生抗性芽的外植体数为41块，转化频率可达40.6％。转基因植株的PCR检测、PCR-Southern blot和Northern杂交与实施例1所述结果相同。
实施例4将含有表达载体pBSAP的农杆菌LBA4404接种于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培养基中，于28℃、240r/min摇床上培养至OD600为0.5左右。然后于5000r/min离心6分钟，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮。在无菌条件下将马铃薯二倍体品系“81-15”试管薯切成1-2mm厚的小圆片，在上述农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入编号为SRM3(见实例1)的固体分化培养基中，该培养基组成及配比、蔗糖浓度和pH与实施1所述相同。于28℃暗培养2天。然后再转移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的同种培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培养。至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择性生根培养基上，10天后长出正常的根。共接种89块外植体，产生抗性芽的外植体数为41块，转化频率可达41.6％。转基因植株的PCR检测、PCR-Southern blot和Northern杂交与实施例1所述结果相同。
实施例5将含有表达载体pBSAP的农杆菌LBA4404接种于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培养基中，于28℃、240r/min摇床上培养至OD600为0.5左右。然后于5000r/min离心6分钟，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮。在无菌条件下将马铃薯二倍体品系“3*”试管薯切成1-2mm厚的小圆片，在上述农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入编号为SRM3(见实例1)的固体分化培养基中，该培养基组成及配比、蔗糖浓度和pH与实施1所述相同。于28℃暗培养2天。然后再转移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的同种培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培养。至抗性芽长出达1cm时，将其切下转入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的选择性生根培养基上，10天后长出正常的根。共接种85块外植体，产生抗性芽的外植体数为35块，转化频率可达41.2％。转基因植株的PCR检测、PCR-Southern blot和Northern杂交与实施例1所述结果相同。
表2 不同马铃薯品种在编号为SRM31)培养基上的转化频率品种(品系) 倍性 接种外植体数(个) 再生芽的外植体数(个) 转化频率名称 (％)1)鄂马铃薯3号四倍体9041 45.5甘农薯2号 四倍体7533 43.9N552 四倍体101 41 40.681-15 二倍体8941 41.63#二倍体8535 41.2注表中SRM3培养基的成分同表1中1)所描述的SRM3培养基成分相同。


本发明公开了一种利用农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化方法。其特征是以马铃薯试管薯为外植体，通过农杆菌浸染、培养，将目的基因导入马铃薯受体，不经过愈伤组织诱导步骤直接转入固体分化培养基诱导出抗性芽，再转入选择性生根培养基诱导长出正常的根，获得马铃薯转化植株。借助PCR、PCR－Southern和Northern杂交的方法鉴别转基因植株，最终获得完整的转基因马铃薯植株。本发明转化步骤简单，对基因型的依赖性较小，转化周期短，重复性好。本发明的转化频率可达40％以上，与利用叶片、茎段和块茎等其它外植体转化的马铃薯相比，其转化频率提高了20％以上。