用于在植物中调节转基因表达的调控序列制作方法

S·迪恩, P·拜里, A·诺特, D·A·塞林格尔, C·R·西蒙斯, V·S·塔瓦

2013年2月13日

2011年6月9日

2010年6月9日

纳幕尔杜邦公司, 先锋国际良种公司

A01H5/00GK102933712SQ201180027936

转基因 调控 表达 调节 植物 用于

1.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述内含子包含与 SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137 或 138 具有至少95%的序列同一性的核苷酸序列2.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述启动子包含与 SEQ ID NO 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、136 或139具有至少95 %的同一性的核苷酸序列3.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述终止子包含与SEQ ID N0140、141、142或143具有至少95%的同一性的核苷酸序列4.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中 (a)所述内含子包含与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138具有至少95%的同一性的核苷酸序列；并且 (b)所述启动子包含与SEQID NO 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、136或139具有至少95%的同一性的核苷酸序列5.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中 (a)所述内含子包含与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138具有至少95%的同一性的核苷酸序列；并且(b)所述启动子包含与SEQ ID NO 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、136或139具有至少95%的同一性的核苷酸序列；并且 (c)所述终止子包含与SEQID NO 140、141、142或143具有至少95%的同一性的核苷酸序列6.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述内含子包含 SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137 或 138 的核苷酸序列7.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述启动子包含 SEQ ID NO 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、136 或139的核苷酸序列8.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述终止子包含SEQ ID NO 140、141、142或143的核苷酸序列9.根据权利要求I至8中任一项所述的重组构建体，其中所述内含子存在于所述启动子的下游10.根据权利要求I至8中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述内含子增强异源性多核苷酸在植物中的表达11.重组DNA构建体，包含内含子，其中所述内含子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 99的至少一个拷贝，并且所述内含子能够增强异源性多核苷酸在单子叶植物中的表达12.重组DNA构建体，包含内含子，其中所述内含子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 99的至少一个拷贝和SEQ ID NO 100的至少一个拷贝，并且其中所述内含子能够增强异源性多核苷酸在单子叶植物中的表达13.根据权利要求11或12所述的重组构建体，其中所述内含子可操作地连接至启动子和异源性多核苷酸，并且在与相应没有所述内含子的重组DNA构建体进行比较时，所述异源性多核苷酸在单子叶植物中表现出更高的表达14.包含权利要求I至8中任一项的重组DNA构建体的植物15.包含权利要求I至8中任一项的重组DNA构建体的种子16.包含权利要求9的重组构建体的植物17.包含权利要求9的重组构建体的种子18.包含权利要求10的重组构建体的植物19.包含权利要求10的重组构建体的种子20.包含权利要求13的重组构建体的植物21.包含权利要求13的重组构建体的种子22.鉴定内含子的方法，所述内含子用于增强异源性多核苷酸在单子叶植物中的表达，所述方法包括以下步骤(a)鉴定包含与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138直系同源的核苷酸序列的内含子；以及 (b)测量所述内含子对可操作地连接的异源性多核苷酸的表达的增强效应23.鉴定内含子的方法，所述内含子用于增强转基因在单子叶植物中的表达，所述方法包括以下步骤 (a)针对与SEQID NO 99相同的基序的存在，扫描检查多种单子叶植物内含子； (b)选择包含核苷酸序列的内含子，所述核苷酸序列含有与SEQIDNO 99相同的基序的至少一个拷贝；以及 (c)测量所述内含子对可操作地连接的异源性多核苷酸的表达的增强效应24.调节转基因在单子叶植物中的表达的方法，所述方法包括以下步骤 (a)将包含可操作地连接至启动子和异源性多核苷酸的内含子的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，其中所述内含子包含(i)与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138直系同源的核苷酸序列；或 ( )含有与SEQ ID NO 99相同的基序的至少一个拷贝的核苷酸序列；以及 (b)在步骤(a)之后，从所述可再生的单子叶植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及 (c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体，并且在与包含相应没有所述内含子的重组DNA构建体的植物进行比较时，所述子代植物表现出增强的异源性多核苷酸的表达25.调节转基因在植物中的表达的方法，所述方法包括以下步骤 (a)将包含可操作地连接至启动子和异源性多核苷酸的内含子的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，其中所述内含子序列与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137 或 138 表现出至少 95%的同一性； (b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及 (c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体，并且在与在基因组中包含没有相应内含子序列的重组DNA构建体的植物进行比较时，所述子代植物表现出增强的转基因的表达26.根据权利要求25所述的方法，其中所述植物是单子叶植物

本发明涉及转基因植物的产生，尤其是使用启动子和内含子序列来调控植物中的基因表达发明背景 植物基因工程近来的进步已打开了工程化植物以具有改善的特性或性状的新的大门这些转基因植物典型地在它们的基因组中具有重组DNA构建体，所述重组DNA构建体具有可操作地连接至至少一种是启动子的调控区的蛋白质编码区启动子能够是强的或弱的启动子，或是组成型的或组织特异性的启动子除启动子外，基因产物的表达水平还能够被其他调控元件如内含子调节内含子是在大多数真核基因中存在的居间的非编码序列内含子已被报道影响基因表达的水平这一效应作为基因表达的内含子介导的增强(IME)是已知的(Lu 等人，Mo I Genet Genomics (2008) 279 563_572)Callis 等人(GenesDev. ,19871 =1183-1200)显示，来自玉米醇脱氢酶_1 (Adhl)基因的第一个内含子的存在，使转基因在培养的玉米细胞中的表达水平与无内含子的构建体相比提高了至多100倍Mascarenkas 等人(Plant Mol. Biol. , 1990,15 913-920)显不，来自玉米 Adhl 基因的其他内含子也能够提高玉米原生质体中的异源性基因表达Vasil等人(PlantPhysiol，1989，91 1575-15790)报道，包含Shrunken-I(Sh-I)第一内含子的构建体与仅含有内含子的构建体或与含有启动子和Adh-I第一内含子的构建体相比,在植物原生质体中具有报告基因高得多的表达水平鉴定新的调控序列能够导致在转基因植物中对基因表达的很好的调节植物基因工程已发展至将多种性状引入商业上重要的植物中，也叫基因堆积这是通过多基因转化实现的，多种基因在其中被转化，以产生可能表达复合表型或多种表型的转基因植物然而调节或控制每种转基因的表达最优化是重要的调控元件如启动子和终止子序列需要是各种不同的，以避免导入相同的转基因植物重复序列，相同的重复序列的导入已被与对转基因的表达和稳定性的不可取的负面影响相关联(Peremarti等人(2010)PlantMol Biol 73 363_378 ；Mette 等人(1999)EMBO J 18 241_248 ；Mette 等人(2000)EMBO J 19 5194-5201 ;Mourrain 等人(2007)Planta 225 365_379、美国专利7632982、美国专利 7491813、美国专利 7674950、PCT 专利申请 PCT/US2009/046968)因此，发现和表征能被用于在重要的农作物物种中表达异源性核酸的新的调控元件是重要的各种不同的调控区能够被用于控制每种转基因的表达最优化发明概述本发明涉及调节基因在植物中的表达的调控序列本发明提供了包含调控序列的重组DNA构建体本发明提供了包含作为基因表达增强子的内含子序列以及相应于这些内含子序列的内源性启动子和终止子序列的重组DNA构建体本发明的另一个实施方案是重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述内含子包含与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138具有至少95%的序列同一性的核苷酸序列在另一个实施方案中，所述内含子包含SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138的核苷酸序列本发明的一个实施方案是重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述启动子包含与SEQID NO 105-117、119、136或139具有至少95%的序列同一性的核苷酸序列在另一个实施方案中，所述启动子包含SEQ IDNO 105-117、119、136 或 139 的核苷酸序列 本发明的一个实施方案是重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述终止子包含与SEQID NO 140、141、142或143具有至少95%的序列同一性的核苷酸序列在另一个实施方案中，所述终止子包含SEQ ID NO140、141、142或143的核苷酸序列本发明的一个实施方案是重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述内含子包含与SEQID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138具有至少95%的同一性的核苷酸序列；并且所述启动子包含与 SEQ ID NO 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、136或139具有至少95%的同一性的核苷酸序列本发明的一个实施方案是重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和终止子的内含子，其中所述内含子包含与SEQID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138具有至少95%的同一性的核苷酸序列；所述启动子序列与 SEQID NO 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、136或139具有至少95 %的同一性；并且所述终止子与SEQ ID NO 140、141、142或143具有至少95%的序列同一性在本发明的一个实施方案中，所述内含子可操作地连接至所述启动子，并且在本文所述的重组DNA构建体中存在于所述启动子的下游本发明的一个实施方案包括重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和异源性多核苷酸的本发明所描述的内含子，其中所述内含子能够作为所述异源性多核苷酸的表达的增强子本发明的另一个实施方案包括重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含内含子，其中所述内含子序列包含SEQ ID NO 99的8bp基序的至少一个拷贝；或包含SEQ ID NO99的8bp基序的至少一个拷贝和SEQ ID NO 100的5bp基序的至少一个拷贝，其中所述内含子能够增强异源性多核苷酸在转基因植物中的表达所述内含子序列还能够包含SEQID NO 99的多于一个的拷贝，或能够包含SEQ ID NO 99的一个或多于一个的拷贝和SEQIDNO 100的多于一个的拷贝本发明的另一个实施方案是鉴定新型内含子的方法，所述新型内含子用于增强异源性多核苷酸在植物细胞中的表达，所述方法包括针对与SEQID NO 99的存在扫描检查多种来自植物的内含子、选择含有SEQ ID NO 99的至少一个拷贝的序列、测量所鉴定的内含子对于增强异源性多核苷酸在植物中的表达的功效的步骤本发明的另一个实施方案是鉴定新型内含子序列的方法，所述新型内含子序列用于增强转基因在单子叶植物中的表达，所述方法通过鉴定与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137或138直系同源的序列；以及测量所鉴定的内含子对可操作地连接的异源性多核 苷酸的表达的增强效应本发明的另一个实施方案包括内源性地连接至使用本发明所述的方法鉴定的内含子的启动子和终止子序列本发明的另一个实施方案是调节异源性多核苷酸在单子叶植物中的表达的方法，所述方法包括以下步骤(a)将包含各自可操作地连接至内含子的启动子和异源性多核苷酸的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，其中所述内含子包含(i)与SEQ ID NO 4、8、13、19、52、53、56、57、58、101、102、103、104、118、137 或 138 直系同源的核苷酸序列；或( )含有与SEQ ID NO 99相同的基序的至少一个拷贝的核苷酸序列；以及(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的单子叶植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及(c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体，并且在与包含相应没有所述内含子序列的重组DNA构建体的植物进行比较时，所述子代植物表现出增强的异源性多核苷酸的表达在另一个实施方案中，本发明涉及包含重组DNA构建体的载体、细胞、植物、或种子，所述重组DNA构建体包含本发明所描述的调控序列本发明包括包含上文所描述的重组DNA构建体的再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、Tl和后续的世代所述转基因的植物细胞、组织、植物和种子可以包含所关注的至少一种重组DNA构建体在一个实施方案中，包含本发明所描述的调控序列的植物是单子叶植物在另一个实施方案中，包含本发明所描述的调控序列的植物是玉米植物附图简述和序列表根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3 3021_3030 (1985)和 BiochemicalJournal 219 (No. 2) =345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § I. 822中所列出的规定图I是用于测试内含子的载体的示意图，显示了用于克隆内含子的限制性位点相对于玉米泛素启动子的位置，如实施例2中所述图2显示了用于测试内含子介导的基因表达的强化的ITVUR-2载体PHP 41353的图谱图3显示了对GUS报告基因在被相应构建体转染的玉米胚中的表达的定量分析图4显示了与对照载体ITVUR-2相比，⑶S报告基因在被内含子构建体转染的水稻愈伤组织中的表达的增强倍数图5显示了带有CYMV启动子和ADHl内含子的载体PHP38808的图谱，其被用于测试内含子介导的基因表达的强化，如实施例7中所述图6显示了对从浸润的玉米组织培养物材料提取的RNA，用地高辛标记的DNA探针针对所使用的抗虫基因进行检测的Northern印迹的结果样品基于ELISA数据加样，以包含等量的PAT图7显示了载体PHP34651的图谱，该载体包含用于LR反应以产生就内含子而言最终的表达载体的GATLWAY * attR重组位点和PAT表达盒，如实施例7中所述图8显示了载体PHP42365的图谱，该载体包含ZmUbi启动子和ZmUbi内含子，用于在稳定的转基因水稻植物中进行检测，如实施例11中所述图9显示了来自用不同构建体转化的稳定的转基因品系的MUG数据数据表示平均5-8个独立的单拷贝事件土SE