专利名称：用于转基因植物的蛋白质转运增强剂的制作方法转基因植物对商业化农业有重要影响，其利益很有前景但也产生了新的害虫控制问题。值得注意的是，基于用表达杀虫有效的晶体蛋白的基因改造的植物的农作物能通过使目标害虫的食物(植物组织)变得有毒而选择性消灭害虫，由此减少或消除化学杀虫剂的用量。属于芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌的某些成员生产杀虫蛋白。了解最多的是苏云金芽孢杆菌(BT)，其中杀虫蛋白是晶体状小体和形成孢子的菌体。该杀虫晶体蛋白的特征是其对特定昆虫害虫(其中很多害虫对农业有重要影响)的效力和特异性，以及其对非目标昆虫种类和脊椎动物(特别是人)相对安全。这些杀虫晶体蛋白长期用于园艺业，其中像化学杀虫剂一样喷雾晶体和孢子的混合物，但对于范围较广阔的大田作物没有获得很大成功。该杀虫蛋白由基本无活性的大蛋白构成。当毛虫摄入了一些杀虫晶体时，该昆虫中肠的丙氨酸减少状态使该晶体分离和释放晶体蛋白。在此阶段该蛋白使无活性的，但是昆虫胃肠液中的特定酶将该蛋白剪切至其蛋白酶抗性的核，该核是完全活性的。活化的杀虫蛋白然后结合中肠内壁细胞的刷状缘膜，并插入细胞膜。当大约8个这样的插入集合在一起的时候，它们就形成穿膜的孔或通道，并允许细胞内容物泄漏，导致营养吸收所必须的细胞的死亡。昆虫迅速失去营养并最终饿死，或由于24小时内的次级细菌感染而死亡。晶体溶解，蛋白水解成活性杀虫蛋白和对特定受体结合的过程全都使该BT蛋白高度特异性并且对环境十分有利。已经收集了几千种不同的苏云金芽孢杆菌分离物并确定了其杀虫蛋白成分和活性谱。大量BT杀虫蛋白现已克隆并测序。为避免混淆，研究人员建议对晶体蛋白基因(Cry基因)使用同一的命名系统，根据其蛋白序列和其毒性所针对的昆虫类型。表1 由CryI基因编码的蛋白序列相似并仅对毛虫(也即蛾和蝶的幼虫，鳞翅目)有毒；CryII基因编码对鳞翅目和/或双翅目(苍蝇和蚊子)有毒而CryIV蛋白仅对双翅目有毒。CryIII基因生产对甲虫(鞘翅类)幼虫有毒的蛋白。考虑了不同蛋白之间序列的相似性和差异，在上述主要类型中进行了细分。CryI组，例如最初分成CryIA，IB和IC(尽管现在已经达到CryIG)，其中不同亚类可能在蛋白序列上只有50％同一。还进行了更细致的分类而CryIA现在包括CryIA(a)，IA(b)和IA(c)。开发了多种方法用于将目的基因导入农作物细胞并由此培育可育的植物。参见，美国专利6329574和http//www.cotton.pi.csiro.au/publicat/pest/transgen.htm，其内容在此全部作为参考而引用。所选方法部分依赖目标种类，而棉花改造经常依赖其植物遗传改造的自身发展的天然基因转移物。称为Crown Gall的疾病是一种有土壤细菌病源物，农杆菌引起的植物肿瘤。在1970年代早期，人们认识到该细菌通过转移部分其自身遗传物质到植物细胞DNA中而引起疾病。这些寄生的基因破坏被感染细胞的正常生化机器并使其制造仅细菌利用的新化合物。进一步研究之后，科学家能够鉴定那些基因导致疾病，并且由于细菌是很容易遗传操作的简单生物，他们用自己构建的潜在有用的基因取代了致病基因。然后这些细菌可以用于将基因从试管荷载至植物细胞中。然而不是所有的植物接触该细菌后最终都能得到该新基因。用抗生素纯化去除未改造的植物细胞。植物细胞对多种用于控制人和动物的细菌感染的抗生素敏感。如果能分离出使植物细胞对某种毒性抗生素具有抗性的基因，然后与某些目的基因物理连接并插入农杆菌，将可以提供杀灭未在感染中接受基因的那些细胞的选择系统。多年以来人们了解了那些使细菌对抗生素有抗性的基因，其通过生产分解或化学修饰而使抗生素无毒的酶而具有抗性。用上述的基因剪接技术，研究人员能改造编码解毒抗生素卡那霉素的酶的基因并生产了引起该酶在植物细胞中生产该酶的新的杂合基因而防止其在致死剂量的卡那霉素存在时死亡。结合这一抗生素筛选系统和植物组织培养步骤，有可能用农杆菌将基因引入多种植物，包括从矮牵牛到棉花。
棉花是特别重要的作物。商品形式的转基因棉花使用CryIAc(Monsanto的BOLLGARDTM)和使用CryIAc和Cry2Ab基因(Monsanto的BOLLGARDTMII)的联合来表达苏云金芽孢杆菌的内毒素。大田效率表道表明50-70％控制害虫棉铃虫(helicover paarmigera)和澳洲棉铃虫(H.punctigera)。也很有价值的是用名为CryET33和CryET34的苏云金晶体毒性基因改造的农作物植物，所述基因编码对鞘翅目毒性的晶体蛋白CryET33(29-kDa)和CryET34(14-kDa)。CryET33和CryET34晶体蛋白对拟谷盗(red flour beetle)幼虫和日本金龟子(Japanesebeetle)幼虫有毒。(参见，美国专利6399330)
转基因农作物的应用导致了对整体害虫控制的斗争中的新问题。一些问题涉及随植物成熟减少表达的内毒素，其导致在生长季节后期(棉花生长季的后1/3效率减少)和害虫可能产生对内毒素的免疫的可能性增加。这些缺点导致发展针对种植“窗口”，相对于本地害虫发育循环的害虫控制策略并且指定了杀虫剂应用的害虫群体最小域值。
转基因植物的生理压力和物理损坏也导致内毒素蛋白质表达下降，相应的害虫控制效率降低。因此，长期干旱和/或高温能降低转基因作物中内毒素表达速率并是对害虫的防护显著下降，导致需要使用杀虫剂喷雾。
内毒素蛋白表达下降的原因并不十分清楚。在BT棉花中，理论认为由于CMV3 5S启动子浓度减少，基因“沉默”或其它转录后事件，所以CryIAc基因表达下降。也有人认为CryIAc蛋白减少是因为植物内转化和扣押的增加，或者因为生长和衰老引起的稀释。人们理解在不成熟和成熟的BT棉花植物中CryIAc转录水平都不稳定。
如果存在用于处理表达杀虫有效蛋白的转基因植物，而在植物成熟、生理压力和物理损坏时仍然促进这些蛋白表达的系统将是非常有利的。
发明简述本发明的目的是提供处理表达杀虫蛋白的转基因植物，尤其是转基因作物的方法，且特别用于表达杀昆虫蛋白的转基因作物。
本发明的另一个目的是提供延长表达的蛋白以足够量存在的时间的方法，所述量足以控制以被处理植物为食的有害昆虫。
根据这些和其它目的，可以从本文看出，根据本发明的处理转基因农作物的方法包括对转基因植物的叶应用蛋白转运增强剂，所述叶表达杀虫有效的蛋白，所述增强剂促进被处理植物中杀虫有效蛋白的表达和/或稳定性。
尽管不希望受理由限制，发明者认为该蛋白转运增强剂以下述一或多种方式作用(a)在有缺水压力时作物细胞膜的保护性水替代品的形式；(b)作为目的杀虫蛋白的蛋白质稳定剂；和/或(c)作为结合促进经过植物内转运机器的运动的蛋白的结合物。结果，尽管有缺水的生理压力和植物损伤，根据本发明处理的转基因作物表达杀虫蛋白并将其运至果实组织。发明者认为根据本发明的处理也将在植物生长和成熟中持续表达有效水平的杀虫蛋白。
发明详述根据本发明用蛋白转运增强剂处理转基因植物，所述增强剂充分刺激和/或保护细胞表达和植物内转运机器使得尽管存在缺水、植物组织的物理损伤、生长和植物成熟，植物组织、果实和种子中维持所需水平的杀虫蛋白。在转基因植物组织中维持目的蛋白表达水平和浓度有助于维持较好的害虫控制的效率水平，进一步减少目前对抗效率下降所需要的杀虫剂的用量，并且将有助于防止接触的害虫存活和防止抗性害虫种群产生。
须知本文所用的百分比均为相对于总重量的重量比，除非另有说明。
适合用于本发明的蛋白转运增强剂包括根据式1结构的一或多种化合物和农业化学可接受的盐 式1其中X是NO2；Y是H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C2-C6烯基，且Z是C或N。
具体来说，Y部分可以是甲基、乙基、丙基、丁基、异-丁基，戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异-丁氧基、戊氧基和己氧基。
本发明所用的优选的蛋白转运增强剂包括根据上式结构的一或多种化合物和化合物的盐，其中X是相对于羟基邻位或对位的硝基，Y是氢或C1-C3烷氧基，且Z是碳原子。适合的盐包括水溶性碱金属盐(尤其是钠盐和钾盐)、铵盐和其它非植物毒性或对环境有利的水溶性盐。
最优选的蛋白转运增强剂包括下列的联合对硝基苯酚(A)、邻硝基苯酚(B)和2-甲氧基-5-硝基苯酚(C)的钠盐。尤其优选，蛋白转运增强剂包括这些盐在A∶B∶C为(0.1-10)∶(0.1-10)∶1比例范围的混合物。这些盐可自ATONIK?Asahi Chemical Mfg.Co.，Ltd，以A∶B∶C为2∶3∶1购得。
根据本发明的蛋白转运增强剂以一般每英亩被处理田野小于20克每种活性成分的比率(gAI/ac)使用。优选，这些增强剂以1-20gAI/ac范围的比率使用且更优选以3-18gAI/ac范围的比率使用。尤其优选，以总重量为基础，以0.01-5重量％的范围使用蛋白转运增强剂盐，且以每英亩0.5-20液体盎司(oz/ac)范围的比率应用。
根据本发明的蛋白转运增强剂可与一或多种活性成分、喷雾辅助剂、涂抹剂或适合目标植物的农业用途的其它物质联合应用。可以跟根据本发明的蛋白转运增强剂联合使用的活性成分例子包括除草剂、植物生长增强剂、植物生长阻滞剂、叶化肥、杀真菌剂(外用和系统性的)、和杀昆虫剂(外用和系统性的)。
可用的除草剂包括三嗪(例如，莠去津)、脲、草甘膦、草硫膦(sulfosate)、glyfosinate、和稀禾定(sethoxydim)。
适合用于本发明的植物生长增强剂包括植物生长激素，如84中鉴定的赤霉素(gibberillin)中的至少一种，且优选GA3，GA4，GA5，GA7，和GA9，细胞因子(例如，玉米素、激动素、苄腺嘌呤、二氢玉米素和异戊烯基腺嘌呤)；生长素(例如，吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA))；和2，4，5和6碳结构的多羟基羧酸；乙烯磷和化巴。
适合用于本发明的植物生长阻滞剂包括氯矮壮素、甲哌鎓(mepiquat chloride)以及马来酸酰肼及其盐。这种植物生长调节物影响和改变植物代谢过程而增强或妨碍植物生长。所有这些物质都可以根据其生产商在产品说明中提供的应用比率和时间而使用。
将得益于本发明的系统性杀真菌剂包括二甲十三烷吗啉、甲霜林、异菌脲、三乙膦酸铝、托布津、苯菌灵、三唑酮、萎锈灵、氧化萎锈灵、苯咪氨甲酯、噻苯咪唑、乙菌定、乙嘧酚磺酸酯、和甲菌定。
适合的系统性杀昆虫剂包括丁醛肟威、高灭磷、虫螨威、乐果、甲拌磷和特丁磷。
使表达和转运机制受到影响的特定机理并不清楚。例如，用放射性标记的硝基苯酚盐测试未改造的小麦示踪该处理物至被转运到小麦植物种子核中的蛋白中。另外的研究表明酚物质作为细胞膜的水合剂作用。
在棉花中，人们认识到棉花种子需要大量蛋白，并且种子在植物系统中从碳水化合物产生棉绒。用ATONIK?测试正常植物(即未遗传改造或改变以表达杀虫蛋白，作物植物代谢功能的正常部分)显示种子和棉绒产率的增加。这种作用与植物生长调节物的作用一致，但不一定暗示有关处理植物的作用的任何事情，所述植物已经被遗传改造而生产指定的蛋白作物正常功能的一部分。
能够根据本发明处理的转基因植物一般是由野生型改造而含有表达所需的杀虫有效的蛋白的基因的那些植物。优选，转基因植物包括表达杀虫有效的蛋白的基因，所述蛋白对昆虫、细菌、真菌、霉菌、螨虫等的袭击和感染提供抗性。
两种特别有效的基因是CryIAc基因(由CMV35S启动子驱动)和Cry2Ab基因。这些基因能单独或联合插入棉花、玉米、小麦、高粱、大豆和类似日用农作物以提供对多种有害昆虫的防护。特别有价值的是改造而表达杀虫有效的蛋白的棉花干(例如BT棉花)。可以根据本发明处理的BT棉花的留籽可以商标BOLLGARD?或BOLLGARD?II(MonsantoCo.)购得。
根据本发明的蛋白转运增强剂在植物生长周期或季节中以一定的比率和时间应用于转基因植物，使得在植物组织中维持杀虫蛋白表达和稳定化。下表鉴定了优选的要处理的转基因植物及在一般有用、优选和很优选的应用比率的蛋白转运增强剂的量。
表2
实施例在2升的盆里转基因Bt棉花(Deltapine Nucotn B)和未改造的棉花植物在受控的条件下用ATONIK?喷雾，这是一种含一般认为是生长调节剂的产品，但该生长调节剂对遗传改造的日常农作物作为蛋白转运增强剂作用良好。ATONIK?含有对硝基苯酚(0.3％)、邻硝基苯酚(0.2％)和5-硝基苯酚(0.1％)的钠盐。在第7真叶(TL)对棉花进行处理，并在10天后取样上部伸出的主干叶。保持温度在76-86华氏度及充足的水分。取样后(第7TL+10天)，在用ATONIK?喷雾，并接受压力条件升高温度(86-102华氏度)和不足的水分供应(干燥条件)直到5天后取样(第7TL+15天)上部伸出的主干叶。此后5天(第7TL+20天)处于相同条件，对植物取样叶和squares。
每次取样后，将组织样品放在密封袋中并立即拿到进行螟蛉饲喂测试的设备上。在对第一次喷雾应用样品开始饲喂的第24，48，72和96小时，和对第二次喷雾应用样品的第72和96小时测量螟蛉死亡率。
完成死亡率研究后，将来自代表性棉花植物的叶剖面拿去进行蛋白分析。在从顶端其第2，6，8和10个节的地方收集叶片并在-80华氏度储存。
在第一批收集的样品中收集的叶片的螟蛉死亡率示于表3
表3
在第二次喷雾后第5天和第10天收集的叶片的螟蛉死亡率示于表4。
表4
在第7TL+20天(第2次处理)收集的方块(square)的螟蛉死亡率示于表5。
表5
表6出示了用ATONIK处理对Bt棉花的高度和节数量的影响。
表6
结果表明用根据本发明的蛋白转运增强剂处理导致最佳生长状态(表3)和温度和缺水的压力条件下(表4和5)都有更高的螟蛉死亡率。然而用ATONIK处理不导致营养生长的增加。(见表6)


用蛋白质转运增强剂处理可以促进和维持转基因植物中目的蛋白的表达和稳定性。优选，该转基因植物是已经改造而表达杀虫有效的蛋白的普通农作物。