专利名称：甲基化fbp1基因的应用的制作方法胃癌是常见肿瘤之一。有报告显示，如果胃癌仅限于胃壁的粘膜层，5年的生存率可达95%。然而，目前很少有胃癌患者能够在早期被发现，导致5年生存率在20%左右。因此早检查、早治疗是降低胃癌死亡率的最关键手段。随着胃癌发病机理研究的深入，已发现多种基因异常。这些基因的改变决定着胃癌的生物学和临床行为，对这些改变的检测对于胃癌早期诊断具有重要意义，而使这些异常回复正常将是胃癌治疗的重要方向之一。基因的表观遗传学改变是肿瘤发生的重要原因，包括DNA甲基化的丢失、获得、以及组蛋白修饰为特征的染色质结构的变化等。这些表观遗传的改变，特别是抑癌基因启动子的超甲基化引起的基因沉默，影响着肿瘤发展的各个阶段。因此，抑癌基因启动子超甲基化水平可以作为肿瘤诊断和预后的分子标记，而抑制抑癌基因启动子甲基化或使已甲基化的抑癌基因启动子去甲基化将对肿瘤的预防、治疗具有重要意义。果糖-1，6-二磷酸作为糖酵解途径中重要的反应中间体受到果糖-6-磷酸酶和果糖-1，6- 二磷酸酶(Fructose-1，6-bisphosphatase，FBP)的双重调控。已有研究表明，肿瘤细胞中果糖-6-磷酸酶水平发生上调，但FBP基因仅以在肿瘤细胞中是否也发生变化以及其对肿瘤发生、发展的作用，至今还不清楚。在哺乳动物细胞中存在两种FBP基因的同工酶，其中FBP2基因只存在于肌肉中，而FBPl基因分布更为广泛。随着分子生物学的进展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定，不仅拓展了我们对肿瘤发生的认识，也为肿瘤诊治手段的开发提供了更多的机会。FBPl基因 (Fructose-1, 6-bisphosphatase-l) (Genbank No. NM_000507)，与肿瘤的关系尚不清楚，有待进一步研究。
本发明旨在以FBPl基因的DNA甲基化为基础的检测手段，提供甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。为实现发明目的，发明人提供如下技术方案甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。本发明从实验得知，FBPl基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，这是因为其启动子区DNA发生了肿瘤特异性的高甲基化。逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复FBPl 基因在肿瘤细胞中的表达。发明人和其他研究者都发现在胃癌和胃增生组织中有很多肿瘤相关的基因因为启动子的超甲基化而产生转录静默，FBPl基因是发明人研究发现的其中一个新的基因，因FBPl基因启动子的超甲基化而在胃癌细胞系中低表达，而且在胃癌细胞系中表达外源 FBPl基因后可以显著抑制细胞的增殖，同时发明人也在胃癌和胃增生组织中也证实FBPl 基因启动子甲基化水平明显高于正常组织。以上实验都表明FBPl基因是一个抑癌基因，其启动子的甲基化水平可以作为胃癌早期诊断的生物标记物。作为优选，根据本发明所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查方法中至少包括一对特异扩增FBPl基因甲基化的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物(FBP1 MSP-F) 具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；下游引物(FBP1 MSP-R)具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。作为优选，根据本发明所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查方法是以FBPl基因的DNA甲基化为基础的检测手段，所述的检测手段包括MSP法和BGS法。通过对FBPl基因mRNA的核酸序列分析，发明人发现在它的启动子区存在一个经典的CpG岛(CGI)(图2 )，序列分析的标准如下:GC含量>55%，0bsCpG/ExpCpG> 0. 65，长度大于500个碱基。因此我们采用甲基化特异性PCR (MSP)和亚硫酸盐处理后的基因组测序(BGS)来进一步验证FBPl基因启动子的甲基化。作为优选，根据本发明所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查方法以FBPl基因甲基化分析为基础。作为优选，根据本发明所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤包括但不限于胃癌肿瘤。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明提供了一种甲基化的新抑癌基因在肿瘤诊断、检测和筛选中的应用，以甲基化 FBPl基因为基础的诊断方法可方便快捷的在分子水平上实现肿瘤的检测，同时，以甲基化 FBPl基因为靶点和核心的药物可望成为肿瘤靶向诊断、检测和筛选的一种新手段。
图1是FBPl基因在去甲基化药物处理前后肿瘤细胞中的表达分析(RT-PCR法)。 FBPl基因在肿瘤细胞中的表达在去甲基化药物处理后显著升高。图2是FBPl基因启动子CpG岛示意图。FBPl基因含有一个典型的CpG岛，预示该基因可能受到DNA甲基化的调控。图3是MSP (甲基化特异PCR)方法检测胃癌细胞系中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。M表示甲基化；U表示非甲基化。图4是MSP (甲基化特异PCR)方法检测胃癌组织中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。M表示甲基化；U表示非甲基化。图5是BGS (亚硫酸氢盐修饰后测序)法检测胃癌细胞系中FBPl基因启动子DNA 的甲基化情况。黑圈代表甲基化；白圈代表非甲基化。图6是BGS (亚硫酸氢盐修饰后测序)法检测胃癌组织中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。黑圈代表100%甲基化；白圈代表100%非甲基化；灰圈代表甲基化和非甲基化
各占一半。
图7是肿瘤组织中FBPl基因的甲基化同肿瘤患者预后的关系。MSP法分析胃癌组织中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。生存率曲线法分析结果提示FBPl基因的DNA甲基化状况同肿瘤患者预后相关，FBPl基因发生甲基化的胃癌患者预后较差(p<0. 01)。

1.细胞培养
所有细胞均采用RPMI-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和 10%FBS，于37°C 5% CO2培养箱中进行培养。去甲基化药物的使用是参照常规的5-氮杂_2’ -脱氧胞嘧啶核苷)应用流程IOmM的Aza处理肿瘤细胞，连续3天，每天更换培养液。 同等量DMSO处理3天后的细胞用来作为对照。2.总RNA抽提试剂盒
细胞的总RNA是用hvitrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无 RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。3.总RNA的抽提
吸干细胞培养液后，直接加入Iml Trizol，室温下静置5分钟，收集细胞到1. 5ml离心管中。加入氯仿后，4° C离心分层；将上层水相转入新鲜1. 5ml离心管，加入Iml异丙醇，4° C 离心沉淀RNA ；用1. 5ml75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的 RNA质量鉴定紫外分光光度计测定沈0/观0比值(确认比值均在1. 7-2. 0)。并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。4. cDNA 的合成
逆转录反应(RT)使用美国 Applied Biosystem 公司的 High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。加入2 X RT bufferlO微升和总RNAlO 微升，反应总体积为20微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下25°C 10分钟；37° C 120分钟；85° C 5分钟；冷却至4° C0 -20° C保存备用。5.实时定量PCR
采用定量实时RT-PCR来比较分析组织中FBPl基因的mRNA水平，用GAPDH作为对照。 聚合酶链反应(PCR)使用美国Applied Biosystem公司的定量RT-PCR试剂盒(Power Sybr green)。反应总体积为20微升采用1微升cDNA模板，加入2XPCR bufferlO微升，高纯去离子水9微升。反应参数如下95°C预热2分钟；40个循环设置如下，95° C，30秒；60° C, 1分钟。6. PCR所用引物
PCR使用所有引物均在hvitrogen公司合成。具体序列如下 FBPl基因的RT-PCR引物
FBPl-F (上游引物)ACAGCAGTCAAAGCCATCTC (SEQ ID N0. 3), FBPl-R (下游引物)GGTTCCACTATGATGGCGTG (SEQ ID N0. 4)。GAPDH 的 RT-PCR 引物
GAPDH-F (上游引物)GGAGTCAACGGATTTGGT (SEQ ID N0. 5), GAPDH-R (上游引物)GTGATGGGATTTCCATTGAT (SEQ ID N0. 6)。7.结果分析
结果如图1所示，肿瘤细胞去甲基化后，FBPl基因表达显著升高，表明FBPl基因可能受到DNA甲基化调控。实施例2 MSP法检测FBPl基因启动子在胃癌细胞系中的甲基化水平 1.细胞培养
所有细胞均采用RPMI-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和 10%FBS，于37°C 5% CO2培养箱中进行培养。2.总DNA提取试剂盒
细胞的总DNA是用hvitrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。3.总DNA的抽提
培养细胞至对数生长期，吸干培养液后，直接加入Iml Trizol，室温下静置5分钟，收集细胞到1. 5ml离心管中。加入氯仿后，4°C离心分层；吸去上层水相后，加入0. 4ml无水乙醇，4°C，2000转/分离心沉淀DNA ；用Iml 0. IM的柠檬酸钠(溶于10%酒精)洗涤沉淀两次，每次30分钟，后用1. 5ml 75%酒精洗涤沉淀一次；用SmM氢氧化钠溶液溶解沉淀，12000 转/分离心10分钟后，取上清，用0. IM的HEPES液调节pH至8. 4。用NanoDrop (Nanodrop, Wilmington, DE, USA)测定 DNA 浓度。4.基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰试剂盒
基因组DNA的亚硫酸庆盐修饰是用ZYMO公司Zymo DNA Modification Kit按照生产商提供的操作步骤进行。重亚硫酸氢盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，从而反映出单个胞嘧啶的甲基化状态。5.基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰
取130 μ 1 CT Conversion Reagent到20 μ 1基因组DNA溶液中，然后将混合液98°C孵育10分钟，64°C孵育2. 5小时，4°C孵育20小时；将此150 μ 1混合液及600 μ 1 M-Binding Buffer加到Zymo- Spin IC Column中，全速离心30秒，弃去滤出液体，加100 μ 1 M-Wash Buffer至过滤柱中洗柱；洗柱后往过滤柱中加入200 μ 1 M-Desulphonation Buffer，室温放置15分钟，全速离心后，用M-Wash Buffer洗柱两次；最后用10 μ 1 M-Elution Buffer 溶解吸附柱上的DNA，离心收集修饰后DNA。6.甲基化特异性PCR (MSP)
FBPl启动子超甲基化的检测用MSP方法检测，使用美国Zymo公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升以1 μ 1亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，上下游特异性引物各1 μ 1， 2 X Zymo Taq premixed 10 μ 1，高纯去离子水7 μ 1。反应参数如下95°C预变性5分钟； 40个循环设置如下，95° C变性30秒；55° C退火30秒，62° C延伸30秒；最后62° C延伸10 分钟。1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(结果见图3)。PCR使用所有引物均在hvitrogen公司合成。具体序列如下 FBPl MSP
MSP-F (甲基化特异性上游引物)GATTTAAGTAGGCGGAGTCGC (SEQ ID NO. 1)， MSP-R (甲基化特异性下游引物):ACGAACCGCGAAACCTAACG (SEQ ID NO. 2)， FBPl USP
USP-F (非甲基化特异性上游引物):AGATTTAAGTAGGTGGAGTTGT (SEQ ID NO. 7)， USP-R (非甲基化特异性下游引物):ATACAAACCACAAAACCTAACA (SEQ ID NO. 8)。5.结果分析
FBPl基因启动子区存在有一个CpG岛(图2)。如图3所示，AGS，MKN45，MKN28和SNUl 等FBPl基因的mRNA水平下调的细胞中FBPl基因启动子明显被甲基化，而在FBPl基因表达正常的KatoIII和N87细胞，表明肿瘤细胞中FBPl表达下调同DNA甲基化相关。实施例3 MSP法检测FBPl基因启动子在胃癌组织中的甲基化水平 1.组织分离
所有标本均经病理确认。手术切除标本一经离体，迅速切取肿瘤病灶及癌旁组织，放入液氮中保存。2.总DNA提取试剂盒
组织的总DNA是用^witrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。3.总 DNA 抽提
将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzoI试剂的勻浆器中，勻浆数分钟；将勻浆后的液体转入离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；吸去上层水相后，加入0. 4ml无水乙醇，4°C，2000转/分离心沉淀DNA ；用Iml 0. IM的柠檬酸钠(溶于 10%酒精)洗涤沉淀两次，每次30分钟，后用1. 5ml 75%酒精洗涤沉淀一次；用SmM氢氧化钠溶液溶解沉淀，12000转/分离心10分钟后，取上清，用0. IM的HEPES液调节pH至8. 4。用 NanoDrop (Nanodrop, Wilmington, DE, USA)测定 DNA 浓度。4.基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰、MSP及所用特异性引物均参照实施例2 (结果见图4)
5.结果分析
FBPl基因启动子在部分胃癌组织中高度甲基化(图4)，图中m和N2表示正常胃粘膜； NTl和NT2表示癌旁组织；Tl和T2则提示肿瘤组织；MKN^和NC1-N87分别用做甲基化阳性和阴性对照。实施例4 BGS法检测FBPl基因启动子在胃癌细胞系中的甲基化水平 1.细胞培养、总DNA的提取、基因组DNA的亚硫酸氰盐修饰均参照实施例2。2. BGS特异性引物PCR所用试剂与反应条件参照实施例2中MSP的方案，PCR使用所有引物均在hvitrogen公司合成。具体序列如下
FBPl BGS
BGS-F (上游引物)GTTTGGTTTGGTTTAGTTGTATT (SEQ ID NO. 9), BGS-R (下游引物)GAAATAACTTTAACTACTATACAAAA (SEQ ID N0. 10)。3. PCR产物回收纯化
PCR 产物回收纯化使用 Promega 公司的 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 胶回收试剂盒，PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带所在位置的琼脂糖凝胶， 以每IOmg琼脂糖凝胶10 μ 1 Membrane Binding Solution的比例，60°C水浴直至琼脂糖凝胶彻底溶解，将上述溶液加到DNA吸附柱中，以16000转/分离心1分钟，经Membrane Wash Buffer洗涤后，用超纯去离子水溶解DNA并离心收集。4. DNA 测序
回收纯化后的 DNA 直接用 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit 在 ABI 3100测序仪上测序。5.结果分析
结果如图5所示，表达下调并且MSP阳性的MKN45和SNUl细胞中FBPl基因启动子高甲基化，而在Kato III细胞中FBPl基因启动子几乎没有被甲基化，同实施例2的MSP法检测结果一致(图5，CpG用圆圈表示，黑色代表高甲基化，白色代表低甲基化；具体位置参考图2)。实施例5 BGS法检测FBPl基因启动子在胃癌组织中的甲基化水平 1.组织分离、组织中总DNA的提取参照实施例3。2.基因组DNA的亚硫酸盐修饰参照实施例2。3. BGS特异性引物PCR及所用引物、PCR产物回收纯化和DNA测序参照实施例4。4.结果分析
正常胃粘膜组织(W和N2)中FBPl基因仅有零星甲基化，而癌旁组织中(NTl和NT2)) FBPl基因甲基化程度轻微增加，胃癌组织中FBPl基因甲基化程度明显增高(见图6)。结论
FBPl基因启动子在胃癌细胞和胃癌组织中高甲基化，表明FBPl基因启动子甲基化可以做为胃癌的诊断分子标记。而使FBPl基因启动子去甲基化可能会有防治胃癌的作用。因此，FBPl基因启动子甲基化在肿瘤诊断、预防和治疗中会有一定的应用价值。
实施例6 FBPl基因启动子甲基化状况是一个独立的胃癌预后因素 1.组织分离、组织中总DNA的提取参照实施例3。2.基因组DNA的亚硫酸盐修饰参照实施例2。3. MSP及所用特异性引物均参照实施例2。4.运用多因素Cox风险回归模型分析FBPl基因启动子甲基化状况在胃癌预后判断中的价值，已知影响胃癌预后的相关因素如性别、年龄、Lauren分型、分化以及 !分期等都包括在模型中。5.结果分析
FBPl基因启动子甲基化预示胃癌患者的不良预后，相对风险度为3.6 (1.35-9. 59) (p=0. 01)。如图7所示，FBPl基因的DNA甲基化状况同肿瘤患者预后相关，FBPl基因发生甲基化的胃癌患者预后较差，生存时间显著缩短(P<0. 01)。Y轴表示相对生存率，X轴表示生存时间(年)。结论
FBPl基因启动子在胃癌细胞和胃癌组织中高甲基化，表明FBPl基因启动子甲基化可以作为胃癌的诊断分子标记。FBPl基因启动子甲基化也可以用来预测胃癌患者的预后。而使FBPl基因启动子去甲基化可能会有防治胃癌的作用。因此，FBPl基因启动子甲基化在肿瘤诊断、预防和治疗中会有一定的应用价值。尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。


发明涉及医药生物技术领域，具体提供甲基化FBP1基因在制备肿瘤诊断、检测和筛查药物中的应用。FBP1基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，这是因为其启动子区DNA发生了肿瘤特异性的高甲基化；逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复FBP1基因在肿瘤细胞中的表达。FBP1基因启动子在胃癌细胞和胃癌组织中高甲基化，FBP1基因甲基化也可以用来预测胃癌患者的预后FBP1基因发生甲基化的胃癌患者预后较差，生存时间显著缩短。因此，FBP1基因启动子甲基化在肿瘤诊断、预防和治疗中有一定的应用价值。