专利名称：铁氰化钾在制备抑制癌细胞转移药物中的应用的制作方法近年来，癌症已成为一种严重威胁人类健康的主要疾病，通常没有有效的治疗手 段，WHO在其权威的《与慢性病面对面癌症》报告中说“癌症问题依然严重”，"2005年约 有760万人死于癌症，占全球死亡的13%”。癌症主要是因为机体在各种致癌物质、致癌因素的作用下导致身体正常细胞发生 癌变，形成癌细胞，癌细胞无限制增生形成肿瘤的结果。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，良 性肿瘤因为无侵润和转移能力，可以与正常组织明显分界，因此可通过切除手段进行治疗， 对机体危害较小。恶性肿瘤具有侵润和转移能力，能迅速破坏周围的组织、器官的结构和功 能，广泛转移时，影响全身的功能，最后造成各系统的功能紊乱，直至衰竭。一般来说，癌细 胞进行转移会分为几个阶段第一个阶段称为侵犯，这个阶段中癌上皮细胞会松开癌细胞 之间的连接，使得癌细胞“重获自由，，而能移动到其他地方去。第二个阶段称为内渗，癌细 胞穿过血管或淋巴管的内皮进入循环系统。第三阶段称为外渗，在这个阶段当中，经过循环 系统之旅洗礼的幸存者，会穿过微血管的内皮细胞到达其他的组织。最后的阶段就是这些 癌细胞的新大陆移民，在其他组织当中繁衍茁壮形成转移的恶性肿瘤。因此抑制癌细胞的 侵润和转移，将肿瘤控制在良性肿瘤的范围内，通过手术手段将其切除，是攻克癌症的一个 途径。在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中，癌细胞首先需要降解细胞外基质 (extracellular matrix, ECM)及基底膜(BM)，ECM成分的降解是癌细胞侵袭和转移 的必要步骤。而这个降解功能主要就是由蛋白水解酶完成，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是蛋白水解酶中较为重要的一类，是其中对ECM起主要降 解作用的蛋白酶。MMI3S可以通过对基底膜和血管基质的降解增强肿瘤性血管的生成作 用并促进癌细胞的侵袭和转移。由于MMI3S在肿瘤侵袭、转移中起着重要的作用，因此 对MMPs的抑制可以作为筛选抗肿瘤药物的首道屏障，基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloroteinase inhibitors, MMPIs)的研究是开发抗肿瘤药物，攻克癌症的一大突破以MMPs为靶标的抗癌药物筛选首先是要选取对MMPs具有抑制活性的抑制剂，但 MMPs抑制活性高并不一定对癌细胞也具有较高的抑制作用。山东大学王兴坡博士论文(以 基质金属蛋白酶为靶点的大黄素类衍生物的设计、合成、生物活性及定量构效关系研究， 2006)中，研究者设计合成了 D、H、J、L、N五个系列共61个新型大黄素蒽醌类衍生物，研究 了其对MMPs及子宫内膜癌KLE肿瘤细胞的抑制活性，结果表明N系列和J系列化合物对 MMP的抑制活性要比相应的L系列和H系列活性好，而对KLE肿瘤细胞抑制作用无明显区 别。也就是说，对MMPs有很好抑制作用的抑制剂不一定对肿瘤细胞具有好的抑制作用。中国发明专利申请(CN2009100227315)公开了 一类对MMPs有很高抑制作用的化合物，其为含三价金属离子的盐类，包括含三价金属离子的复盐及配合物，其中也包括 K3 [Fe (CN)6]。该项研究的初筛是在酶学基础上进行的，筛选出仅对MMf3S有抑制活性的MMPs 抑制剂，但该抑制剂是否具有抗肿瘤效果需要进一步进行细胞实验。
本发明的目的是提供铁氰化钾在制备抑制癌症细胞转移药物中的应用。基于上述目的，发明人在酶学实验初筛中，对半抑制浓度非常好的K3 [Fe (CN) 6]进 行了进一步的细胞实验。实验结果显示K3[Fe (CN)6]对HT1080细胞的存活力影响较小，在 100 μ M的浓度范围内，其细胞活力均在80%以上，而在较低的给药条件下，K3[Fe (CN) 6]对细 胞的转移能力均有比较显著的抑制作用。在细胞的转移实验中，10 μ M的给药浓度下，对细 胞转移能力已经有了明显影响。结果显示K3 [Fe (CN)6]对肿瘤细胞的转移具有很好的抑制 作用，有望进一步开发为抗肿瘤药物。图1为K3 [Fe (CN) 6]浓度对细胞存活率的影响； 图2为K3 [Fe (CN)6]浓度对细胞转移率的影响。KjFe(CN)6]在酶学水平上对MMPs的抑制作用反应在50 mmol/L HEPES缓冲体系 (pH6. 8)中进行，其中含有 200 mmol/L NaCl，10 mmol/LCaCl2, 20 μ mol/L ZnCl2,10 mmol/L MgCl2和0.01% Brij-35(聚氧乙烯月桂醚)。在一定的酶浓度下，将1(3[ 6(0幻6]按不同浓度 添加到反应混合物中，在37° C放置30分钟。反应通过加入1 μ 1,200μ g/ml DQ-gelatin 底物起始反应。抑制效率通过比较有无抑制剂存在下的酶活性决定。荧光采用FLXSOO-光酶标仪(Bio-Tek)检测，激发波长在495nm，发射波长在515nm。 所有的实验均在96孔 板中进行，每次的测量值减去背景荧光吸收矫正。实验发现铁氰化钾对多种MMPs有很好的 抑制作用，见表1。说明铁氰化钾在酶学水平上对基质金属蛋白酶具有广谱抑制作用。
表1 K3〖Fe(CN)6对不同MMPs的半抑制活性


本发明公开了一种能有效抑制癌症细胞转移的药物K3[Fe(CN)6]，发明人在酶学实验初筛中，对半抑制浓度非常好的K3[Fe(CN)6]进行了细胞实验，结果显示K3[Fe(CN)6]对HT1080细胞的存活力影响较小，在100μM的浓度范围内，其细胞活力均在80%以上，而在较低的给药条件下，K3[Fe(CN)6]对细胞的转移能力均有比较显著的抑制作用。在细胞的转移实验中，10μM的给药浓度下，对细胞转移能力已经有了明显影响。结果显示K3[Fe(CN)6]对肿瘤细胞的转移具有很好的抑制作用，有望进一步开发为抗肿瘤药物。