专利名称：一种同源四倍体水稻的诱导方法水稻是重要的粮食作物。杂交水稻的培育成功是水稻育种上的一项重大突破，对解决我国和世界粮食问题做出了巨大的贡献。但随着经济的发展，人口增加，土地面积减少以及环境的恶化，使粮食问题显得十分突出。另据联合国粮农组织分析预测，到2025年世界人口将达到85亿人，粮食缺口将达到8亿吨。因此，要彻底解决全球粮食危机，特别是中国等发展中国家的粮食问题，杂交水稻的产量还远远不够，还必须培育出产量更高的优质新品种或新组合。 自然界广泛存在植物多倍体现象，多倍体具有繁茂性、硕大性、适应力强、生物产量高等优点，一直是育种家长期追求的目标。关于水稻染色体组多倍化所导致的优势现象的研究目前仍然处于探索性阶段，其潜在的研究意义和利用价值近年来已经引起了一些研究者的关注。在同源四倍体水稻的育种研究中，传统技术主要包括物理法(冷热刺激)、化学法(化学物质诱导)和生物法(自然变异)。其中，利用秋水仙素对种芽进行诱导的方法(种芽诱导法)是获得同源四倍体水稻种质比较好的传统方法。然而，在过去六十多年的研究中，同源四倍体水稻研究的技术性难题之一仍然是染色体组多倍化的诱导频率太低(通常低于万分之一)，以至于同源四倍体水稻的种质资源相当有限(目前全世界的同源四倍体水稻的种质资源少于3000份，而二倍体水稻的种质资源已经超过200000份)。同源四倍体水稻的诱导频率太低的主要原因应该归咎于传统的种芽诱导技术和稻谷种胚的形态结构。利用种芽诱导法获得同源四倍体水稻的频率低的原因主要归结于以下三方面其一，从种芽诱导法的技术路线来看，当利用秋水仙素水溶液对稻谷的种芽进行处理时，种芽的生长点外围还包裹着其它的组织(如胚芽鞘、不完全叶、第一片真叶、第二片真叶等等)，这对于秋水仙素水溶液渗透到种芽的生长点并对其细胞产生染色体组多倍化的诱导作用会有很大的限制(即秋水仙素水溶液渗透到种芽的生长点细胞位置的难度加大)。其二，在种芽内的生长点细胞的结构比较复杂，其中包括外围的两层形成层细胞和由其包围的一群形态不规则的分生细胞。当秋水仙素水溶液渗透到种芽的生长点细胞区域时，由于各个细胞的发育进度不一致，由此导致某些分生细胞被诱导为多倍体细胞而另一些分生细胞并没有被诱导为多倍体细胞。其三，在种芽内具有不同染色体组倍性的生长点细胞的发育进度不一致，即二倍体分生细胞在生长发育上比多倍体分生细胞更有优势，结果使二倍体分生细胞所产生的一大批子细胞限制了多倍体分生细胞及其子细胞的生长发育速度，最后只能由大部分二倍体分生细胞所产生的一大批子细胞完成植株的形态建成，在诱导当代植株的稻穗中出现膨大颖花的机率很低(从种芽开始生长发育到幼穗分化，再到孕穗始穗这一段生长发育期，二倍体分生细胞比多倍体分生细胞具有更强的生长势)。由于以上三方面原因，导致利用传统的种芽诱导法获得同源四倍体水稻的频率通常很低(诱导频率低于0.01% )，因此通过研究寻找一种提高同源四倍体水稻的诱导频率的方法，显得尤为重要。
鉴于现有技术中同源四倍体水稻诱导频率太低的问题，本发明采用种芽诱导和无性系技术相结合，由此建立一种多倍体水稻的诱导方法，尤其提供一种同源四倍体水稻的诱导方法。该方法可以显著提高同源四倍体水稻的诱导频率，以便在最短的时间内创制出更多的同源四倍体水稻新种质，由此促进水稻染色体组多倍化的研究进程。本发明的目的是这样实现的 在本发明所提出的诱导同源四倍体水稻的方法中，采用二倍体水稻种子作为外植体，包括以下步骤a.浸种催芽；b.秋水仙素水溶液处理；c.无性系诱导愈伤组织；d.再生苗诱导并获得实生苗。所述浸种催芽的过程为以二倍体水稻种子为材料，在30°C条件下浸泡48小时，每12小时清洗I次，清洗后将种子放在湿纸上催芽，直至种子露出白色芽点为止。所述秋水仙素水溶液处理的过程为将露出白色芽点的种子浸泡在0. 1%的秋水仙素水溶液中48小时，每隔12小时清洗I次，随后用无菌水清洗3次后再次在湿纸上催芽24小时。所述无性系诱导愈伤组织的过程为将经过消毒的带有膨大芽的水稻种子接种在N6培养基上，在温度为30°C的黑暗条件下培养30 35天，由此诱导出愈伤组织。所述再生苗诱导并获得实生苗的过程为将带有愈伤组织的培养瓶移至光照培养室，在N6培养基上再培养60 80天，待再生苗长至10 15cm时进行实生苗炼苗处理。在试验中分别以IR28、IR36和新稻10号种子为外植体进行同源四倍体水稻的诱导，均获得了比较好的试验效果和一大批同源四倍体水稻新种质。与现有技术相比，本发明涉及的同源四倍体水稻诱导方法具有如下优点和显著的技术进步(I)在传统的种芽诱导法中，秋水仙素水溶液渗透到种芽的生长点细胞位置的难度比较大，而在本发明所提出的方法中首先利用秋水仙素水溶液直接处理种芽细胞，进而使种芽细胞很容易接触到秋水仙素水溶液，这有助于秋水仙素对种芽细胞的诱导。(2)在传统的种芽诱导法中，种芽内的生长点细胞的结构比较复杂，由此导致某些分生细胞有可能被诱导为多倍体细胞，而另一些分生细胞并没有可能被诱导为多倍体细胞。在本发明所提出的方法中所有与秋水仙素水溶液直接接触的种芽细胞都有可能被诱导为多倍体或非整倍体，进而使得无性系接种材料中多倍体或非整倍体细胞的比例大大增力口，而二倍性细胞的比例相对减少，这有助于增加具有染色体组多倍性的愈伤组织。(3)在传统的种芽诱导法中，种芽内具有不同染色体组倍性的生长点细胞的发育进度不一致，二倍体分生细胞所产生的一大批子细胞限制了多倍体分生细胞及其子细胞的生长发育速度，最后只能由大部分二倍体分生细胞所产生的一大批子细胞完成植株的形态建成。在本发明所提出的方法中，所有被秋水仙素水溶液诱导的种芽细胞在培养基上均具有被诱导为愈伤组织的可能性，一旦被脱分化为无性系则有可能分化为实生苗，这有助于提高多倍体实生苗的诱导频率。由于以上三方面的技术改进和技术优点，进而导致利用本发明的诱导法获得同源四倍体水稻的频率通常比较高(诱导频率高于3. 0% )。图为同源四倍体水稻无性系诱导法的技术路线图。

硫酸铵463
磷酸二氢钾400
硫酸镁(MgS04 7H20)185
氯化钙(CaC12 2H20)165
乙二胺四乙酸二钠37.3 硫酸亚铁(FeS04 7H20)27.8
硫酸锰(MnS04 H20)4.4
硫酸锌(ZnS04 7H20)1.5
硼酸1.6
碘化钾0.8
2.有机物单位mg/L 维生素BI(盐酸硫胺素)1.0 维生素B6(盐酸吡哆醇)O.5 烟酸0.5 甘氨酸2.0 蔗糖20000
pH 值 5.8250C
用法称取本品24. lg，加热搅拌溶解于IOOOml蒸馏水中，分装三角瓶115°C高压灭菌20分钟备用。


本发明公开了一种同源四倍体水稻的诱导方法，该方法采用二倍体水稻种子作为外植体，包括以下步骤a.浸种催芽；b.秋水仙素水溶液处理；c.无性系诱导愈伤组织；d.再生苗诱导并获得实生苗。本发明方法可以显著提高同源四倍体水稻的诱导频率，以便在最短的时间内创制出更多的同源四倍体水稻新种质，由此促进水稻染色体组多倍化的研究进程。