一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子1c4的制作方法[0002]自2009年4月起，甲型HlNl流感(A/H1N)疫情在世界范围内爆发。这一疫情从北美迅速传播扩散到5大洲200多个国家和地区。据世界卫生组织报道，截止2010年4月9日，甲型A/H1N1流感疫情已在超过213个国家爆发，全球甲型HlNl流感死亡病例已超过1.77万例。在我国，据中国疾病预防控制中心报道，截至2010年3月31日，全国31个省份累计报告甲型HlNl流感确诊病例12.7万余人，已治愈12.2万，死亡800例。[0003]流感病毒属于正粘病毒科，有包膜，呈球型、椭圆型或丝状，病毒包膜来自宿主细胞的双层类脂膜。流感病毒属单链的RNA病毒。根据核蛋白(NP)和细胞质蛋白(Ml)的差异，流感病毒可分为A、B、C(甲、乙、丙)三种亚型。对A型流感病毒，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白抗原性的不同，又可进一步分为不同的亚型。目前，A型流感病毒有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。[0004]A型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成(见图1)，每个RNA片段编码一至两个蛋白。因此A型流感病毒共有8个基因，编码10种蛋白。其中，HA蛋白对于结合细胞表面受体和病毒与细胞的膜融合起重要作用，在感染细胞前，HA会水解成HAl和HA2,其中位于HAl上的受体结合区(receptor binding domain, RBD)的附近区域,在不同流感病毒株中高度变异(RBD本`身比较保守)，是重要的中和性表位所在区域，目前发现的多种中和性抗体所针对的表位大多位于HAl蛋白的RBD附近区域。但是这些抗体大多不具备中和不同亚型或同一亚型不同毒株流感病毒的能力。NA可以去除唾液酸，帮助子代病毒的释放和避免病毒自身的聚集；PA、PB I和PB2三种聚合酶以及NP核蛋白主要用于病毒RNA的复制和转录；基质蛋白Ml负责核外输送，M2负责形成离子通道；非结构蛋白NSl是干扰素的抑制剂，NS2负责核外输送。[0005]目前，国家许可用于治疗流感的药物主要为以下两大类:1)烷胺类(金刚烷胺和金刚乙胺)；2)流感病毒神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)。对烷胺类药物，已出现大量的耐药性流感毒株，因此目前世界卫生组织不建议使用烷胺类药物作为治疗流感的药物；目前大部分流感病毒(包括甲型HlNl流感)仍对奥司他韦和扎那米韦敏感，但在日本等地区也已经出现耐药性毒株，耐药性毒株的出现限制了这些化学小分子药物的大规模使用。[0006]治疗性抗体用于流感的等病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1禽流感病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有广谱中和活性的抗流感病毒的治疗性抗体具有以下潜在优势，一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合，另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。[0007]因此，本领域很有必要针对流感病毒开发亲和性良好且副作用低的治疗性抗体，如人源化或全人源的抗体，以满足临床治疗的需求。

[0008]本发明的目的在于提供一种抗流感病毒广谱中和性全人单克隆抗体及其应用。
[0009]在本发明的一个方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含SEQID N0:8所示重链CDRl区、SEQ ID NO:9所示重链CDR2和SEQ ID NO: 10所示重链CDR3区；其能识别并结合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亚基中的表位。
[0010]在本发明的另一个方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含SEQ IDNO: 14所示轻链CDRl区、SEQ ID NO: 15所示轻链CDR2和SEQ ID NO: 16所示轻链CDR3区；其能识别并结合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亚基中的表位。
[0011]在本发明的另一个方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:8所示的重链CDRl，SEQ ID NO:9所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 10所示的重链⑶R3，SEQ ID NO: 14所示的轻链⑶Rl、SEQ ID NO: 15所示的轻链⑶R2和SEQID NO: 16所示的轻链⑶R3 ;其能识别并结合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亚基中的表位。
[0012]在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
[0013]在另一优选例中，所述的结合分子包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
[0014]在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0015]在另一优选例中，所述的结合分子包含抗体的重链恒定区和或轻链恒定区。
[0016]在另一优选例中，所述的结合分子是Fab、F(ab’ )、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体。
[0017]优选的，所述的结合分子是人单克隆抗体。
[0018]更优选的，所述的人单克隆抗体其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQID NO:2和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其重链恒定区选择下组中重链类型之一的恒定区:IgGl, IgG2a、IgG2b和IgG3，和其轻链恒定区选择下组轻链类型的恒定区之一:k链和入链。
[0019]更优选的，所述的人单克隆抗体其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQID NO:2和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其重链恒定区和轻链恒定区分别具有Genebank号ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。
[0020]在另一优选例中，所述的单克隆抗体识别流感病毒HA蛋白上介于线性和空间构象之间的表位。 [0021]在本发明的一个方面，提供编码所述的结合分子的核酸分子。
[0022]在本发明的一个方面，提供所述的结合分子在制备用于诊断、治疗和/或预防流感病毒所致的流感感染的药物中的用途。
[0023]在另一优选例中，所述的流感病毒的毒株选自如下一组:H1亚型流感病毒(如H1N1)、H3亚型流感病毒(如H3N2)和H9亚型流感病毒(H9N2)。
[0024]在本发明的一个方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有编码所述的结合分子的DNA。
[0025]在本发明的一个方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。
[0026]在本发明的一个方面，提供一种组合物，它含有有效量的所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
[0027]在本发明的一个方面，提供一种检测流感病毒的试剂盒，其包括所述的结合分子。
[0028]在另一优选例中，所述的试剂盒还包括:抗原或抗体包被用试剂，洗涤试剂，第二抗体，标记物(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、P -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶)，显色剂酶底物等。
[0029]在本发明的一个方面，提供一种(优选非治疗性地)抑制流感病毒的方法，所述的方法包括给予患者有效量的所述的结合分子。
[0030]在本发明的一个方面，提供一种(优选非诊断性地)检测流感病毒的方法，利用所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子与受试样品的结合情况，获得流感病毒的存在情况以及存在量。
[0031]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。



[0032]图1、A型流感病毒结构示意图。
`[0033]图2、@ -actin内参的PCR扩增产物的电泳结果。
[0034]图3、重链基因的PCR扩增产物的电泳结果。
[0035]图4、轻链基因的PCR扩增产物的电泳结果。
[0036]图5、全人单克隆抗体(1C4)浓度。
[0037]图6、全人单克隆抗体(1C4)识别HA/HA1蛋白。
[0038]图7、全人单克隆抗体(1C4)识别流感病毒的广谱性。
[0039]图8、全人单克隆抗体1C4的广谱中和活性。A:A/Sichuan/l/2009 (HlNl) ；B:A/Jiangx1-Donghu/312/2006(H3N2) ；C:A/Guangzhou/333/99(H9N2)。
[0040]图9、载体AbVec-hlgG的质粒图谱。
[0041]图10、AbVec-hlgKappa 的质粒图谱。

[0042]本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种含有独特的互补决定区(⑶R区)的抗流感病毒广谱中和性的结合分子，优选全人单克隆抗体，该结合分子对于流感病毒具有广谱中和作用。在此基础上完成了本发明。
[0043]结合分子
[0044]本发明提供了能特异性结合流感病毒的结合分子。优选地，所述结合分子是人结合分子。优选地，本发明的结合分子呈现对于流感病毒的中和活性。
[0045]本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链卩遼菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与禽流感病毒毒株的特异性抗原结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
[0046]本发明的结合分子也可以特异性结合流感病毒的一或多个片段。对于治疗和/或预防流感病毒的方法而言，所述结合分子优选能特异性结合流感病毒的表面可及蛋白质。在特定的实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合流感病毒的HA2分子。
[0047]本发明还提供了所述的结合分子在制备诊断、预防和/或治疗流感病毒感染的药物中的应用。这种感染可以在小群体中发生，但是也可以以季节流行病方式在世界范围传播，或者更严重地在全球蔓延，数百万个体处于危险之中。本发明提供了可以中和导致这种季节流行病以及潜在的全球性流行病的流感病毒毒株的感染的结合分子。重要的是，目前可以预期利用本发明的结合分子对于多种流感病毒毒株起到防护和治疗作用，因为己经揭示了由于与在不同流感病毒毒株的HA蛋白之间共享的表位的结合，因此目前可以使用本发明的结合分子在这些毒株之间进行交叉中和作用。本发明的结合分子可以大规模地制备和贮存，因为其提供了针对不同的流行性毒株的保护作用，且对于为将来可能发生的流感爆发做准备是有利的。
[0048]CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明的结合分子包含本文揭示的至少两个⑶R。
[0049]本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合流感病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合流感病毒或其片段。优选地，所述功能变体能竞争性特异性结合由亲代结合分子特异性结合的至少两(或更多个)不同的流感病毒毒株或其片段。此外，如果某分子对于亲代结合分子对其具有中和活性的流感病毒、优选对于至少两(或多个)流感病毒毒株具有中和活性，则认为该分子是本发明结合分子的功能变体。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
[0050]所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
[0051]保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
[0052]此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合流感病毒或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于流感病毒HlNl或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或CDR区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个CDR，以及更保守的区域，即所谓的构架区((FR)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残 基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50%至大约99%、优选至少大约60%至大约99%、更优选至少大约70%至大约99%、甚至更优选至少大约80%至大约99%、最优选至少大约90%至大约99%、特别是至少大约95%至大约99%，以及特别是至少大约97%至大约99%的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于流感病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。
[0053]作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，优选它包括人源的恒定区(如人源恒定区IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗流感病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构，且它们是全人源的。
[0054]本发明包括:具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及⑶R区与本发明的单克隆抗体的⑶R具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性的任何抗体。
[0055]抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region,CDR),所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的P折叠在空间结构上相互靠近，重链上的⑶R和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了 FR或⑶R区域。
[0056]对于本发明的单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。
[0057]经验证，本发明的抗流感病毒单克隆抗体的CDR区是全新的，其针对的是一个独特的流感病毒HA蛋白上的抗原表位，技术构思不同于现有的抗流感病毒抗体。本发明的抗流感病毒单克隆抗体所识别的表位介于线性和空间构象之间。[0058]本发明的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人抗体。因此，其在具有特别优异的识别和中和流感病毒的作用的同时，还具有免疫原性低、安全性高的特点。
[0059]在本发明的实施例中，本发明从接种2009年甲型HlNl流感病毒裂解疫苗(2009/Cal)志愿者体内获得外周血单个核细胞(PBMC)，使用⑶19+/IgG+/HA为特异性标志物，经流式细胞仪分选(FACS)获得识别HA蛋白特异性B细胞。使用文献已报道的单细胞RT-PCR 技术(Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124)，获得了抗体基因并在293T细胞中进行表达获得全人单克隆抗体1C4。ELISA表位分析得知这株抗体识别血凝素HA蛋白的HA2亚基，HA2在不同种属流感病毒中具有保守性，表明这株抗体可能的识别广谱性。微中和实验证明此抗体能够中和A/Sichuan/1/2009 (HlNl)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2), A/Guangzhou/333/99 (H9N2)流感病毒，表明此株抗体具有广谱中和活性，在临床上具有预防和治疗多种亚型流感病毒感染的潜在价值。
[0060]另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记如可检测的部分/物质的分子。本发明还涉及本发明免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明免疫缀合物与另一分子的混合物，所述另一分子如治疗剂或者另一结合分子或免疫缀合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并且可以与结合分子非共价地结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与人结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子结合/缀合。标记与结合分子的缀合技术为本领域技术人员所熟知。
[0061]本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经感染流感病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测流感病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/`物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
[0062]此外，本发明的人结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于流感病毒HA蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列如肤融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、血凝素(HA)标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。
[0063]另一方面，本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子结合流感病毒并且附着于结合分子的抗原将引发对于所述缀合物的有力T细胞攻击，最终导致流感病毒的破坏。
[0064]除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。
[0065]本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。
[0066]本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。
[0067]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0068]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0069]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。
[0070]本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗流感病毒单克隆抗体重链可变区(VH)与恒定区的IgH (来自人源IgH的恒定区)融合序列和轻链可变区VL与人体Igkappa(来自人源Igkappa的恒定区)融合序列。
[0071]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CH0、C0S7、NS0或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如293细胞。
[0072]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，或常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0073]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0074]本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。
[0075]如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0076]本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳中。
[0077]药物组合物
[0078]本发明的结合分子可用于制备抑制流感病毒的组合物。
[0079]基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制流感病毒或流感病毒感染相关疾病的组合物，其包含:有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。
[0080]本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。
[0081]可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀 粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween?;润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
[0082]本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
[0083]本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂如MZ抑制剂(例如amantidine、金刚乙胺(rimantadine))和/或神经氨酸酶抑制剂(例如扎那米韦((zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir))可用于预防和/或治疗流感病毒感染。
[0084]所述药物组合物可包含两或多个对于流感病毒具有中和活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合应用时，所述结合分子呈现协同中和活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有中和活性的结合分子，特征在于所述结合分子在中和流感病毒中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合应用时，结合分子的组合作用高于单独应用时的加合作用。所述协同作用的结合分子可以结合流感病毒的相同或不同片段上的不同结构。计算协同作用的方式是通过组合指数计算。组合指数(Cl)的概念己经由Chou andTalalay(1984)描述。
[0085]本发明的结合分子或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。感病毒流感病毒中也可以协同作用。
[0086]可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.01-100mg/kg体重,优选0.l-15mg/kg体重。此外,例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种人结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。
[0087]检测试剂和试剂盒
[0088]本发明的结合分子可用于制备检测流感病毒的试剂或试剂盒。
[0089]如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。
[0090]以所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测流感病毒(如甲型流感病毒；更特别地如甲型HlNl、H3`N2、H9N2病毒)的试剂盒。
[0091]因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗流感病毒的结合分子。
[0092]在获得了本发明提供的结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测流感病毒的检测试剂盒。
[0093]作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。
[0094]作为本发明的一种优选方式，所述的结合分子是抗体，可根据双抗夹心法的原理来检测。双抗夹心法常规的做法是将一抗(如本发明的单克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。
[0095]为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别流感病毒的试剂。
[0096]此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
[0097]在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中HA蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染流感病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。
[0098]作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测流感病毒的方法，包括以下步骤:
[0099](al)将待测样品包被于固相载体；
[0100](a2)将本发明的结合分子加样于(al)的固相载体，从而使待测样品中的流感病毒与结合分子结合，形成带有“流感病毒-本发明的结合分子” 二元复合物的固相载体；
[0101](a3)将特异性结合本发明的结合分子的检测物加样于(a2)的固相载体，形成带有“流感病毒-本发明的结合分子-检测物”三元复合物的固相载体；所述的检测物上携带一标记物；
[0102](a4)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中流感病毒的存在与否以或存在的量。
[0103]按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的流感病毒含量。
[0104]本发明的主要优点在于:
[0105](I)提供了一种具有全新的结合分子，其是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)抗流感病毒的分子相比，免疫原性大大减少，且亲和性良好。不仅治疗效果好，而且副作用低。
[0106](2)本发明的结合分子能够结合具有天然构象的流感病毒血凝素蛋白(HA)的HA2亚基，能够阻止多种亚型流感病毒侵染易感细胞。
[0107]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0108]1.材料和方法
[0109]以下说明本发明即一株能够中和多种流感病毒广谱中和性全人单克隆抗体制备以及抗体特性分析过程。分为两部分:
[0110](1)单细胞RT-PCR法获得抗体基因以及抗体表达；
[0111](2)抗体特性分析。
[0112]具体过程如下:
[0113]1、外周血单核细胞(PBMC)的获得
[0114]从根据血凝抑制实验筛选的志愿者体内抽取外周血，采用常规Ficoll-Paque密度梯度离心，得到IO7以上个外周血单核细胞(PBMC)。
[0115]2、HA特异性记忆B细胞分选[0116]使用FITC-CD19/APC-1gG/Cy3-HA (FITC-CD 19/APC-1gG 购自 BD，Cy3_HA 制备方法为:由杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统(Invitrogen)表达制备HA蛋白，并用生物素蛋白标记试剂盒(Thermo Scientific)标记后,和Cy3_链霉亲和素(Sigma)偶联)为标志物,经流式细胞仪获得特异性B细胞至96孔RT-PCR板，每孔一个细胞，获得HA特异性记忆B细胞。
[0117]3、抗体基因
[0118]使用RT-PCR和Nested-PCR技术，获得抗体基因(参见NatProtoc.2009; 4 (3): 372-84)。连接 pGEM_T Easy (Promega)载体,进行测序,常规方法验证抗体基因。如文献Kenneth Smith et al.Rapid generation of fully human monoclonalantibodies specific to a vaccinating antige.Nat Protoc.2009; 4 (3): 372 - 384 所述构建载体AbVec-hlgG和AbVec-hlgKappa,载体图谱分别如图9和10,序列分别为genebank号FJ475055和FJ475056所述，其中分别包含编码人IgGl重链和轻链恒定区的碱基序列，编码人IgGl重链和轻链恒定区的氨基酸序列为Genebank号ACK87036和ACK87038所述。然后将重、轻链基因分别连接表达载体AbVec-hlgG(插入位点为AgeI和Sail)和AbVec-hlgKappa(插入位点为 AgeI 和 BsiwI)。
[0119]4、抗体表达
[0120]脂质体法瞬时转染293T细胞，进行全人抗体表达。
[0121]I)在转染前I天将1.0X IO6细胞接种到6孔细胞培养板中；
[0122]2)A 管:500iil Opt1-MEM(Invitrogen) +4 u g IgG+4 u g IgL
[0123]3)B 管:500lil 0pt1-MEM+20 U I Lipofectamine Reagent (Invitrogen)
[0124]4)静置5分钟后,将A管与B管混合,在室温静置20min ；
[0125]5) A、B管混合物加入细胞培养盘中，37°C孵育6h ；
[0126]6) 6h 后，吸除含有 Lipofectamine Reagent 的培养液，每孔加入 2mlFreeStyleTM293Expression Medium(Invitrogen)；
[0127]7) 72h后，收集含全人抗体的细胞上清，4°C，3000rpm, 5min,保存备用。
[0128]5、抗体浓度测定
[0129]ELISA方法测定全人抗体浓度。
[0130]I)包被 Goat Ant1-Human IgG (Fab Specific)Antibody (购自 Sigma)于 ELISA板，10 u g/ml,每孔 100 u 1,4°C过夜；
[0131]2) PBST 洗板，3 次；
[0132]3)封闭:lg/ml BSA，每孔 200ii l，37°C，2h ；
[0133]4) PBST 洗板，3 次；
[0134]5)使用倍比稀释的人IgG(购自Sigma)制作标准曲线,浓度400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、0ng/ml, 100 u I/ 孔；前述制备的全人抗体细胞上清稀释5000倍，每孔IOOu l,37°C,2h ；
[0135]6) PBST 洗板，3 次；
[0136]7)加入 Goat Ant1-Human IgG (Fe specific)-Peroxidase antibody (购自Sigma), 1:10000 稀释，每孔 IOOy l，37°C，lh ；
[0137]8) PBST 洗板，3 次；[0138]9) TMB 底物(购自 Sigma)，每孔 100iil，37°C，15min，避光反应；
[0139]10)加入 2M H2SO4,每孔 50 U I ；
[0140]11)测定0D450，并进行数据处理。
[0141]6、抗原特异性检测
[0142]检测表达的全人抗体是否识别HA蛋白、HAl蛋白、2009甲型HlNl流感病毒疫苗裂解液(2009/Cal)和 2008-2009 季节流感病毒疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))。ELISA进行检测，分别包被HA-His (杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统(Invitrogen)表达)、IOO0C 5分钟热变性HA-His、HAl-Fc (杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统(Invitrogen)表达),2009甲型HlNl流感疫苗裂解液(2009/Cal)(购自华兰生物)和2008-2009季节流感疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))(购自华兰生物)。
[0143]I)分别包被HA-HiS、热变性HA-His、HAl-Fc,2009甲型HlNl流感疫苗裂解液(2009/Cal)和 2008-2009 季节流感疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))于 ELISA板，10 u g/ml,每个样品两个复孔，每孔100 u 1,4 C过夜；
[0144]2) PBST 洗板，3 次；
[0145]3)封闭:1%BSA，每孔 200ii l，37°C，2h ; [0146]4) PBST 洗板，3 次；
[0147]5)根据测定浓度，调整本发明的全人抗体至300y g/ml，每孔100 yl，鼠源单克隆抗体S-95-7 (识别位于HAl上的构象依赖表位，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:C201024)为阳性对照，37°C，2h ;
[0148]6) PBST 洗板，3 次；
[0149]7)Goat Ant1-Human IgG (Fe specific)-Peroxidase antibody,1: 10000稀释，每孔100 iil，加到HA-His、热变性HA-His、2009甲型HlNl流感病毒疫苗裂解液和2008-2009季节流感病毒疫苗裂解液ELISA板；Goat Ant1-Human IgG (Fabspecific) -Peroxidase antibody, 1: 10000 稀释，每孔 100 U I,加到 HAl-Fc ELISA 板,37°C, Ih ；
[0150]8) PBST 洗板，3 次；
[0151]9) TMB 底物(购自 Sigma)，每孔 100 iU，37°C，15min，避光反应；
[0152]10)加入 2M H2SO4,每孔 50 U I ；
[0153]11)测定0D450，并进行数据处理。
[0154]7、抗体中和活性测定
[0155](I)微中和试验
[0156]DMDCK细胞(购自ATCC)铺至96孔板，DMEM+10% (v/v) FBS培液培养，12h后生长至90%，备用。
[0157]2) 96孔板，抗体用DMEM+0.2%BSA 2 X梯度稀释，终体积50 yl/孔。
[0158]3)每孔加入50 ill含100个TCID5tl病毒(预先用DMEM+0.2%BSA稀释至100TCID50/50 u I)。病毒为:A/Sichuan/l/2009 (HlNl)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2)或 A/Guangzhou/333/99(H9N2)。
[0159]4)每块板还包括对照:
[0160]病毒对照(PC，不加抗体)——50 u I DMEM 0.2%BSA+50 U I病毒(病毒种类如4)所列)；
[0161]MDCK 细胞对照(NC)-100 u I DMEM 0.2%BSA ；
[0162]5) 37 °C 5% (v/v) C02，lh，使抗体与病毒充分作用。
[0163]6) MDCK 单层细胞吸去培液，PBS 洗两遍，加 100 u I DMEM+0.2%BSA+2 u g/mlTPCK-trypsin。
[0164]7)将抗体-病毒孵育混合物100 U I全部对应移至MDCK细胞平板中。
[0165]8)37°C，5%C02，20h。
[0166]10)PBS洗一遍。预冷的80%(v/v)丙酮-PBS溶液固定IOmin ；
[0167](2) ELISA
[0168]I)固定好的细胞板PBS+0.05%(v/v) Tween 20 (漂洗液)洗3遍。
[0169]2)用 PBS+1%BSA 0.l%Tween 20 (稀释液)1:10000 稀释 ant1-NP (HRP)抗体，50iil/孔，室温I小时。
[0170]3)漂洗液洗6遍。
[0171]4)新配制的底物 2mg OPD (o-phenylenediamine,邻苯二胺)加入到 4ml 0.05M 朽1檬酸缓冲液(含0.03g/ml过硼酸钠)中，50 iil/孔，室温5min。
[0172]5) 2M H2SO4 终止反应，50 iil/孔。
[0173]6)分光光度计490nm读板。
[0174]7)至少做两次独立实验。
[0175]I1.实施例
[0176]实施例1、HA特异性记忆B细胞
[0177]使用FITC-CD19/APC-1gG/Cy3_HA为特异性标志物，获得了若干个HA特异性B细胞。
[0178]实施例2、抗体基因
[0179]RT-PCR和Nested-PCR法获得抗体重、轻链可变区基因，分子量为400bp左右，3-actin作为内参(343bp)，电泳图谱见图2，图3和图4。将来源于同一个B细胞抗体重轻链基因可变区连接T载体，测序并进行表达载体构建。
[0180]1C4重链可变区基因序列如下(SEQ ID NO:1):
[0181]