专利名称：用于治疗cxcl8介导的肺部炎症的组合物的制作方法用于治疗CXCL8介导的肺部炎症的组合物本发明涉及与相应的野生型IL-8相比具有升高的GAG结合亲和力和进ー步抑制或下调的受体结合活性的经修饰的白介素8(IL-8，CXCL8)用于预防或治疗伴有嗜中性粒細胞浸润的肺部炎症，特別地用于预防或治疗CXCL8介导的肺部炎症的新用途。具体而言， 提供了经修饰的IL-8作为吸入剂的用途。肺炎性疾病就其在人群中的优势及缺乏有效的疗法而言具有特別的关联。具体地，显示为具有升高的嗜中性粒細胞浸润的肺疾病是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease)、fe性纤维化病(cystic fibrosis)、慢性重度哮 P而 (chronic severe asthma)和急性肺损伤(acute lung injur)及其更严重形式，即急性呼吸合征(acute respiratory distress syndrome)。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是ー种进行性的使人衰弱的疾病，预测到2020年它变为全球死亡的第三位原因(Lopez等1998)。已经将香烟烟建立为其形成的最重要的病原学因素，然而，仅15至20%的吸烟者形成C0PD，这提示了遗传组分和其它环境因素在该疾病的发病机制中发挥作用。COPD患者的肺中观察到的炎性应答是复杂的，并且牵涉先天性和获得性免疫应答两者的激活；然而，清楚的是，疾病进展受白细胞迁移、促炎性細胞因子和趋化因子的生成和潜在地破坏性蛋白酶的释放支配(Kim等2008)。特別地，已经在痰和支气管肺泡灌洗(BAL)样品两者中显示了嗜中性粒细胞是 COPD患者的肺中最丰富的炎性细胞(Nocker等1996;Peleman等1999)。CXCL8水平在疾病行进的不同阶段的COPD患者的痰和BAL中是显著升高的(相对于健康人升高10-15 倍)，并且与疾病严重性和嗜中性粒細胞存在相关联(Yamamoto等1997 Janino等2002)， 这将CXCL8鉴定为牵涉嗜中性粒细胞活动(mobilization)的关键趋化因子(Woolhouse 等2002)。此外，升高水平的CXCL8也存在于恶化期间的COPD患者的痰中(Aaron等 2001;Spruit 等 2003)。然而，目前的疗法比具有抗炎活性更像支持性和症状性护理那样起作用。基于世界卫生组织和GOLD的推荐用于管理COPD的药物包括短效和长效β 2激动剂；短效和长效抗胆碱药；甲基黄嘌呤、吸入或系统性糖皮质类固醇(glucocosteroids) (Pauwels 等，2005 ； Lenfant和Khaltaev 2005)。这些疗法对控制急性恶化具有ー些效果，但是用传统的糖皮质类固醇治疗的结果很大程度上是低效的，而且不能减弱COPD患者中的炎症 (Culpitt等1999;Fitzgerald等2007)，这突出显示了需要开发新的抗炎策略(Fabbri等 2004)。以嗜中性粒細胞性浸润为特征的另ー种肺疾病是囊性纤维化病(CF)。几项研究已经证明了 CF患者的BAL和痰中的CXCL-8水平升高和支气管腺中CXCL8的表达升高 (Nakamura等1992;Tabary等1998)。其有力的嗜中性粒细胞化学引诱物特性刺激气道中大量嗜中性粒細胞的流入(Chmiel等200 。細菌性感染进ー步提高CXCL8水平，驱动更多嗜中性粒細胞浸润入肺中，并且产生难以中断的恶性循环，并且导致慢性肺部炎症。用对CXCL8诱导的炎症起作用的处理，诸如PA401对此恶性循环起作用可以导致对CF患者(其目前仅依赖于用支气管扩张药和粘液溶解药或抗生素的支持疗法)的最有效治疗。约十分之一的哮喘患者呈现重度形式的疾病，其经常逐渐需要更高剂量的类固醇来控制症状。与较轻度形式相比，重度哮喘也与疾病和死亡的高得多的风险有关。现在已经在嗜中性粒细胞性浸润与慢性重度哮喘(Little等2002 ； Wenzel等 1997，Jatakanon 等 1999, Ordonez 等 2000，Kamath 等 2005;Fahy 2009)、儿童哮喘(McDougall等2006)、哮喘恶化(Fahy等1995)、皮质类固醇抗性哮喘(Green等2002)、夜间哮喘(Martin等1991)、吸烟者哮喘(Chalmers等2001)和职业性哮喘(Anees等2002)间建立了强烈的联系。现在越来越多地认可，慢性嗜中性粒细胞性重度哮喘呈现明显不同的临床表型，而不是哮喘症状的存在增加，而且与COPD共享特征(ENFUM0SA研究组)。也是在慢性重度哮喘的病例中，上皮细胞衍生的CXCL8是作为卓越的嗜中性粒细胞化学引诱物的最可能的候选物(Lamblin等1998; Ordonez等2000)及用于开发新抗炎疗法的潜在候选物。因此，本发明的目的是提供一种用于预防或治疗以嗜中性粒细胞浸润的肺炎性病理学的方法。发明概述本发明基于如下的发现，即可以使用与相应的野生型IL-8相比具有升高的GAG结合亲和力和抑制或下调的GPCR (G蛋白偶联受体，即CXCRl和CXCI^)活性的经修饰的白介素8(IL-8)来预防和治疗伴有嗜中性粒细胞性浸润的肺部炎症。尤其在COPD及COPD恶化(其中存在IL-8水平升高，并且其与疾病进展和严重性相关联(Yamamoto等1997 Janino等2002))中，靶向牵涉嗜中性粒细胞活动的关键趋化因子的治疗性干预(Woolhouse等2002)应当提供有益的抗炎活性。此外，这些患者的目前治疗依赖于支持性和症状性护理，尽管证明了应用传统的糖皮质类固醇很大程度上是无效的(Culpitt等1999;Fitzgerald等2007)，这突出显示了需要开发新的抗炎策略(Fabbri等2004，de Boer等2007)。虽然已经简要地描述了使用经修饰的IL-8来治疗在肺中缺乏较高水平的嗜中性粒细胞浸润的“正常的”哮喘，但是先前尚未显示或指示所述经修饰的IL-8治疗和预防伴有嗜中性粒细胞浸润的肺部炎症的成功使用。所述经修饰的IL-8的抗哮喘活性可以源自对其它哮喘相关的趋化因子诸如嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)的非特异性或连续替换。抑制的或下调的活性是至少降低或完全缺乏通过GPCR激活的嗜中性粒细胞活化。虽然已经长期建立了 CXCL8介导的肺部炎症或IL-8诱导的嗜中性粒细胞浸润在特定的肺疾病中是显著的，但是尚未报告或提示所述经修饰的IL-8，S卩“基于蛋白质的GAG拮抗剂”会在预防或治疗伴有嗜中性粒细胞性浸润的肺炎性疾病中具有此类功效。因此，本发明的主题是提供与相应的野生型IL-8相比具有升高的GAG结合亲和力和抑制或下调的GPCR活性的经修饰的IL-8，其用于预防或治疗个体中伴有嗜中性粒细胞性浸润的肺炎性疾病。附图简述图1 :PA401对用LPS滴注的小鼠的支气管肺泡灌洗中的总细胞浸润物(inf ltrates)的剂量-响应效果。图2 :PA401对用LPS滴注的小鼠的支气管肺泡灌洗的细胞离心涂片器(cytospin)中的嗜中性粒细胞数目的剂量-响应效果。图3 :PA401对用LPS滴注的小鼠的支气管肺泡灌洗的细胞离心涂片器中的淋巴细胞数目的剂量-响应效果。图4 :PA401对用LPS喷雾的小鼠的支气管肺泡灌洗中的总细胞浸润物的剂量-响应效果。图5 :PA401对用LPS喷雾的小鼠的支气管肺泡灌洗的细胞离心涂片器中的嗜中性粒细胞数目的剂量-响应效果。图6 :PA401 (图6a)和罗氟司特(Rofumilast)(图6b)对暴露于香烟烟4天的小鼠的支气管肺泡灌洗中的总细胞浸润物的剂量-响应效果。图7 :PA401 (图7a)和罗氟司特(图7b)对暴露于香烟烟4天的小鼠的支气管肺泡灌洗中的嗜中性粒细胞浸润物的剂量-响应效果。图8 :PA401 (图8a)和罗氟司特(图8b)对暴露于香烟烟4天的小鼠的支气管肺泡灌洗中的巨噬细胞浸润物的剂量-响应效果。图9 :PA401 (图9a)和罗氟司特(图9b)对暴露于香烟烟4天的小鼠的支气管肺泡灌洗中的上皮细胞浸润物的剂量-响应效果。图10 :PA401(图IOa)和罗氟司特(图IOb)对暴露于香烟烟4天的小鼠的支气管肺泡灌洗中的淋巴细胞浸润物的剂量-响应效果。图11 一天两次、每天和每隔一天施用PA401 (图Ila)后对总细胞浸润物的影响及与罗氟司特(图lib)的比较。图12 在所有PA401 (图12a)处理频率时的嗜中性粒细胞减少及与罗氟司特(图12b)的比较。图13 在所有PA401 (图13a)处理频率时的上皮细胞减少及与罗氟司特(图13b)的比较。图14 在每隔一天施用PA401 (图14a)时以b. i. d.和q. d.施用获得的淋巴细胞的显著减少的丧失及与罗氟司特(图14b)的比较。图15 在每隔一天施用PA401 (图15a)时以b. i. d.和q. d.施用获得的巨噬细胞的显著减少的丧失。与罗氟司特(图15b)的比较。图16 400和40 μ g/kg施用后观察到的PA401 (图16a)对总细胞浸润物的影响。与罗氟司特(图16b)比较。图17 =BAL中的嗜中性粒细胞数目减少(PA401,图17a和罗氟司特，图17b)。图18:BAL中的上皮细胞数目减少(PA401，图18a和罗氟司特，图18b)。图19:BAL中的淋巴细胞数目减少(PA401，图19a和罗氟司特，图19b)。图20:BAL中的巨噬细胞数目减少(PA401，图20a和罗氟司特，图20b)。图21 =LPS气雾剂暴露前1小时(_lh)和后1小时(+Ih)的PA401气管内施用对LPS后8小时收集的支气管肺泡灌洗中的总细胞计数的剂量-响应活性。接着有Durmett氏检验的ANOVA :*p<0. 05 ；**p<0. 01对经媒介物处理的动物。图22 =LPS气雾剂暴露前1小时(_lh)和后1小时(+Ih)的PA401气管内施用对LPS后8小时收集的支气管肺泡灌洗中的嗜中性粒细胞计数的剂量-响应活性。接着有Dunnett氏检验的ANOVA :*p<0. 05 ；**p<0. 01对经媒介物处理的动物。发明详述CXCL8介导的肺部炎症可以导致患者肺中的嗜中性粒细胞浸润。本发明涵盖用于预防或治疗伴有嗜中性粒细胞性浸润的肺部炎症的与相应的野生型IL-8相比具有升高的GAG结合亲和力和进一步抑制或下调的GPCR活性的经修饰的白介素8(IL-8)。如本发明中使用的用于治疗伴有嗜中性粒细胞性浸润的肺部炎症的经修饰的IL-8在GAG (糖胺聚糖)结合区中是经修饰的，导致针对GAG，即IL-8特异性GAG配体的亲和力升高。修饰可以在天然存在的GAG结合区中，或者备选地，可以在所述分子中引入新的GAG结合区，导致针对GAG的亲和力升高。通过针对某个氨基酸，优选地碱性或供电子氨基酸取代至少一个天然存在的氨基酸，和/或取代GAG结合区中的至少一个大体积和/或酸性氨基酸，在所述蛋白质中引入人工的和/或改善的GAG结合位点。通过此手段，可以将总体更具负电性的分子特征引入趋化因子中。主要目的是提高碱性或供电子氨基酸，优选地Arg、Lys, His, Asn和/或Gln与所述位点中的氨基酸的总量相比的相对量，由此优选地，所得的GAG结合位点应当包含至少3个碱性氨基酸，仍优选地至少4，最优选地至少5个氨基酸。这导致与wtIL-8竞争其HSPG共受体的基于趋化因子的GAG拮抗剂。依照一个具体的实施方案，GAG结合位点是修饰为提高GAG结合亲和力的C端alpha HM。术语“大体积的氨基酸”指具有长的或空间干扰的侧链的氨基酸；这些具体的是Trp、IIe、Leu、Wie、Tyr。优选地，趋化因子上的GAG结合位点没有大体积氨基酸以容许GAG配体的最佳诱导契合。有利地，用Arg、Lys, His、Asn和/或Gln取代IL-8中的第17位、第21位、第70位、和/或第71位。最优选地，用Arg、Lys, His, Asn和/或Gln，优选地用Lys取代IL-8的所有四个位置17、21、70和71。如本文中所使用的经修饰的IL-8还包含抑制或下调的受体结合区，具体地GPCR(G蛋白偶联受体)结合。因此，通过依照本发明的蛋白质工程的灭活生成在促进嗜中性粒细胞活化方面降低或不能促进嗜中性粒细胞活化的IL-8分子。对于整个方法，这意味着一方面，GAG结合亲和力比在野生型GAG结合蛋白中高，从而经修饰的蛋白质会代替野生型蛋白质以很大程度结合GAG。另一方面，主要在蛋白质结合GAG时发生的野生型蛋白质的GPCR活性受到抑制或下调，因为经修饰的蛋白质不会实施此特异性活性或者以更小的程度实施此活性。可以通过缺失、插入、和/或取代来修饰受体结合区，例如用丙氨酸、空间和/或静电相似的残基进行。有可能在受体结合区中缺失或插入或取代至少一个氨基酸。在使用的经修饰的IL-8中，所述GPCR结合区位于前10个N端氨基酸内。第一个N端氨基酸牵涉白细胞活化，由此特别地，Glu-4、Leu-5和Arg_6鉴定为对于受体结合和激活是至关重要的。因此，可以将这三个或甚至多至前10个N端氨基酸取代或缺失以抑制或下调受体结合和激活。例如，经修饰的IL-8可以使前6个N端氨基酸被缺失。如上文所提及的，此突变体不会或者以较小的程度结合并活化白细胞和/或促进嗜中性粒细胞活化，从而它特别适合于治疗器官移植排斥。优选地，经修饰的IL-8 选自下组del6F17RE70KN71R、del6F17RE70RN71K、del6E70KN71K、del6F17RE70RN71K、和 del6F17KF21KE70KN71K。优选地，经修饰的IL 8分子的氨基酸序列由下式描述(Xl)n(X2)m KTYSKP(X3)HPK (X4) IKELRVIES GPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR VVEKFLKRAtt5) (X6) S其中Xl是氨基酸序列SAKELR的，其中X2是氨基酸序列CQCI的，其中X3选自下组F、R、K、H、N和/或Q，优选地X3是K，其中X4选自下组F、R、K、H、N和/或Q，优选地X4是K，其中X5选自下组E、R、K、H、N和/或Q，优选地X5是K，其中)(6选自下组R、K、H、N和/或Q，优选地)(6是K，且其中η和/或m可以是0或1。在一个优选的实施方案中，经修饰的IL-8的序列如下SAKELRCQCI KTYSKPFHPK FIKELRVIES GPHCANTEII VKLSDGRELCLDPKENffVQRVVEKFLKRA腿S，其中缺失前6个氨基酸(SAKELR)。优选地，经修饰的IL-8与如WO 05/054285中所披露的经修饰的IL_8相似或相同。可以通过静脉内、肌肉内或皮下路径来施用组合物。还包括其它施用路径(其可以建立相应成分期望的血液水平，诸如系统施用或吸入)。具体地，已经显示了对肺的局部投递，优选地吸入或气管内施用是有利的施用模式。因此，可以将经修饰的IL-8配制为吸入剂，并且可以通过如本领域中已知的吸入系统来施用。可以将经修饰的IL-8配制为液体、气雾剂或粉末。可以与药学可接受载体一起配制包含依照本发明的组合物的药物。“药学可接受的”意指涵盖不干扰活性成分的生物学活性的效率，而且对于接受其施用的宿主无毒的任何载体。例如，对于胃肠外施用，可以将经修饰的IL-8以供注射用的单位剂量形式在媒介物诸如盐水、右旋糖溶液、血清清蛋白和林格(Ringer)氏溶液中配制。除了药学可接受载体外，还可以包含少量的添加剂注入稳定剂、赋形剂、缓冲剂和防腐剂。使用包含经修饰的IL-8的组合物来制备用于预防或治疗任何肺炎性疾病的药物，所述肺炎性疾病以嗜中性粒细胞浸润为特征。更具体地，这些疾病可以是例如慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化病、重度哮喘、支气管炎、细支气管炎、急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。特别地，经修饰的IL-8用于治疗C0PD。作为一个备选的实施方案，明确涵盖使用依照说明书的经修饰的IL-8来预防或治疗嗜中性粒细胞性哮喘或恶化。依照本发明，也可以治疗或预防由LPS吸入诱导的任何肺部炎症，因为LPS是诱导 IL-8 表达的主要因素之一 (Chemokines and chemokine receptors in infectiousdiseases. (Mahalingam S，Karupiah Gj Immunol Cell Biol. 1999Dec;77 (6):469-75)。LPS是革兰氏阴性细菌中的一种壁组分，并且因此在发生革兰氏阴性细菌性感染时存在或者存在于空气污染物和烟草叶中(因此也在香烟烟中)。或者，本发明涵盖一种用于治疗有此需要的受试者中的伴有嗜中性粒细胞性浸润(infltration)的肺部炎症的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的经修饰的IL-8。特别地，通过吸入或者通过气管内施用来施用。慢性阻塞性肺疾病(COPD)特别地，已经在痰和支气管肺泡灌洗(BAL)样品两者中显示了嗜中性粒细胞是COPD患者的肺中最丰富的炎性细胞(Nocker等1996;Peleman等1999)。认为香烟烟造成循环的嗜中性粒细胞升高，这可能是由于自骨髓的活动升高(Cowburn等2008)，及其隔绝于肺毛细管(若它们离开肺循环)所致。此特征对于肺循环是独特的，因为在系统循环中，嗜中性粒细胞以毛细血管后微静脉水平离开。然后，嗜中性粒细胞被移动至支气管壁和肺实质(Peleman等1999;Kim等2008)。认为嗜中性粒细胞活化及随后的活性氧类别(reactive oxygen species)和弹性蛋白酶的释放是形成肺损伤和慢性功能障碍的主要原因。实际上，已经长期将血液嗜中性粒细胞与就强压呼气量(forced expiratory volume) (FEV ；Sparrow等1984)而言测量的肺功能的下降率联系起来。CXCL8水平在疾病行进的不同阶段的COPD患者的痰和BAL中是显著升高的(相对于健康人升高10-15倍)，并且与疾病严重性和嗜中性粒细胞存在相关联(Yamamoto等1997 ； Tanino等200 ，这将CXCL8鉴定为牵涉嗜中性粒细胞活动的关键趋化因子(Woolhouse等2002)。此外，升高水平的CXCL8也存在于恶化期间的COPD患者的痰中(Aaron 等 2001；Spruit 等 2003)。囊性纤维化病囊性纤维化病(CF)是一种外分泌腺中的重度单基因离子转运病症，在CF跨膜电导调节物(CFTR)基因中具有不同突变，导致受损的上皮氯化物分泌(Riordan1989;Ratjen 2009)。粘液分泌物在外分泌腺导管中的脱水和堵塞有多器官临床表现的素因，特别是在胃肠、肝胆、生殖和呼吸道中。慢性细菌性感染和肺部炎症是CF患者中发病率和死亡率的主要原因(Ratjen2006)。随着年龄增加，CF患者形成气道阻塞，而且许多这些患者还患有气道高响应性(hyper-responsiveness)禾口哮喘样症状。许多炎性细胞因子是在CF患者中的气道中生成的(Sagel等2002)。几项研究已经证明了 CF患者的BAL和痰中的CXCL-8水平升高和支气管腺中CXCL8的表达升高(Nakamura等1992;Tabary等1998)。其有力的嗜中性粒细胞化学引诱物特性刺激气道中大量嗜中性粒细胞的流入(Chmiel等2002)。此外，与那些非CF儿童相比，来自CF儿童的嗜中性粒细胞在体外展现出更高的对CXCL8的迁移响应性，这提示了持续的升高CXCL8水平可以“引发”CF嗜中性粒细胞(Brennan等2001)。在关于CF嗜中性粒细胞和携带CFTR突变的支气管上皮细胞的体外共培养的最近的研究中，提示了在CF患者中，气道上皮上粘着的并且与升高的CXCL8水平有关的大量非凋亡嗜中性粒细胞可以促成气道中持续的且放大的炎性应答(Tabary等2006)。实际上，Na-Cl不平衡似乎是CXCL8生成增加及随后的嗜中性粒细胞浸润的首要原因。细菌性感染进一步提高CXCL8水平、驱动更多嗜中性粒细胞浸润入肺中，并且产生难8以中断的恶性循环，并且导致慢性肺部炎症。对此恶性循环起作用可以导致对CF患者(其目前仅依赖于用支持疗法或抗生素)的最有效治疗。重度哮喘长期认为嗜曙红细胞炎症是哮喘最独特的病理学标志(Bousquet 1990)。然而，嗜曙红细胞炎症存在于仅50%哮喘患者的气道中(Douwes等2002)，并且经常在哮喘恶化中观察不到。现在已经在嗜中性粒细胞性浸润与慢性重度哮喘(Little等2002 ； Wenzel等 1997，Jatakanon 等 1999, Ordonez 等 2000，Kamath 等 2005;Fahy 2009)、儿童哮喘(McDougall等2006)、哮喘恶化(Fahy等1995)、皮质类固醇抗性哮喘(Green等2002)、夜间哮喘(Martin等1991)、吸烟者哮喘(Chalmers等2001)和职业性哮喘(Anees等2002)间建立了强烈的联系。在急性哮喘发作期间，嗜曙红细胞和嗜中性粒细胞共存(Wenzel等1999)，但是提示了嗜中性粒细胞随时间变为占优势的细胞群。其在气道中的存在与疾病严重性和进展成比例(Wenzel等1997)，并且与气流阻塞和肺功能降低有关(Shaw等2007)。嗜中性粒细胞也是非常严重的且经常是致命形式的以突然发作为特征的哮喘(突然发作哮喘；Sur等1993)中观察到的主要白细胞群体。急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARSD)急性肺损伤(ALI)及其更严重形式急性呼吸窘迫综合征(ARDS)代表相同疾病的两个不同阶段，其特征在于急性肺部炎症，伴有增强的血管渗透性和严重性升高的肺水肿形成(Bernard等1994)。病理学导致非常高的死亡率(约40%)，尽管有改善的重点护理干预，在过去十年中没有降低的趋势(Puha等2009)。几个小组已经证明了嗜中性粒细胞参与ALI和ARDS (Ware等2000 ； Abraham2003)，而且已经报告了 BAL中嗜中性粒细胞的水平升高及其与升高的CXCL8水平的关联(Aggarwal等2000)。此外，已经将BAL中CXCL8水平升高与有风险患者上的ARDS形成联系起来(Donnelly 等 1993 ； Reid 等 1995)。在肺中，糖胺聚糖(GAG)是间质的非纤维区室的主要组分，并且位于上皮下组织和支气管壁，以及气道分泌物中。其存在对于调节水合和水稳态，维持组织结构，及调控炎性应答是至关重要的(例如见Souza-Fernandes等2006)。与其它人病理学相比，可获得的文献不多，其支持GAG参与介导肺疾病中的趋化因子作用。正常的肺中存在所有四类糖胺聚糖，包括肝素/磷酸乙酰肝素、软骨碱/硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、和乙酰透明质酸。已经报告了磷酸乙酰肝素为主要形式(约40%)，接着是软骨碱/硫酸皮肤素(约31%)及较少程度的乙酰透明质酸(约14%)和硫酸角蛋白(Frevert 等 2003)。以上描述参照以下实施例会得到更全面的了解。然而，此类实施例仅代表实施本发明的一个或多个实施方案的方法，而不应解读为限制本发明的范围。实施例认为在大多数(如果不是所有)肺病理学中，观察到肺血管渗透性和基质的变化，PA401 (del6F17KF21KE70KN71K IL-8突变体)的系统性施用应当适合于在肺小静脉和上皮水平两者上达到足够的PA401水平。实施例1 PA401对小鼠中LPS诱导的急性肺部炎症模型的影响。多种刺激物诱导嗜中性粒细胞对肺的迁移。在最常使用的且表征最好的炎性诱导物中的是革兰氏阴性细菌的内毒素(脂多糖LPS)。鼻内滴注或喷雾的LPS在肺血管系统、间质和BAL中诱导剂量和时间依赖性嗜中性粒细胞浸润(Reutershan等2005)，其中峰水平在考验(challenge)后4_8小时间达到，并且在小鼠中显著保持在基线之上直至M小时。施用的LPS剂量随LPS血清型、应用方法和所使用的小鼠系而变化，其中对低至0. 1 μ g/小时和多至800 μ g/小鼠的LPS剂量报告了显著的BAL中性白细胞增多症(neutrophilia)。LPS吸入能够在物种间诱导肺嗜中性粒细胞浸润(例如，小鼠和大鼠，Chapman等2007;豚鼠；Wu 等 2002;兔，Smith 等 2008 ；绵羊，Waerhaug 等 2009 ；马，van den Hoven 等2006;犬，Koshika等2001)。认为健康志愿者中吸入的1至100 μ g LPS是急性肺部炎症(Maris等2005，Kitz等2008)及慢性阻塞性肺疾病恶化(Kharitonov等，2007)的稳健的且可靠的模型。为了评估PA401在急性肺中性白细胞增多模型中作为抗炎剂的潜力，实施剂量-响应研究，其中在用LPS (0. 3 μ g/小鼠，血清型铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))鼻内滴注的C57BL/6J雌性小鼠中以4、40、200和400 μ g/Kg的剂量皮下施用PA401。使用假滴注的(盐水)和经地塞米松(Dexamethasone) 3mg/kg s. c.(在LPS滴注前t=-lh施用)处理的动物作为对照。LPS滴注后4小时实施支气管肺泡灌洗(BAL)，并测量BAL样品上的总细胞计数及BAL细胞离心涂片器上的差别细胞计数。PA401诱导肺中浸润的细胞总数的剂量依赖性降低，如在BAL流体中评估的(图1)。该效果是由于嗜中性粒细胞(图2)和淋巴细胞(图3)的数目显著减少所致，其中对于低至4 μ g/kg的PA401剂量，效果显著。令人惊讶地，用200和400 μ g/kg剂量的PA401获得的对BAL中的细胞浸润的抑制与用高剂量的地塞米松(3mg/kg)处理获得的相当。在Argenta Discovery Ltd, UK 进行此研究。实施例2使用略有不同的模型来实施第二项研究，所述略有不同的模型暗示不同小鼠系和性另Ij (雄性Balb/c代替C57BL/6)、不同LPS菌株和血清型(肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)替代大肠杆菌)和不同LPS施用(气雾剂-在30分钟里的3. 5mg/7mL-代替鼻内)。离LPS暴露的t=-5和t=+3h时通过s. c.或i. v.路径来施用4、40和400 μ g/kg的PA401剂量。在t= !(即与先前的研究相比更晚的时间点)评估BAL总细胞技术和差别细胞技术。使用经盐水喷雾的小鼠和接受地塞米松(20 μ g/20 μ 1/小鼠，在t=_lh)的气管内施用的小鼠作为对照。也在此情况中，PA401诱导BAL中的总细胞数目的高度显著减少(图4)，这是由于嗜中性粒细胞计数的减少所致(图5)。PA401的活性在通过静脉内比通过皮下路径施用时更显著，达到地塞米松的气管内施用的相同抑制效果。在Pneumolabs Ltd，M实施研究。这些研究表明在与人ALI/ARDS和COPD恶化类似的2种急性肺嗜中性粒细胞性炎性动物模型中通过皮下或静脉内途径施用的PA401的强烈活性。获得的效果不依赖于动物的性别或遗传背景；LPS血清型及在皮内滴注和气雾剂暴露两者后。实施例3在香烟烟诱导的肺部炎症的急性模型中的PA401效果。小鼠对香烟烟的急性暴露导致肺应答，其至少部分模拟COPD患者中观察到的肺部炎症。不同小鼠系在急性香烟烟暴露后呈现不同程度的肺部炎症(Guerrassimov等2004，Vlahos等2006)。小鼠中应答的此遗传变化性表现为完全代表人吸烟者中对形成COPD的可变易感性，并且因此认为此模型是与人病理学建模最相关的。通过在4天期里暴露于4至6根香烟的香烟烟在C57BL/6J雌性小鼠(易感系)中诱导肺部炎症。在最后一次香烟烟暴露后M小时评估离烟暴露t=+30分钟和t=+6小时时施用的4、40和400 μ g/kg剂量的皮下PA401处理对支气管肺泡灌洗上的细胞浸润物的剂量响应活性。空气暴露的、和经罗氟司特(5mg/kg 口服)处理的动物充当对照。也在COPD的此动物模型中，PA401剂量依赖性抑制香烟烟诱导的BAL中回收的总细胞数目增加。在40和400 μ g/kg时观察到对总细胞浸润物的高度显著影响。(图6)。在使用的最高剂量时，PA401显著减少BAL中的嗜中性粒细胞(图7)、巨噬细胞(图8)、上皮细胞(图9)及淋巴细胞(Fig. 10)数目。也对研究中使用的其它两个剂量观察到对大多数这些细胞亚型的显著影响。PA401400yg/kg的抑制效果与用罗氟司特5mg/kg获得的相当。此研究在 Argenta Discovery Ltd, UK 实施。PA401此研究表明PA401对通过4天重复暴露于香烟烟诱导的混合细胞浸润的活性，及预测COPD患者中的抗炎活性的动物模型。实施例4:在香烟烟诱导的肺部炎症的亚慢性模型中的PA401效果。在此研究中，通过在11天期里暴露于4至6根香烟的香烟烟在C57BL/6J雌性小鼠中诱导肺部炎症。在最后一次香烟烟暴露后M小时评估离烟暴露t=+30分钟和t=+6小时(一天两次b. i. d. )、+3h时一天一次(q. d)和+3h时每隔一天一次(q. ο. d)施用的最佳剂量400 μ g/kg(基于实施例3中的研究)的皮下PA401处理对支气管肺泡灌洗上的细胞浸润物的剂量频率活性。空气暴露的、和经罗氟司特(5mg/kg 口服)处理的动物充当对照。在一天两次、每天和每隔一天施用后观察到对总细胞浸润物的显著影响(图11)。在使用的所有处理频率，PA401显著减少BAL中的嗜中性粒细胞(图12)和上皮细胞(图13)数目，而在每隔一天施用PA401时丧失用b. i. d.和q. d.施用获得的淋巴细胞(图14)和巨噬细胞(图15)的显著减少。一天两次和一次施用的PA401的抑制效果与用罗氟司特5mg/kg获得的相当。此研究在Argenta Discovery Ltd, M实施。PA401此研究表明一天两次和一天一次皮下施用400μ g/g剂量PA401对通过11天重复暴露于香烟烟诱导的混合细胞浸润具有相当的活性。
实施例5:在香烟烟诱导的肺部炎症的亚慢性模型中的PA401效果。在此研究中，通过在11天期里暴露于4至6根香烟的香烟烟在C57BL/6J雌性小鼠中诱导肺部炎症。比较皮下的每天400 μ g/kg剂量的PA401与皮下每天40 μ g/kg剂量。在t+!3h时实施处理，并在最后一次香烟烟暴露后M小时评估对支气管肺泡灌洗上的细胞浸润物的影响。空气暴露的、经罗氟司特(5mg/kg 口服)处理的动物及用CXCR2拮抗剂SCH527123(10mg/kg 一天两次口服-总共每日剂量20mg/kg)处理的动物充当对照。在400和40 μ g/g施用后观察到PA401对总细胞浸润物的显著影响(图16)。这是由于BAL中的嗜中性粒细胞(图17)、上皮细胞(图18)、淋巴细胞(图19)和巨噬细胞(图20)数目的显著减少所致。40(^8/1^剂量施用的？4401的抑制效果与用罗氟司特5mg/kg和CXCR2拮抗剂SCH52712320mg(10mg/kg —天两次)获得的效果相当。此研究在ArgentaDiscovery Ltd, UK 实施。PA401此研究表明以剂量400 μ g/kg和40 μ g/kg皮下一天一次施用的PA401对通过11天重复暴露于香烟烟诱导的混合细胞浸润的活性。实施例6:在对肺局部投递后肺部炎症中的PA401效果。实施实验来证实在LPS诱导的肺部炎症的动物模型中对肺局部投递后的PA401活性。在此实验中，通过在雄性Balb/c小鼠中以气雾剂投递LPS (肠沙门氏菌，在30分钟里3. 5mg/7mL)来诱导肺部炎症。使用MicroSprayer (FJM-250注射器；PennCentury)(即一种容许直接对肺投递一股气雾剂(质量中值直径16-22 μ m)的装置)来气管内(i.t.)施用PA401。LPS暴露前1小时，或LPS暴露结束后1小时以100、40、10和4 μ g/kg的剂量实施PA401i.t.施用。LPS暴露后8小时实施支气管肺泡灌洗(BAL)，并测量总细胞和嗜中性粒细胞数目。使用地塞米松20 μ g/20 μ 1小鼠i.t.作为参照化合物。PA401诱导BAL中总细胞的显著剂量依赖性减少(图21)，这主要是由于嗜中性粒细胞数目减少所致(图22)。与预防性处理(-Ih)相比，治疗性处理(t=+lh)导致约10%改善的活性，其中剂量100、40和10 μ g/kg有显著活性。图21显示了 LPS气雾剂暴露前1小时(_lh)和后1小时(+Ih)的PA401气管内施用对LPS后8小时收集的支气管肺泡灌洗中的总细胞计数的剂量-响应活性。接着有Dunnett氏检验的ANOVA :*p<0. 05 ；**p<0. 01对经媒介物处理的动物。图22显示了 LPS气雾剂暴露前1小时(_lh)和后1小时(+Ih)的PA401气管内施用对LPS后8小时收集的支气管肺泡灌洗中的嗜中性粒细胞计数的剂量-响应活性。接着有Dunnett氏检验的ANOVA :*p<0. 05 ；**p<0. 01对经媒介物处理的动物。这些数据表明对肺的局部投递后的PA401活性，并且打开使用此施用路径(其通常具有良好的患者顺从性)作为慢性肺适应症的静脉内或皮下施用的备选的可能性。参考文献Aaron SD, Angel JB,Lunau M,et al.Granulocyte inflammatory markers andairway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary
12disease. Am J Respir Crit Care Med 2001;163:349-55.Abraham Ε. Neutrophils and acute lung injury, Crit Cre Med2003;Suppl:S195-S199.Aggarwal A，baker CSj Evans TW et al. G-Csf and Il_8but notGM-CSFcorrelate with disease severity of pulmonary neutrophilia in acuterespiratorydistress syndrome. Eur Resp J 2000;15:895-901.Anees W, Huggins V，Pavord ID,et al. Occupational asthma due to lowmole—cular weight agents: eosinophilic and non-eosinophilie variants. Thorax2002;57:231 - 6.Bernard GR，Artigas A，Brigham KL et al. The American-European ConsensusConference on ARDS.Definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trialcoordination. Amj Respir Crit Care Med 1994;149:818-824. Brennan S，Cooper Dj SlyPD. Directed neutrophil migration to IL_8 is increased in cystic fibrosis:astudy of the effect of erythromycin. Thorax 2001；56:62-64.Bousquet Jj Chanez P，Lacoste JY, et al. Eosinophilic inflammation inasthma. N Engl J Med 1990;323:1033-9.Chalmers GW,Macleod KJj Thomson L，et al. Smoking and airway inflammationin patients with mild asthma. Chest 2001；120:1917-22.Chapman RW, Minnicozzi M，Celly C S，et al. A novel, orally activeCXCR1/2 receptor antagonist, Sch527123，inhibits neutrophil recruitment, mucusproduction,and goblet cell hyperplasia in animal models of pulmonaryinflammation. J Pharmacol Exp Ther 2007;22 (2):486-93.Chmiel JFjBerger M，Konstan M W.The role of inflammation in thepatho-physiology of CF lung disease. Clin Rev Allergy Immunol 2002；23(1):5-27.Cowburn SC，Condliffe AM, Farhai N et al. Advances in neutrophil biology.Clinical Implications. Chest 2008;134:606-612.Culpitt SV, Maziak W, Luokidis S et al. Effects of high dose inhaledsteroids on cells, cytokines,and proteases in induced sputum in chronicobstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1999;160:1635-1639.De Boer WIj Yao H，Rahman I. Future therapeutic treatment of COPD: strugglebetween antioxidants and cytokines. I J COPD 2007;2 (3):205-228.Donnelly SCj Strieter RMj Kunkel SL et al. Interleukine-8anddevelopment of adult distress syndrome in at-risk patients groups. Lancet1993;341:643-647.Douwes J，Gibson P，Pekkanen J，et al. Non-eosinophilic asthma:importanceand possible mechanisms. Thorax 2002;57:643 - 648Fabbri L，Pauwels RA，Hurds SS. Global strategy for thediagnosis，management and prevention of chronic obstructive pulmonarydisease:G0LD executive summary updated 2003. J COPD 2004;1:105-141.
Fahy JV, Kim KW, Liu J，et al. Prominent neutrophilic inflammationin sputum from subjects with asthma exacerbation. J Allergy Clin Immunol1995;95:843-52.Fahy JV.Eosinophilic and neutrophilic inflammation in asthma. Insightfrom Clinical studies. Proc Am Thorac Soc 2009;6:256-259.Fitzgerald MFj Fox JC. Emerging trends in the therapy of COPD:novelanti — inflammatory agents in clinical development. Drug Discov Today2007;12(11/12):479-485.Frevert CW, Kinsella MG, Vathanaprida C et al. Binding of interleikin-8to heparin and chondroitin sulfate in lung tissue. Am J Respir Cell Mol Biol2003;28:464-472.Green RH，Brightling CEj Woltmann G，et al. Analysis of induced sputum inadults with asthma:identification of subgroup with isolated sputum neutrophiliaand poor response to inhaled corticosteroids.Thorax 2002；57:875-9.Guerassimov A，Hoshino Y，Takubo Y et al. The development of emphysemain cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am J Respir Crit Care Med2004 ；170.974-980.Kamath AV, Pavord ID，Ruparelia PR et al. Is the neutrophil the keyeffector cell in severe asthma ？ Thorax 2005 ；60 :529-530.Kharitonov SA, SjObring U. Lypopolysaccharide challenge in humans as amodel for chronic obstructive lung disease exacerbations. Contrib Microbiol2007 ；14 :83-100.Kim V，Rogers TJ, Criner Gj. New concepts in the pathology of ChronicObstructive Pulmonary Disese. Proc Am Thorac Soc 2008 ；5 :478-485.Kitz R，Rose MA,Placzek K et al. LPS inhalation challenge :a new tool tocharacterize the inflammatory response in humans. Med Microbiol Immunol 2008 ；197 :13-19.Koshika T，Ishizaka A，Nagatomi I et al. Pretreatment with FK506improvessurvival rate and gas exchange in canine model of acute lung injury.AmJ Respir Crit Care Med. 2001 ；163(1) :79-84.Jatakanon A，Uasuf C，Maziak W, et al. Neutrophilic inflammation inseverepersistent asthma. Am J Respir Crit Care Med 1999 ；160 :1532-9.Lamblin C，Gosset P，Tillie-Leblond I et al. Bronchial neutrophilia inpatients with non infectious status asthmaticus. Am J Respir Crit Care Med 1998 ；157 394_402.Lefant C,Khaltaev N. Workshop report :Global strategy for the diagnosis，management and prevention of COPD. URL http://goldcopd. org/Guide line item, aspLittle SAiMacleod KJiChalmers GW,et al. Association of forced expiratory
14volume with disease duration and sputum neutrophils in chronic asthma. Am J Med2002 ；112 :446-452.Lopez ADiMurray CC. The global burden of disease，1990-220· Nat Med 1998 ；4 :1241-1243.McDougall CM，Helmes PJ. Neutrophil airway inflammation in childhoodasthma. Thorax 2006 ；61 (9) :739-741.Mahadeva R， Shapiro SD.Chronic obstructive pulmonary disease-3 experimental animal models of pulmonary emphysema. Thorax 2002 ；57 :908-914.Maris NAj de VOS AFj Dessing MC et al.Antiinflammatory effects ofsalmeterol after inhalation of lipopolysaccharide by healthy volunteers. Am JRespir Crit Care Med 2005;172 (7):878—884.Martin RJj Cicutto LC，Smith HRj et al. Airways inflammation in nocturnalasthma. Am Rev Respir Dis 1991;143:351 - 357.Nakamura H，Yoshimura K，McElvaney NG, et al. Neutrophil elastase inrespiratory epithelial lining fluid of individuals with cystic fibrosis inducesinterleukin-8gene expression in a human bronchial epithelial cell line. J ClinInves. 1992;89:1478 - 1484Nocker REj Schoonbrood DFj van de Graaf EAj et al. Interleukin-8 in airwayinflammation in patients with asthma and chronic ob structive pulmonarydisease. Int Arch Allergy Immunol 1996;109:183-191Ordonez CLjShaughnessy TEjMatthay MAjet al. Increased neutrophilnumbers and IL-81evels in airway secretions in acute severe asthma:clinical andbiological significance. Am J Respir Crit Care Med 2000；161:1185-1190.Pauwels RAjBuist As，Calverley PMjet al. Global strategy for thediagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Pulmonary Disease (GOLD)Workshop summary. Am J Respir Crit Care Med. 2005；5:1256-1276.Peleman RAj Rytila PH，Kips JC et al. The cellular composition of inducedsputum in chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 1999;13:839-843.Puha J，Badia JRjAdhikari et al. Has mortality from acute respiratorydistress syndrome decreased over time :A systematic review. Am J Respir CritCare Med 2009;179 (3):220-227.Ratjen FA. Diagnosing and managing infection in CF. Paediatr Respir rev2006;7(suppll):S151_S153.Ratjen FA. Cystic fibrosis:pathogenesis and future treatmentstrategies. Respir Care 2009;54 (5):595-602.Reid PTj Donnelly Sc，Haslett C. Inflammatory predictors for thedevelopment of adult respiratory distress syndrome. Thorax 1995；50:10023-10026.Reutershan J，Basit A，Galkina EV et al.Sequential recruitment ofneutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS一inducedacute lung injury. Am J Physiol Cell Mol Physiol Lung Cell Mol Physiol2005;289 (5):L807-L815.Riordan JRj Rommens JMj Kerem B，et al. Identification of thecystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA.Science.1989;245:1066 - 1073.Sagel SDjAccurso FJ. Monitoring inflammation in CF. Cytokines. Clin RevAllergy Immunol. 2002;23:41-57.Shaw DEj Berry MAjHargadon B et al. Association between neutrophilicairway inflammation and airflow limitation in adults with asthma. Chest2007;132:1871-1875.Smith LSj Kajikawa 0，Elson G et al. effect of Toll-like receptor 4blockade on pulmonary inflammation caused by mechanical ventilation andbacterial endotoxin. Exp Lung Res 2008；34:225-245.Souza-Fernandes AB，Pelosi PjRocco PRM. Bench-to-bedside review:the roleof glycosaminoglycans in respiratory disease. Crit care 2006；10 (6):237-252.Sparrow D，Glynn RJj Cohen M et al.The relationship of the peripheralleukocyte count and cigarette smiking to pulmonary function among adult men.Chest 1984. 86:383-386.Spruit MAj Gosselink Rj Troosters T，et al. Muscle force during an acuteexacerbation in hospitalized patients with COPD and its relationship withCXCL8and IGF-I. Thorax 2003;58:752-756.Sur S,Crotty TB，Kephart GMj et al. Sudden-onset fatal asthma:a distinctentity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airwaysubmucosa Am Rev Respir Dis 1993;148:713-719.Tabary O, Zahm JMj Hinnrasky Jj et al. Selective up—regulation of chemokineIL-8expression in cystic fibrosis bronchial gland cells in vivo and in vitro.Am J Pathol 1998; 153:921 - 930.Tabary O, Corvol H, Boncoeur E et al. Adherence of airway neuthrophils andinflammatory response are increased in Cf airway epithelial eel1-neutrophi1interactions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006;290 (3):L588-596.Tanino Mj Betsuyaku Tj Takeyabu K，et al. Increased levels of interleukin-8in BAL fluid from smokers susceptible to pulmonary emphysema. Thorax2002;57:405 - 411.Van den Hoven R，Duvigneau JCjHertl RT et al. Clenbuterol affects theexpression of messenger RNA for interleukin 10 in peripheral leukocytes fromhorses challenged intrabronchially with lipopoIysaccharides.Vet Res Commun2006;30 (8):921-928.Vlahos R，Bozinovski S，Jones JE et al. Differential protease, innateimmunity, and NK~kB induction profiles during lung inflammation induced bysubchronic cigarette smoke exposure in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol2006;290:L931-L945.Wenzel SEj Schwartz LBj Langmack ELj et al. Evidence that severeasthma can be divided pathologically into two inflammatory subtypes withdistinct physiologic and clinical characteristics. Am J Respir Crit Care Med1999; 160:1001 - 8.Ware LBj Matthay MA. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med2000;342:1334-1349.Waerhaug K, Kuzkov W, Kulin VN et al. Inhaled aerosolized recombinanthuman protein C ameliorates endotoxin-induced lung injury in anesthetizedsheep. Crit Care 2009;13 (2)R51.Wenzel SEj Szefler SJ，Leung DYMj et al.Bronchoscopic evaluation of severeasthma:persistent inflammation associated with high dose glucocorticoids. Am JRespir Crit Care Med 1997;156:737473.Woolhouse IS, Bayley DLjStockley RA. Sputum chemotactic activity inchronic obstructive pulmonary disease. Effects of al-antitrypsin deficiency andthe role of leukotriene B4 and interleukine 8. Thorax 2002;57:709-714.Wu Y，Singer M，Thouron F et al. Effect of surfactant on pulmonaryexpression of type IIA PLA (2)in an animal model of acute lung injury. Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol 2002;282 (4):L743-750.Yamamoto C，Yoneda T，YoshikawaMj et al. Airway inflammation inCOPDassessed by sputum levels ofinterleukin-8. Chest 1997;112:505 - 510.The ENFUMOSA study group.The ENFUMOSA cross-sectional Europeanmulticentre study of the clinical phenotype of severe asthma. Eur Respir J2003;22-470-477.


本发明提供了用于预防或治疗伴有嗜中性粒细胞性浸润的肺部炎症，例如用于预防或治疗慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化病、重度哮喘、支气管炎、细支气管炎、急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的包含与相应的野生型IL-8相比具有升高的GAG结合亲和力和进一步抑制或下调的GPCR活性的经修饰的白介素8(IL-8)的组合物。