专利名称：纳米粒子稳定化的脂质体的触发活性物释放的制作方法使用纳米粒子差异地递送治疗剂至作用部位(也称为靶向性药物递送)代表了纳米医学研究的核心目标，也是纳米医学研究的关键挑战。用于实现这个目标的常用途径是使用特异性结合至被靶标细胞过表达的受体的靶向配体对纳米粒子的表面进行官能化。已证实多种分子可结合至靶标细胞，包括抗体、抗体片段、适体、肽、小分子等。虽然已在使用配体进行活性细胞靶向方面取得进展，但是这些产品均未被批准上市用于相关治疗。脂质体是具有由两亲性脂质分子组成的双层膜结构的球形脂质囊泡，并且已被广泛研究了数十年。有几种脂质体制剂已被批准上市用于治疗目的，例如两性霉素B脂质体(AmBisome) (NeXstarPharmaceuticals, San Dimas, USA)，其是 FDA 批准的两性霉素 B 的脂质体制剂，已在临床上被广泛地用于治疗中性粒细胞減少、内脏利什曼病和甲基丙ニ酸血症患者的念珠菌属(Candida spp·)、曲霉菌属(Aspergillus spp.)、铼刀菌属(Fusariumspp.)和其它真菌感染。尽管脂质体作为递送媒介物(vehicle)具有这些有利特征，但是脂质体的应用通常受限于它们的不稳定性，因为脂质体间存在不可控制的融合，导致短的储存寿命、不希望的有效载荷损失，以及意料不到的混合。用于使脂质体稳定化的广泛使用的途径是在脂质体表面上涂覆诸如聚こニ醇(PEG)的“隐形”材料。PEG化脂质体不仅可以阻止脂质体彼此之间融合，而且可以通过抑制血浆蛋白吸附到脂质体表面上来增强脂质体在体内的循环时间。因此，它们已被广泛地用于全身药物递送。然而，PEG化脂质体很少用于局部药物递送，尤其很少用于治疗细菌感染。这主要是因为PEG化涂层不仅稳定化脂质体以使其不融合，而且阻止它们与细菌膜融合或者阻止诸如毒素的成孔蛋白进入脂质体来释放药物或其它活性物有效载荷。因此，希望开发这样的新脂质体，其在置于作用部位之前(包括制造和储存期)经稳定化而不能彼此之间融合，而一旦被施加到靶标真皮部位时，其融合活性就可以立即被激活。也希望开发这样的脂质体，其经过稳定化而不能与合成或生物膜融合，但是一旦被施加到靶标皮肤部位时，其就可让成孔蛋白进入用于控制活性物释放。发明概述本教导包括刺激响应性纳米粒子稳定化的脂质体的触发药物释放。在一个实施方案中，提供了脂质体，其包括界定脂质体的内球面和外表面的脂质双层、利用刺激敏感性键连接至脂质分子的多个生物相容性纳米粒子，并且进一歩包含在内球面内的活性物(cargo)，其中所述活性物在触发刺激敏感性键时释放。在另ー个实施方案中，提供了脂质体，其包括界定脂质体的内球面和外表面的脂质双层、多个生物相容性纳米粒子，所述生物 相容性纳米粒子经由静电相互作用与脂质分子接触，并且进一歩包含在内球面内的活性物，其中所述活性物在触发脂质体孔形成时释放。在根据上述实施方案的各个方面，生物相容性纳米粒子可以包括金納米粒子、银纳米粒子、合成纳米粒子。在某些方面，生物相容性纳米粒子的表面包含阴离子官能团。在某些方面，生物相容性纳米粒子的表面包含阳离子官能团。具体而言，生物相容性纳米粒子的表面可以包含羧酸根和壳聚糖。在另ー些其它方面，生物相容性纳米粒子的直径为约Inm至约20nm。在各个方面，脂质体可以包含氢化L-α -磷脂酰胆碱和1，2_ ニ-(9Ζ-十八烯酰基)-3-三甲基铵基丙烷。在另ー些其它方面，脂质体包含在脂质体膜中的50%的胆固醇和在溶液中的lOOmg/mLPEG。在其它方面，活性物选自由抗生素、抗微生物剂、生长因子、化疗剂及其组合组成的组。具体而言，活性物包括月桂酸、过氧化苯甲酰、万古霉素(vancomycin)及其组合。在某些方面，脂质体的直径为约IOnm至约300nm。在其它方面，生物相容性纳米粒子占脂质体表面的约5%至约25%。在又一方面，触发器可以包括真皮pH、天然存在或合成的毒素成孔活性，以及光的施加(light administration)。在各个方面,刺激敏感性键是PH-敏感性键。在另ー些其它方面，触发器可以是成孔毒素。在另ー个实施方案中，还提供了包含上述脂质体的药剂递送系统。在各个方面，该脂质体可以在药学上可接受的媒介物中递送。在另ー个实施方案中，提供了选择性地递送活性物至靶标真皮部位的方法，其包括将上述脂质体施用至靶标真皮部位以及触发活性物释放。在又一个实施方案中，提供了用于治疗真皮疾病或病状的方法，其包括将治疗有效量的上述脂质体施用至需要其的受试者的靶标真皮部位以及触发活性物释放。在又一个实施方案中，提供了用于治疗真皮疾病或病状的方法，该方法包括经由上述药剂递送系统将治疗有效量的上述脂质体施用至需要其的受试者。在又一方面，适合于这些方法的病状可以包括MRSA感染、金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染,和痤疮丙酸杆菌(P. acnes)感染。在又一个实施方案中，提供了在触发释放之前稳定地储存药剂的方法，其包括将药剂封闭在上述脂质体中。參考下面的描述、实施例和所附权利要求，本教导的这些和其它特征、方面和优点将变得更容易理解。附图简述本领域技术人员将会理解下面描述的附图仅为了说明目的。这些附图并不g在以任何方式限制本教导的范围。图I.羧基修饰的金纳米粒子(AuC)-稳定化的脂质体以及它在酸性pH环境下的去稳定化的示意图。在中性PH环境下，去质子化AuC(Au-C00_)使脂质体稳定化。当pH下降到羧酸基团的PKa值(pKa 5)以下时，Au-COO—被质子化从而形成Au_C00H，Au-COOH随后与脂质体脱离，导致融合活性得到恢复的裸露脂质体的形成。图2.通过动态光散射对AuC-脂质体的表征。(A) 裸露脂质体和AuC/脂质体摩尔比为200/1的AuC-脂质体的粒度(直径，nm)，及(B)裸露脂质体和AuC/脂质体摩尔比为200/1的AuC-脂质体的ζ电位(mV)。图3.示出AuC-脂质体的结构的代表性扫描透射电子显微镜(STEM)图像。㈧ニ次电子图像显示AuC纳米粒子吸附在脂质体表面上。(B)在(A)中示出的区域的透射电子图像进一步证实AuC纳米粒子结合在脂质体上。(C)AuC纳米粒子的暗视野透射图像。(D)AuC纳米粒子的透射图像。图4.具有不同的AuC/脂质体摩尔比(MAue/X)的AuC-脂质体在不同pH值环境下的荧光猝灭和恢复产量。㈧使AuC纳米粒子以不同的MAlC/X摩尔比吸附到荧光标记的脂质体上。以荧光猝灭产量百分比对MAlC/X比率作图。插图具有不同的MAlC/X比率(从顶部到底部:0、22、44、66、88、110、132、154、176、200、220、240、260，和 280)的 AuC-脂质体的荧光发射光谱。(B)AuC-脂质体(MAue/X = 200)在不同的pH值环境下的相对荧光恢复产量。插图AuC-脂质体在一系列pH值(从顶部到底部3,3. 5、4、4· 5、5、7、6· 5、6，和5. 5)环境下的荧光发射光谱。图5.在通过离心除去未结合AuC之后，AuC-脂质体分别在pH = 7(顶部实线)和pH = 4 (底部虚线)的环境下的UV-可见吸收光谱。在pH = 7时，检测到清晰的AuC的UV吸收光谱，指示去质子化AuC强有力地结合在脂质体表面上。在pH = 4时，检测到可忽略不计的AuC的UV吸收，指示质子化AuC脱离于脂质体表面。插图在离心除去游离AuC之后的AuC-脂质体溶液。红色指示在pH = 7时溶液中存在AuC。图6.分别在pH = 7和pH = 4时AuC-介导的脂质体融合的FRET测量。将荧光供体(C6NBD)和荧光猝灭剂(DMPE-RhB)，以猝灭剂有效地猝灭来自供体的荧光发射的适当摩尔比同时掺入到阴离子脂质体中。然后将FRET-标记的阴离子脂质体与AuC-稳定化的阳离子脂质体混合。(A)在470nm的激发波长下C6NBD和DMPE-RhB的荧光发射光谱。从顶线到底线AuC-阳离子脂质体与阴离子脂质体在pH = 4时混合(虚线)；不含任何金納米粒子或阳离子脂质体的単独阴离子脂质体的PH = 7的水溶液(实线)；不含任何金納米粒子或阳离子脂质体的単独阴离子脂质体的PH = 4的水溶液(虚线)；AuB-阳离子脂质体与阴离子脂质体在PH = 4时混合(虚线)；AuB-阳离子脂质体与阴离子脂质体在pH = 7时混合(实线)；以及AuC-阳离子脂质体与阴离子脂质体在pH = 7时混合(实线)；(B)来自图(A)的在不同条件下的C6NBD (供体)的荧光发射光谱放大图，其中顶上面两条线为AuB，中间两条线为AuC，底部两条线为水溶液；(C)分别在pH = 7和pH = 4时与AuB-阳离子脂质体相比，AuC-阳离子脂质体与阴离子脂质体的相对融合活性。图7.羧基修饰的金纳米粒子(AuC)-稳定化的LipoLA以及它在酸性pH环境下的去稳定化的示意图。图8.在通过离心除去未结合AuC之后，AuC-Mg-IipoLA分别在pH = 7 (实线)和pH = 4 (虚线)的环境下的UV-可见吸收光谱。在pH = 7时，检测到清晰的AuC的UV吸收光谱，指示去质子化AuC强有力地结合在脂质体表面上。在pH = 4时，检测到可忽略不计的AuC的UV吸收，指示质子化AuC脱离于脂质体表面。插图在离心除去游离AuC之后的AuC-Mg-IipoLA溶液。紫色指示在pH = 7时溶液中存在AuC。图9.在pH = 4至pH = 7的环境下AuC-Mg-IipoLA与痤疮丙酸杆菌之间的相互作用。与RhB标记的AuC-Mg-LipoLA (初始脂质浓度为140 μ g/mL)在范围为4至7的PH环境下培育之后的痤疮丙酸杆菌(7.93X 108CFU/mL)的发射光谱，其中除去了过量的RhB-AuC-Mg-LipoLA。图10. AuC-Mg-LipoLA对抗痤疮丙酸杆菌的抗微生物活性。(A)将AuC-Mg-LipoLA与痤疮丙酸杆菌(5Xl°7CFU/mL)在不同的pH环境下在厌氧条件下培育lOmin。结果表明，在pH 4. O环境下，AuC-Mg-LipoLA完全灭杀痤疮丙酸杆菌。痤疮丙酸杆菌与空脂质体溶液(不含LA)和pH为4的缓冲液的培育用作阴性对照。(B)在pH = 4吋，分别 将AuC-Mg-LipoLA与痤疮丙酸杆菌培育0min、5min、7. 5min,和lOmin。数据表示为三组独立实验的平均值+SD0 UD:未检测到。图11.细菌毒素触发用于治疗毒素分泌细菌的金納米粒子稳定化的脂质体释放出抗生素的示意原理。万古霉素负载的脂质体受到其表面上的吸收性壳聚糖涂覆的金納米粒子(AuChi)的保护，该金納米粒子阻止该脂质体彼此之间或者与细菌膜融合。一旦AuChi-稳定化的脂质体(AuChi-脂质体)遇到细菌毒素，所述毒素就在脂质体膜中形成孔并因而释放包封的抗生素，所述抗生素随后灭杀分泌该毒素的细菌或者抑制分泌该毒素的细菌生长。图12. AuChi和AuChi-脂质体的合成和表征。(A)壳聚糖和AuChi的1H-NMR谱，其指示壳聚糖涂覆在金纳米粒子的表面上。(B)AuChi的UV-可见吸收光谱。插图AuChi的代表性二次电子图像(SEI)和AuChi的内部金納米粒子的透射电子图像(TEI)。(C)裸露脂质体(不含AuChi)和脂质体/AuChi摩尔比为I 300的AuChi-脂质体的表面ζ电位(mV)。图13.具有不同的脂质体/AuChi摩尔比的AuChi-脂质体的融合能力。将荧光染料ANTS和DPX以DPX最大限度地猝灭ANTS的荧光的浓度包封在脂质体内。在与裸露脂质体(不含AuChi或染料)融合后，ANTS的荧光由于该染料的稀释而得到恢复。(A)在分别将ANTS/DPX负载的脂质体在PBS (用作背景荧光信号)和在O. I % Triton X-100 (用作最大荧光信号)中于室温下培育Ih后测得的ANTS的荧光发射光谱。⑶将脂质体/AuChi摩尔比为I : 0、1 150或I : 300的AuChi-脂质体与裸露脂质体(不含AuChi或染料)以I : 4的摩尔比混合。在室温下培育Ih后，裸露脂质体因与离心过滤装置融合而破裂。测量由此产生的在滤液中的ANTS在510nm处的荧光发射强度。图14.在各种浓度的胆固醇和PEG的存在下毒素诱导的脂质体膜中的成孔。(A)将含有 0% (w/w) >10% (w/w) >25% (w/w),和 50% (w/w)胆固醇的脂质体与 20 μ g/mL α-毒素在室温下培育lh。从该孔释放的染料通过测量ANTS在510nm处的荧光发射强度来进行量化。通过将α-毒素诱导的染料释放与由1% (VZV)Triton-X-IOO导致的全部染料释放相比较，获得成孔百分比。⑶在0-150mg/mL范围内的各种浓度的PEG分子(Mn = 2000Da)的存在下，将含有50% (w/w)胆固醇的脂质体与20 μ g/mL α -毒素一起在室温下培育lh。
图15.在与MRSA细菌(I X 108CFU/mL)分别培育O. 5h和24h后的万古霉素负载的AuChi-脂质体的累积万古霉素释放曲线。释放的万古霉素通过反相HPLC量化。与PBS (不含MRSA细菌)培育的相应样品用作阴性对照。插图通过HPLC测得的各种浓度的万古霉素的线性校准标准曲线。
图16.万古霉素AuChi-脂质体对抗MRSA细菌的抗微生物活性。在100mg/mLPEG的存在下，将万古霉素AuChi-脂质体与MRSA细菌(IX 108CFU/mL)在5% TSB中培育24h。该细菌分泌的毒素在AuChi-脂质体中形成孔，并释放包封的万古霉素，万古霉素随后抑制该细菌的生长。通过在培育后測量在600nm处的吸光度，确定细菌生长速率。万古霉素脂质体(不含AuChi)和具有相同药物浓度(62 μ g/mL)的游离万古霉素用作阳性对照。AuChi-脂质体(不含万古霉素)和PBS用作阴性对照。数据表示为平均值土SD(n = 3)。发明详述缩写和定义 为了便于理解本发明，本文使用的许多术语和缩写定义如下在介绍本发明的要素及其ー个(多个)优选实施方案时，冠词“ー个”、“ー种”、“该”和“所述”意在表示存在一个或多个这样的元素。术语“包含”、“包括”和“具有”是包含性的，并且表示可能存在除所列要素以外的附加要素。在列出两项或多项时使用的术语“和/或”表示所列项中的任一项都可以单独或者与所列项中的任一项或多项组合使用。例如，表达“A和/或B”意在表不A和B中的一者或两者，即，单独的A、单独的B，或者组合的A和B。表达“A、B和/或C”意在表示单独的A、单独的B、单独的C，组合的A和B，组合的A和C，组合的B和C，或者组合的A、B和C。在描述分子和取代基时，分子描述词可以组合从而产生描述取代基的词语或短语。本文中使用了此类描述词。实例包括这样的术语，如芳烷基(或芳基烷基)、杂芳烷基、杂环烧基、环烧基烧基、芳烧氧基烧氧基擬基等。包括最后面的描述词芳烧氧基烧氧基擬基的化合物的具体实例为C6H5-CH2-CH2-O-CH2-O-C(O)，其中C6H5为苯基。还应注意，取代基在本领域中可以具有ー种以上的描述性词语或短语，例如，杂芳基氧烷基羰基也可以称为杂芳基氧烷酰基。此类组合在本文中用于描述本发明的化合物和方法，并且本文描述了其它实例。阴离子如本文使用的术语“阴离子”是指能够在水性介质中形成带有净负电荷的离子的物质。阴离子官能团如本文使用的术语“阴离子官能团”是指具有净负电荷的如本文定义的官能团。代表性阴离子官能团包括羧酸离子、磺酸离子、膦酸离子、它们的烷基化衍生物等。阳离子如本文使用的术语“阳离子”是指能够在水性介质中形成带有净正电荷的离子的物质。羧酸根如本文使用的术语“羧酸根”是指-C02_。官能团如本文使用的术语“官能团”是指化学基团，其赋予带有该化学基团的制品(例如纳米粒子)以特定功能。例如，官能团可以包括已知结合到特定分子上的物质如抗体、寡核苷酸、生物素，或链酶亲和素；或小化学基团如胺、羧酸根等。脂质体如本文使用的术语“脂质体”是指封闭流体空间的单层或多层脂质囊泡。囊泡的壁，也称为膜，由具有极性头和非极性尾的ー种或多种脂质组分(例如，多种磷脂加胆固醇)如磷脂的双分子层形成。在水性(或极性)溶液中，以及在单层脂质体中，ー个层的极性头朝向向外从而延伸进入周围介质，并且该脂质的非极性尾部彼此缔合，由此在囊泡的壁中提供极性表面和非极性核。在多层脂质体中，囊泡的极性表面也延伸到脂质体的核中并且囊泡壁是双层。单层脂质体或多层脂质体中的囊泡壁可以被其它脂质组分如胆固醇、游离脂肪酸和磷脂饱和或者未被它们饱和。在此类情况下，可以将过量的将会流出的其它脂质组分添加到囊泡壁中，直至囊泡壁中的浓度达到平衡，该平衡可能取决于脂质体环境。脂质体还可以包含可能或可能不增加脂质体活性的其它试剂。例如，可以将聚こニ醇(PEG)添加到该膜中从而促进孔形成。另外，将生物相容性纳米粒子添加到该膜中从而使如本文描述的脂质体稳定化。药剂如本文使用的术语“药剂”是指物质、制剂或装置，其治疗或预防或减轻接受该药剂的患者或受试者的疾病或病状的症状。纳米粒子如本文使用的术语“纳米粒子(nanoparticle) ”是指直径在约Inm和约IOOOnm之间的粒子。类似地,术语“多个纳米粒子(nanoparticles) ”是指平均直径在约 Inm和约IOOOnm之间的多个粒子。该术语包括生物相容性纳米粒子，生物相容性纳米粒子可以是可生物降解的阳离子纳米粒子，包括但不限于使根据下面提供的实施例的脂质体稳定化的金、银，和合成纳米粒子。生物相容性合成纳米粒子的实例包括聚苯こ烯等。药学上可接受的如本文使用的术语“药学上可接受的”意指被联邦或州政府的监管机构批准，或者除对于在动物中的使用，更特别是在人和/或非人哺乳动物中的使用安全的其它制剂之外列于美国药典、其它公认的药典中。药学上可接受的盐如本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指本公开中的化合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐是这样的任何盐，其保留了母体化合物的活性并且不会对接受该盐的受试者和在该盐被施用的环境中产生任何有害或不希望的影响。药学上可接受的盐包括但不限于，无机酸和羧酸的金属络合物和盐。药学上可接受的盐还包括诸如铝、钙、铁、镁、锰和复合盐的金属盐。另外，药学上可接受的盐包括但不限于酸盐如こ酸盐、天冬氨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、醋氧こ基盐(axetil)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、朽1檬酸盐、依地酸盐(edetic)、こニ磺酸盐(edisylic)、依托酸盐(estolic)、こ磺酸盐(esyl)、こ磺酸盐(esylic)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、こ醇酸盐、こ醇酰阿散酸盐(glycolylarsanilic)、环己磺酸盐、己基间苯ニ酹酸盐、hydrabamic、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟萘甲酸盐、羟こ磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙ニ酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、粘康酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、对硝基甲磺酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐、磷酸ー氢盐、磷酸ニ氢盐、邻苯ニ甲酸盐、多聚半乳糖酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、磺胺酸盐、磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸、茶氯酸盐(teoclic)、甲苯磺酸盐等。药学上可接受的盐可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。用于生产诸如盐的化合物的方法是本领域技术人员已知的(參见，例如，Stahl 等,Handbookof Pharmaceutical Salts !Properties,Selection, and Use, Wiley-VCH ;Veriag Helvetica Chimica Acta, Ziirich, 2002 ;Berge等，J Pharm. Sci. 66 1,1977)。
药学上可接受的载体如本文使用的“药学上可接受的载体”是指化合物与其一起被使用的赋形剂、稀释剂、防腐剤、增溶剂、乳化剤、佐剂，和/或媒介物。此类载体可以为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，以及聚こニ醇，甘油，丙ニ醇或其它合成溶剤。当化合物是静脉内施用药物时，水是优选的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言更是如此。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白堊、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酷、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、こニ醇、水、こ醇等。如果需要，化合物还可以与少量的润湿剂或乳化剤，或PH缓冲剂如こ酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐组合。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如こニ胺四こ酸；以及用于调节紧张度的试剂如氯化钠 或右旋糖也可以作为载体。用于生产与载体组合的化合物的方法是本领域技术人员已知的。磷脂如本文使用的术语“磷脂”是指含有甘油ニ酷、磷酸基，和简单有机分子如胆碱的许多脂质中的任ー种。磷脂的实例包括但不限于磷脂酸(磷脂酸酯(盐))(PA)、磷脂酰こ醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)，和磷酸肌醇，所述磷酸肌醇包括但不限于磷脂酰肌醇(PD、磷酸磷脂酰肌醇(PIP)、ニ磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PC的另外实例包括如本领域中所定义的DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DRPC，和 DEPC。活性物如本文使用的术语“活性物”是指在真皮环境中，例如在表皮、表皮伤ロ、痤疮病灶，和头皮上有治疗活性的试剂。此种活性物包括但不限于抗生素、抗微生物剂、生长因子、过氧化苯甲酰、化疗剂，以及影响靶标真皮病状的其它试剂如上述药剂。例如，当施用至表皮或表皮伤ロ时，万古霉素可用来治疗如下描述的MRSA。成孔毒素如本文使用的术语“成孔毒素”是指打开靶标细胞的膜中的未调节通道的分子。天然存在的成孔分子的实例包括但不限于α毒素、β毒素、δ毒素、γ毒素,和黄曲霉毒素。合成的成孔毒素的实例包括表面活性剂,如Triton-X 100 。本领域技术人员将会意识到其它天然存在的成孔毒素和合成的成孔毒素。纳米粒子稳定化的脂质体的触发活性物释放本发明提供了刺激-响应性的生物相容性纳米粒子-稳定化的脂质体以及它的触发活性物释放。此类脂质体可以选择性地递送活性物至真皮靶标，所述活性物包括但不限于抗生素、抗微生物剂和其它治疗剂。活性物递送通过激活一种或多种触发器来选择性地执行，所述触发器包括但不限于真皮pH、天然存在或合成的毒素成孔活性，和光敏触发器(例如，经由外部UV光源的施加)。当此类触发器不存在时，脂质体活性物不能被主动地释放。因此，此类脂质体还具有在触发之前阻止不需要的活性物从脂质体中释放出来的优点。在一个实施方案中，本发明提供了脂质体，其包含界定脂质体的内球面和外表面的脂质双层、利用刺激敏感性键连接至脂质分子的多个生物相容性纳米粒子，并且进一歩包含在内球面内的药剂。在某些方面，该多个生物相容性纳米粒子可以结合至脂质双层的脂质分子的亲水头。在某些方面，该脂质分子可以包括磷脂。具体而言，可作为脂质膜的一部分的脂质分子包括氢化L-α -磷脂酰胆碱和1，2_ ニ-(9Ζ-十八烯酰基)-3-三甲基铵基-丙烷。具体而言，脂质分子可以包含氢化L-α-磷脂酰胆碱、月桂酸，和硫酸镁。在某些方面，生物相容性纳米粒子可以利用PH敏感性键连接至脂质分子。在某些方面，生物相容性纳米粒子的外表面可以包含阴离子官能团。具体而言，该阴离子官能团可以是羧酸根。在某些方面，生物相容性纳米粒子的直径为约lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm 或约 20nm。具体而言，生物相容性纳米粒子是金，并且直径为约4nm。在某些方面，该脂质体的外表面包含阳离子官能团。在另ー些其它方面，该脂质体的直径可以为约lOnm、Ilnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、lOOnm、lOlnm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、IIOnm、IIlnm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、118nm、119nm、120nm、I2lnm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、I3lnm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm 、139nm、140nm、14lnm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、I5lnm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、I7lnm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、18lnm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm、190nm、19lnm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、21S nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、291nm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、400nm，或500nm。具体而言，脂质体的直径为约88nm。在某些方面，生物相容性纳米粒子是构成脂质体表面的约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24% 或 25% 的不可或缺部分(如根据表面积测得的)。具体而言，生物相容性纳米粒子結合至脂质体外表面的约14%。例如，提供了脂质体，其中生物相容性纳米粒子在中性pH环境下结合至脂质体表面，其使脂质体稳定化或者阻止一个脂质体与另ー个脂质体融合。此类生物相容性纳米粒子(例如，直径为 4nm)可以是可生物降解的阳离子纳米粒子，包含但不限于使根据下面提供的实施例的脂质体(例如，直径为 IOOnm)稳定化的金、银，和合成纳米粒子。当环境酸性增加至约pH < 5时，结合的生物相容性纳米粒子可以从脂质体上脱离，导致可以主动地与各种生物膜融合的裸露脂质体的形成。已充分证明，人皮肤通常是酸性(PH =
3.9 6. O)，尤其皮肤上的感染病灶。例如，该pH值在痤疮病灶中为约4. O，而在粉刺中为
4.5-6. 3。因此，提供具有可调融合能力的酸响应性脂质体用于真皮活性物递送。
在另ー个实施方案中，本发明提供了脂质体，其包含界定脂质体的内球面和外表面的脂质双层、经由静电相互作用与脂质分子接触的多个生物相容性纳米粒子，并且进一步包含在内球面内的药剂。在某些方面，该 脂质分子可以包括磷脂。具体而言，可作为脂质膜的一部分的脂质分子包括氢化L- α -磷脂酰胆碱和1，2- ニ-(9Ζ-十八烯酰基)-3-三甲基铵基-丙烷。具体而言，脂质分子可以包含氢化L- α -磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙ニ醇。在某些方面，生物相容性纳米粒子的外表面包含阳离子官能团。具体而言，该阳离子官能团可以是壳聚糖。在某些方面，生物相容性纳米粒子的直径为约lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或约 20nmo 具体而言，生物相容性纳米粒子是金，并且直径为约4nm。在某些方面，该脂质体的外表面包含阴离子官能团。在另ー些其它方面，该脂质体的直径可以为约10nm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、lOOnm、10lnm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、IIOnm、IIlnm、I12nm、I13nm、I14nm、I15nm、I16nm、I17nm、I18nm、I19nm、120nm、I2lnm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、I3lnm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm、139nm、140nm、141nm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、151nm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、I7lnm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、18lnm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm、190nm、191nm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、291nm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、400 或 500nm。具体而言，脂质体的直径为约 88nm。在某些方面，生物相容性纳米粒子是构成脂质体表面的约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24% 或 25% 的不可或缺部分(如根据表面积测得的)。具体而言，生物相容性纳米粒子结合至脂质体外表面的约 14%。在另ー个实施例中，提供了可选择性地递送活性物至靶向的真皮部位、由成孔毒素触发的脂质体。在各个方面，成孔毒素在靶向的真皮部位处打开脂质体中的孔从而释放活性物。在此种情况下，生物相容性纳米粒子不必从脂质体膜上脱离来释放它的活性物。一旦脂质体与分泌毒素的细菌接触，它们就为让毒素插入到脂质体膜中作准备并且形成孔，纳米粒子稳定化的脂质体通过该孔释放治疗剂。被释放的药物随后对毒素分泌细菌施加抗微生物作用。使用耐甲氧西林(Methicillin)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) (MRSA)作为模型细菌以及使用万古霉素作为模型抗-MRSA抗生素，本文的实施例证明合成的纳米粒子稳定化的脂质体可以在MRSA细菌的存在下在24h内完全释放包封的万古霉素，并且与等量的万古霉素负载的脂质体(不含纳米粒子稳定剂)和游离万古霉素一样有效地抑制MRSA生长。在各个方面，本发明包括包含上述脂质体的药剂递送系统。在某些方面，该药剂可以与药物学上可接受的媒介物一起配制。根据本发明的又一方面，提供了用于治疗疾病的方法，该方法包括经由上述药剂递送系统将治疗有效量的活性物施用至需要其的患者。在某些方面，该药物可以是过氧化苯甲酰或月桂酸。在某些方面，该疾病可以是皮肤疾病。具体而言，该皮肤疾病可以是痤疮丙酸杆菌感染或金黄色葡萄球菌感染。
在各个方面，本发明包括用于制备上述脂质体的方法。该方法涉及将生物相容性纳米粒子与脂质体组合在一起。在某些方面，生物相容性纳米粒子的表面可以包含阴离子官能团或阳离子官能团。具体而言，生物相容性纳米粒子的表面可以包含包括羧酸根的壳聚糖。在某些方面，生物相容性纳米粒子是金，并且直径为约Inm至约20nm。具体而言，生物相容性纳米粒子的直径可以为约4nm。在某些方面，脂质体可以包含磷脂。具体而言，月旨质体可以包含氢化L- α -磷脂酰胆碱和I，2- ニ - (9Ζ-十八烯酰基)-3-三甲基铵基-丙烷。具体而言，脂质体可以包含氢化L-α-磷脂酰胆碱、月桂酸，和硫酸镁。具体而言，月旨质分子可以包含氢化L-α -磷脂酰胆碱、胆固醇和聚こニ醇。在某些方面，生物相容性纳米粒ナ的直径为约 lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或约20nm。具体而言，生物相容性纳米粒子是金，并且直径为约4nm。在某些方面，脂质体的外表面包含阴离子官能团。在另ー些其它方面，脂质体的直径可以为约 lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、3lnm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、lOOnm、lOlnm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、IlOnm、11lnm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、118nm、119nm、120nm、12lnm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、I3lnm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm、139nm、140nm、141nm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、151nm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、17lnm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、18lnm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm>190nm、191nm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、27 3nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、29lnm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、400nm，或 500nm。具体而言，脂质体的直径为约88nm。在某些方面，生物相容性纳米粒子是构成脂质体表面的约 5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %、22 %、23 %、24%或25%的不可或缺部分(如根据表面积测得的)。具体而言，生物相容性纳米粒子结合至脂质体外表面的约14%。提供了稳定地储存药剂和活性物的方法。如上所述，在触发的活性物释放之前，活性物可以被稳定地储存。经由纳米粒子脱离的触发活性物释放本发明提供了刺激响应性生物相容性纳米粒子稳定化的脂质体，其中生物相容性纳米粒子在中性pH环境下结合至脂质体表面并因而使脂质体稳定化。当环境酸性増加至约pH < 5时，结合的生物相容性纳米粒子与脂质体脱离，导致可以主动地与各种生物膜融合的裸露脂质体的形成。人皮肤通常是酸性(pH = 3. 9 6. O)，尤其皮肤上的感染病灶。例如，该pH值在痤疮病灶中为约4. 0，而在粉刺中为4. 5-6. 3。因此，具有可调融合能力的酸性响应性脂质体对于真皮活性物递送有效。參见，例如，Pornpattananangkul,D.等,ACSNano 2010，4，1935-1942，其以引用的方式完整地并入本文。羧基修饰的生物相容性纳米粒子在介导磷脂脂质体的融合活性方面的应用在图I中示出，其中使用的是金纳米粒子。羧基的pKa ^ 5,它在pH = 7时去质子化,导致产生带负电荷的Au-COO-纳米粒子,带负电荷的Au-COO-纳米粒子通过静电引力结合至阳离子脂质体并因而使脂质体稳定化。当环境PH下降至5以下时，羧酸基团被质子化。由此产生的中性Au-COOH纳米粒子由于缺少结合力而与脂质体表面脱离，由此使脂质体游离。选择金纳米粒子用于这个实例以及下面的实施例，因为当将一小部分荧光染料掺杂在脂质体膜中时，金納米粒子的荧光猝灭特性可用来指示它们的结合和脱离过程和程度。而且，金是具有对抗广泛类型的细菌的抗微生物活性的生物相容性贵金属。然而，本领域技术人员将会意识到具有类似性质的替代納米粒子，包括如上所定义的那些如银和合成的生物相容性纳米粒子如聚苯こ烯。通过熟知的挤出方法(Mayer,L. D.等，Vesicles of Variable SizesProducedby a Rapid Extrusion Procedure. Biochim. Biophys. Acta 1986,858,161-168),制备由90重量％氢化L- α -憐脂酸胆喊(蛋PC)和10重量％ I, 2_ ニ -(9Z-十八烯酸基)_3_ ニ甲基铵基-丙烷(DOTAP)组成的阳离子磷脂脂质体。动态光散射(DLS)测量显示，所形成的脂质体的粒度和表面ζ电位分别为88.0±1.0nm和24.9±2. 3mV(图2)。该正的ζ电位值指示DOTAP掺入到脂质体膜中。在単独的反应中，按照此前公布的方案(Aryal，S.等，Spectroscopic Identification of S-AuInteraction in Cysteine Capped GoldNanoparticles. Spectrochim. Acta A2006,63,160-163 ;Patil, V.等，Role of ParticleSize in Individual anticompetitive Diffusion of Carboxylic Acid DerivatizedColloidal GoldParticles in Thermally Evaporated Fatty Amine Films. Langmuir1999，15,8197-8206)合成AuC纳米粒子，产生的AuC具有通过扫描透射电子显微镜(STEM)测得的 4nm的几乎均匀的粒度(图3)，和通过DLS测定的-25. 6±4. 2mV的负表面ζ电位。将合成的阳离子脂质体和AuC纳米粒子以I : 200的摩尔比在温和的浴超声处理(bathsonication)下混合lOmin,从而形成AuC-脂质体。通过以1.3X104rpm离心IOmin来除去溶液中的过量AuC，从而确保随后的粒度和表面ζ电位测量结果完全来自AuC-脂质体，而不来自未结合AuC粒子。DLS数据显示，AuC-脂质体的粒度为92.9± I. 3nm并且表面ζ电位为-25. 3±0. 7mV(图2)。所测得的AuC-脂质体粒度稍大于裸露脂质体的粒度，这是由4nmAuC纳米粒子的吸附造成的，同时从24.9mV到-25. 3的ζ电位变化清楚地掲示带负电荷的AuC与带正电荷的脂质体的结合。通过STEM对AuC-脂质体的形态和结构进一歩成像。如图3AB所示，在将脂质体放置在TEM载网上后，在脂质体表面上可见各个AuC粒子。在STEM上使用能量色散X射线型(EDX)光谱仪，我们可以基本上鉴定出图3AB中的某些区 域含有Au，而其它区域仅含有在脂质体中发现的元素如碳和磷。通过DLS测得脱水脂质体的粒度大于水化脂质体的粒度，这是由于脂质体从三维球体塌陷成ニ维薄层。为了进一步证实AuC纳米粒子与脂质体表面的结合，将一部分荧光标记的脂质，1,2- ニ豆蘧酰-sn-甘油-3-磷酸こ醇胺-N-丽丝胺若丹明B磺酰基(DMPE-RhB，激发/发射=550nm/590nm)掺杂到脂质体膜中。预计，因为荧光共振能量转移(FRET)机制，AuC结合将会猝灭在AuC粒子的下方或附近的荧光染料。将AuC纳米粒子与荧光标记的脂质体以在从O至280的范围内的摩尔比(MAuC/ML)混合。记录在590nm处的荧光发射强度，并且如下计算猝灭产量猝灭产量) = (1-1^。-し/1し)100，其中Iaic-L和IL分别表示RhB-标记的脂质体在存在和不存在AuC纳米粒子的情况下的荧光强度。如图4A所示，当MAue/X比率增加时，猝灭产量增高并且在MAue/X = 280时达到100%。因为脂质体和AuC纳米粒子的直径分别为约88nm和4nm，所以如果假定所有AuC都附连在脂质体表面上，那么AuC在脂质体表面上的表面覆盖率在MaucZMl比等于280 I时为约14%。根据FRET机制，吸附的AuC粒子不仅可以有效地猝灭AuC下方的DMPE-RhB探针，而且可以有效地猝灭在AuC粒子周围的2 5nm区域内的DMPE-RhB探针。这将会导致接近100%的理论猝灭产量，这与已在图4A中观察到的结果一致。虽然较多的AuC粒子可能可以吸附到 86%的未被占用(unoccupied)的脂质体表面上,但是进ー步的研究证明当将较多的AuC添加到该溶液中至超= 280的完全猝灭点吋，猝灭产量仍然为100%的稳定水平。图4A插图示出在470nm的激发波长下，具有不同MAlC/X比率的AuC-脂质体在500_650nm范围内的代表性荧光发射光谱。这个激发波长可以有效地激发掺杂在脂质体膜中的DMPE-RhB探针，同时将荧光发射光谱受到的干扰减至减小。不受特定理论的束缚，本发明提出当环境pH值降低至羧酸的pKa值以下时，带负电荷的Au-COCT将被质子化从而形成中性Au-COOH，中性Au-COOH由于静电引力的消除而可从阳离子脂质体表面上脱离。随后，AuC的脱离将会诱导掺杂在脂质体中的DMPE-RhB探针的荧光恢复。为了测试这一点，使用MAue/X比率为200的AuC-脂质体溶液来研究在各种pH值环境下DMPE-RhB的相对荧光恢复产量。使用由邻苯ニ甲酸氢钾或磷酸ニ氢钾组成的、最终盐浓度为5mM的缓冲溶液，将AuC-脂质体溶液的pH调节至在从pH = 7至pH = 3的范围内的期望值。记录在各种PH值环境下的AuC-脂质体溶液在590nm处的荧光发射強度。考虑到悬浮在荧光标记的脂质体溶液中的脱离的AuC纳米粒子也可能会通过无规碰撞猝灭DMPE-RhB染料，因此使用相对恢复产量描述在pH变化后的荧光恢复。将在每个pH点处的AuC-脂质体的荧光强度用与相同量的裸露金納米粒子(AuB)混合的脂质体的荧光強度进行归一化，裸露金納米粒子(AuB)是不含羧基修饰和Au-COOH特性的中性粒子。相对恢复产量定义如下相对恢复产量) = IAlC-L/IAuB-LX100，其中Iaic-L和Iaub-L表示AuC稳定化的脂质体，以及与AuC-脂质体具有相同浓度的脂质体和AuB的混合物在各种pH值环境下的荧光强度。如图4B所示，当pH值从7降低至5. 5时，DMPE-RhB标记的AuC-脂质体的相对恢复产量从23%轻微降低至18%。然后，当使pH值进ー步从5. 5降低至3时，它从18%显著增大至约55%。从pH = 7到pH = 5. 5的相对恢复产量的轻微降低指示与在pH = 7时的情况相比，在pH = 5. 5时较多的AuC粒子吸附在脂质体上或者在AuC与脂质体之间发生较强的结合。这可能是因为阳离子脂质DOTAP在较低的 pH环境下变得带有更多的正电荷，导致在AuC与脂质体之间产生较强的电荷-电荷引力。而当pH值低于5. 5在5. 5 3范围内吋，AuC的质子化影响比任何其它影响都占优势，它显著弱化静电引力。因此，从脂质体表面脱离的AuC导致高荧光恢复。图4B插图示出在470nm的激发波长下，在从7至3范围内的不同pH值环境下的AuC-脂质体在500-650nm范围内的代表性荧光发射光谱。这些荧光恢复结果与在不同PH值环境下的AuC-脂质体的表面ζ电位测量结果一致。AuC-脂质体的表面ζ电位从在pH = 7时的-25. 3±0. 7mV增大至在pH = 4时的+30. 1 + 2. ImV,指示在酸性pH环境下AuC从脂质体表面脱离。AuC-脂质体在pH = 4时的表面ζ电位略高于裸露脂质体在pH = 7时的表面ζ电位，24.9±2.311^(图28)，这可能是因为阳离子脂质DOTAP在酸性pH环境下带有更多的正电荷。通过在经由适当的离心除去未结合AuC之后分别测量AuC-脂质体在pH = 7和pH=4的环境下的UV可见吸收，进ー步检查AuC与脂质体表面在中性pH环境下的结合和在酸性pH环境下的脱离。这里，使用HCl而不使用缓冲溶液调节AuC-脂质体溶液的pH，因为缓冲剂的某些UV吸收能被检测到。在将AuC-稳定化的阳离子脂质体(未用荧光标记)与HCl分别在pH = 7和pH = 4的环境下培育IOmin后，对AuC-脂质体溶液离心从而使未结合AuC纳米粒子沉淀析出。然后,记录由此产生的上清液在300nm至700nm范围内的UV可见吸收光谱，如图5所示。在pH = 7时，清晰地检测到AuC的UV吸收光谱，但在pH = 4时却不能。观察到的UV吸收光谱与如图5插图中所示的上清液的色差一致。在pH = 7吋，观察到少量的粒子沉淀物，而上清液的颜色仍然为红色，其为金纳米粒子的特征。相比之下，在pH = 4吋，出现大量粒子沉淀物，并且上清液的颜色变得透明。然后，使用DLS对这种透明上清液測量粒度和表面ζ电位，得到的结果与裸露脂质体的结果类似。这些数据掲示，当pH值(例如,pH = 7)高于羧酸的pKa ( 5)时,AuC为去质子化形式(Au_C00_)并因而强有力地结合至阳离子脂质体。因此离心力不能使它们与脂质体分离。然而，当PH值(例如，pH = 4)低于pKa值时，AuC被质子化为不再吸附在脂质体上的Au-COOH形式。通过离心很容易将未结合Au-COOH粒子从该溶液中分离出来。在证明AuC纳米粒子在环境酸性变化后可以结合至以及脱离于阳离子脂质体之后，检查AuC纳米粒子介导的脂质体的可控融合活性。为此，制备由蛋PC和月桂酸(LA)组成的阴离子脂质体，将该阴离子脂质体与AuC-稳定化的阳离子脂质体在不同pH值环境下混合。预计，在AuC被质子化并且与阳离子脂质体脱离后，裸露的阳离子脂质体将紧密地结合至阴离子脂质体并与阴离子脂质体紧密地融合。为了监测融合过程和融合程度，用发色团的FRET对预先标记阴离子脂质体，并在将FRET-标记的阴离子脂质体与AuC-稳定化的阳离子脂质体分别在PH = 7和pH = 4的环境下混合后，測量FRET信号的变化。FRET是基于两个发色团的能量转移机制在分子水平上精确地测量两个对象的距离的广泛使用的技木。当该两个发色团极为接近(く IOnm)时，被激发的供体可以通过非辐射性长程偶扱-偶极耦合机制将能量转移至接受体。这里，我们将荧光供体(C6NBD :激发/发射=470nm/520nm)和荧光接受体(DMPE-RhB :激发/发射=550nm/590nm)掺入到阴离子脂质体的脂质膜中。通过控制供体与接受体的摩尔比，使得在荧光阴离子脂质体中，来自供体的荧光发射完全被接受体猝灭。如果阴离子脂质体与阳离子脂质体融合，那么供体和接受体发色团在阳离子脂质体内的散布将会降低或消除FRET效率，导致供体的荧光恢复。对于这种融合实例，首先使用缓冲溶液分别将AuC-稳定化的阳离子脂质体(MAuC/ML = 200)调节至pH = 7和pH = 4。由此产生的未结合AuC纳米粒子通过以
I.3X104rpm离心IOmin来除去，以便消除溶液中的游离AuC通过无规碰撞产生的荧光猝灭影响。随后，将该阳离子脂质体与FRET-标记的阴离子脂质体以7 I的摩尔比混合。然后在470nm的波长处激发该混合物，并记录在500-650的范围中的荧光发射光谱，如图4A所示。因为荧光接受体DMPE-RhB也在470nm处被激发，由此在590nm处产生主发射峰，所以我们放大至主要来自C6NBD的500-540nm发射窗ロ(图6B)。我们发现与在pH = 7时的情况相比，在PH = 4时发生显著的C6NBD荧光恢复。最佳的解释是在pH = 7时Au-COO-纳米粒子强有力结合至阳离子脂质体并且阻止阳离子脂质体与阴离子脂质体融合。然而，在PH=4时质子化的Au-COOH纳米粒子与阳离子脂质体脱离，导致产生与阴离子脂质体有效融合的裸露阳离子脂质体。为了排除PH调节影响阴离子脂质体内的FRET效率的可能性，将调节至相应PH值和浓度并且没有与阳离子脂质体混合的FRET-标记的阴离子脂质体用作阴性对照。当在470nm处激发对照样品时，在pH = 7和pH = 4时在530nm处没有检测到比较大的荧光发射差异。另外，将AuB纳米粒子(中性并且没有羧基修饰)用作阳性对照。在pH = 7和pH = 4时都出现C6NBD在530nm处的强荧光发射，指示AuB在中性和酸性pH值环境下都没有紧密地结合至阳离子脂质体以致于未能阻止它们与阴离子脂质体融合。图6C强调AuC-阳离子脂质体和阴离子脂质体与AuB-阴离子脂质体和阴离子脂质体相比的相对融合效率，以具有相应PH值和浓度的単独阴离子脂质体作为背景。在不同pH值环境下
的相对融合日を力计算如下相对融合(% )=(エ53(1, AuC_l53(l, H2。)/ (し。，AuB_l53(l, H2。)X 100,其中
I53O, Auc表示与阴离子脂质体混合的AuC-阳离子脂质体在530nm处的荧光发射强度，I53tl, AuB表示与阴离子脂质体混合的AuB-阳离子脂质体在530nm处的荧光发射强度；I53(I,H2。表示单独的阴离子脂质体在530nm处的荧光发射强度。如图6C所示，AuC-阳离子脂质体的相对融合产量在pH = 7时为24. 4± I. 6，在pH = 4时为81. I ± I. 2，指示使用AuC介导脂质体的融合活性的可行性。已成功地合成羧基修饰的AuNP (表示AuC，直径为 4nm)并且已证明它们在不同的pH值环境下可以结合至以及脱离于阳离子磷脂脂质体，因此使用AuC来控制脂质体月桂酸(LipoLA)的融合活性和执行皮肤敏感性的月桂酸药物递送。羧基的pKa 5，它在pH =7时去质子化，导致产生带负电的Au-C00_，Au-C00_可以在ニ价离子如镁(Mg2+)的存在下通过静电引力结合至LipoLA并因而使该脂质体稳定化。当环境pH下降至5以下时，该羧基被质子化。由此产生的中性Au-COOH由于缺少结合力而从LipoLA表面上脱离，由此使脂质体游尚。为了制备AuC-Mg-lipoLA，通过熟知的挤出方法(參见上文)制备由蛋PC和LA (3 2重量比)构成的lipoLA。在S印hadex G75柱上将未包封的LA从该脂质体中分离出来。在単独的反应中，按照此前公布的方案(參见上文)合成AuC纳米粒子。通过将AuB与MPA(4X 10_4M) —起培育过夜来对AuB进行羧基官能化。将由此产生的AuC经由截留分子量为 IOkDa 的 Amicon Ultra-4 离心过滤器(Mi I lipore, Bi I lerica, MA)洗漆 3 次。将所得的lipoLA、MgSO4和AuC在温和的浴超声处理下混合(I 2000 200摩尔比)IOmin以便产生 AuC-Mg-LipoLA。针对痤疮丙酸杆菌测试在AuC脱离后LipoLA的融合能力的重新激活。将 RhB-AuC-Mg-LipoLA (初始脂质浓度为140 μ g/mL)与7. 93 X 108CFU/mL的痤疮丙酸杆菌混合，并用缓冲溶液将该溶液的PH从4调节至7。在室温下培育15min后，将样品以13, 200rpm离心5min从而除去过量的RhB-AuC-Mg-LipoLA,并重悬在PBS中。为了确定AuC-Mg-LipoLA对抗痤疮丙酸杆菌的抗微生物活性，将具有利用缓冲溶液调节的4. O至7. O的pH的AuC-Mg-LipoLA与痤疮丙酸杆菌(5 X 107CFU/mL) —起在37 °C下在厌氧条件下培育期望的培育时间。(图9)结果显示，在pH 4. O环境下，AuC-Mg-LipoLA完全灭杀痤疮丙酸杆菌。痤疮丙酸杆菌与空脂质体溶液(不含LA)和pH为4的缓冲液的培育用作阴性对照。经由脂质体孔形成的触发活性物释放本发明还提供了被动的靶向活性物递送平台，其中利用成孔毒素等其它触发器在靶标真皮部位触发生物相容性纳米粒子稳定化的脂质体释放活性物。具体地，提供了被动的靶向抗微生物药物递送平台，其中利用细菌毒素触发用于抑制毒素分泌细菌生长的金納米粒子稳定化的脂质体释放抗生素。在一个实例中，对脂质体组成和壳聚糖修饰的金纳米粒子在脂质体表面上的覆盖进行优化，使得脂质体融合活性和不期望的药物泄漏在正常储存条件下受到阻止，同时该脂质体仍然易感于成孔毒素。一旦与毒素培育，该脂质体就会出现漏泄并且活性物，在这种情况下的包封抗生素有效载荷就会通过毒素形成的孔迅速释放。进ー步证明，在毒素分泌细菌的存在下，在24h内100%的活性物，在这种情况下的包封抗生素从金纳米粒子稳定化的脂质体中释放出来并且释放的抗生素有效地抑制细菌生长。这种抗微生物药物递送途径提供了通过在感染部位特异性地释放药物，同时将脱靶效应减至最小来治疗细菌感染的新范式。虽然万古霉素在这项研究中用作抗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)抗生素，但是这种技术可以被推广为选择性地递送用于治疗由分泌成孔毒素的细菌和其它生物引起的各种病状的活性物。另外，这种技术可以被推广为选择性地递送用于治疗其它病状的活性物至靶标真皮部位。在又一个实例中，这种系统可以经修改用于递送化疗剂至癌性真皮病灶如黑素瘤。多柔比星(Doxorubicin)是可被选择性地递送至黑素瘤病灶的活性物的实例，可通过经由在癌性病灶部位施加合成的成孔毒素如Tdton-X 100 触发多柔比星的释放。
如下面实施例中提供的，使用MRSA作为模型细菌以及使用万古霉素作为模型抗-MRSA抗生素，证明合成的金纳米粒子稳定化的脂质体在MRSA细菌的存在下在24h内完全释放包封的万古霉素，并且与等量的万古霉素负载的脂质体(不含纳米粒子稳定剂)和游离万古霉素ー样有效地抑制MRSA生长。这种细菌毒素启动(enabled)的纳米粒子稳定化的脂质体的药物释放提供了用于治疗细菌感染的新的安全有效途径。这种技术可以广泛地应用于治疗由分泌成孔毒素的细菌引起的多种感染。本领域技术人员将很容易意识到此类化合物，包括如上定义的那些。本发明提出纳米粒子稳定化的脂质体与等量的万古霉素负载的脂质体(不含纳米粒子稳定剂)和游离万古霉素ー样有效，这证明纳米粒子稳定化的 脂质体制剂在提高药物效カ和克服药物抗性方面的潜能。其次，基于脂质体的制剂的受控药物释放一直被认为是具有挑战性的。本文的实施例利用毒素的成孔特性并且开发出以受控方式释放包封的药物的仿生策略。在各个方面，释放的药物量被自我调节并且与细菌活力相关。这种相关性具有重要意义，因为它可以有效地将药物全身暴露和脱靶递送减至最低，并且可以提高所递送药物的效力。代替使用靶向配体将药物载体主动地靶向至目标细菌，本发明利用成孔分子如靶标细菌分泌的毒素，并且利用它们触发活性物到靶标真皮部位的释放。在各个方面，此类纳米粒子稳定化的脂质体的使用可以灭杀靶标细菌。使用这种途径，药物在与靶标细菌接触前被保护在脂质体内并且不被释放，由此消除由于过早的药物泄漏或非特异性药物释放引起的不利副作用。作为概念验证，实施例中证明了细菌毒素可以用来触发金纳米粒子稳定化的磷脂脂质体释放抗生素，并且释放的抗生素随后可以抑制，在非限制性实例中的分泌该毒素的金黄色葡萄球菌细菌的生长。如上所述，存在具有成孔活性的多种分子，包括细菌毒素、动物毒素、免疫蛋白，以及合成化合物如Triton Χ-100 。α -溶血素，也称为α -毒素是由金黄色葡萄球菌细菌分泌的作为分子量为34kDa的水溶性蛋白単体的常见毒素之一。这种蛋白质可以自发地掺入到脂质膜中并且自我寡聚化从而形成具有中央孔的七聚结构。该孔尺寸为约2nm，其允许最高约3KDa的小分子被动地扩散通过该膜。在性质上，金黄色葡萄球菌细菌分泌可结合至易感细胞外膜的α-毒素。在结合时，迅速的成孔促进水、离子和小分子的不受控制的滲透，诸如ATP的重要分子的迅速排放，膜电位和离子梯度的耗散，以及导致细胞裂解的不可逆的滲透性溶胀。考虑到在细菌感染部位处的成孔毒素以及它们的成孔活性的极大可用性，本发明提出可以利用这些侵入性分子从脂质体选择性地释放包括抗微生物剂在内的活性物，所述脂质体被小生物相容性的包括金在内的纳米粒子稳定化从而避免不期望的膜-膜融合和药物泄漏。这种策略允许药物在感染部位选择性地释放从而灭杀毒素分泌细菌，同时不对健康组织产生任何有毒副作用。本发明进一歩提供了用于局部治疗皮肤细菌感染的新型脂质体制剂的合成，所述制剂被壳聚糖修饰的金納米粒子(AuChi)稳定化从而差异地释放活性物，以及在非限制性实例中的万古霉素，从而抑制在又一个非限制性实例中的金黄色葡萄球菌细菌的生长。
图11示出毒素触发用于治疗分泌该毒素的细菌的金納米粒子稳定化的脂质体释放抗生素的工作原理。阳离子AuChi通过静电引力结合至带负电荷的脂质体表面，因而稳定化脂质体以使其不彼此融合并且避免不期望的抗生素泄漏。当稳定化的脂质体在金黄色葡萄球菌细菌附近吋，该细菌分泌的毒素将会插入到脂质体膜中并创建孔，包封的抗生素通过该孔释放。释放的万古霉素因为靠近细菌，所以然后将会迅速地局部地发挥它的抗微生物活性。局部施用通过本发明方法制备的脂质体可以充当用于治疗真皮病状的药剂的递送媒介物，或者充当用于合成作为用来治疗真皮病状的药学上可接受的活性剂的组合物的中间体，所述真皮病状包括但不限于MRSA感染和痤疮丙酸杆菌感染。真皮施用的非限制性实例包括美国专利第5，830，877号、第6，245，347号、第7，754，240号，因此将与真皮制剂和真皮施用途径相关的部分以引用的方式并入本文。通过本发明方法递送的药剂以及在适当的情况下的它们的药学上可接受的盐可以经皮肤和透皮局部施用。被递送的药剂量与激活药剂释放的触发器相关。这可以包括每天施用约O. Olmg直到约1500mg的剂量，但是可以发生变化，这取决于受治疗人的状况及他们对所述药剂的个体反应，以及选定的药物制剂类型和进行此类施用的时间和间隔期。在一些情况中，低于前述范围下限的剂量水平可能已足够有余，而在其它情况下，在不引起任何有害副作用的情况下可以施用更大的剂量。 通过本发明方法递送的药剂以及在适当情况下的它们的药学上可接受的盐可以単独地或者与药学上可接受的载体或稀释剂组合通过此前指出的途径中的任一种施用。更具体而言，该化合物可以以各种各样的不同剂型施用，例如它们可以与各种药学上可接受的惰性载体组合，以透皮贴剂、粉剂、喷雾剂、霜剂、油膏剂、凝胶剂、凝胶、糊剂、洗剤、膏剂、水悬浮液等形式施用。此类载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剤。因为在不偏离本发明范围的情况下可以在上述化合物、产品和方法中作出各种改变，所以意图包含在上面的描述和下面给出的实施例中的所有主题都应解释为说明性的而非限制性的。
实施例本教导的方面可以进ー步根据下列实施例理解，所述实施例不应被解读为以任何方式限制本教导的范围。实施例I-羧基修饰的金纳米粒子的制备羧基修饰的金纳米粒子(AuC)的制备根据完整详细地描述在其它文献(Aryal，b.等，Spectroscopic Identification οι S-Au Interaction inしysteine Capped GoldNanoparticles. Spectrochim. ActaA2006,63, 160-163 ；Patil, V.等，Role of ParticleSize in Individual and CompetitiveDiffusion of Carboxylic Acid DerivatizedColloidal Gold Particles inThermally Evaporated Fatty Amine Films. Langmuir1999，15,8197-8206)中的硼氢化钠还原方法制备AuC。简言之，在冰冷的温度下用O. 005gNaBH4还原HAuCl4水溶液(10-4M，50mL)，由此形成裸露金纳米粒子(AuB)。通过将AuB与MPA(巯基丙酸，4X 10_4M)培育过夜来对AuB进行羧基官能化。将由此产生的AuC经由截留分子量为 IOkDa 的 Amicon Ultra-4 离心过滤器(Millipore, Billerica, MA)洗漆 3 次，并悬浮在pH = 6. 8的水溶液中。脂质体和AuC-脂质体的制备和表征通过熟知的挤出方法(Mayer，L. D.等，Vesicles of Variable Sizes Produced by a RapidExtrusion Procedure. Biochim.Biophys. Acta 1986，858，161-168)制备由蛋PC(两性磷脂)和DOTAP (阳离子磷脂)组成的阳离子脂质体。简言之，将I. 5mg蛋PC与DOTAP的混合物(重量比=9 I)溶解在ImL氯仿中。通过在溶液上鼓入氩气15min来蒸发溶剤。然后将干燥的脂质膜用3mL去离子水水化，接着润旋Imin并在浴超声处理器(Fisher Scientific FS30D)中超声处理3min从而产生多层囊泡(MLV)。使用Ti-探针(Branson 450超声破碎器)将MLV在20W下超声处理l_2min从而产生单层囊泡。为了形成窄分布的小单层囊泡(SUV)，将该溶液从具有IOOnm孔尺寸的聚碳酸酯膜中挤出11次。通过将脂质体与AuC纳米粒子以期望的摩尔比在温和的浴超声处理下混合10分钟来制备AuC-稳定化的脂质体(AuC-脂质体)。
通过使用Malvern Zetasizer ZS (Malvern Instruments, UK)评估所制备的脂质体和AuC-脂质体的流体动力学尺寸和表面ζ电位。分别通过动态光散射(DLS)和电泳迁移率測量确定平均直