专利名称：一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法好氧反硝化是指有氧气的条件下发生的反硝化现象，近些年来不断有好氧反硝化菌被分离出来(已报道的菌属有如副球菌属、假单孢菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属等50多个菌属存在好氧反硝化现象)，这就为生物脱氮技术提供了一个新的途径。好氧反硝化与传统的反硝化相比具有如下优点1、在有氧条件下进行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同时在一个反应器中进行，设备与操作成本大幅下降；2、硝化作用的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化进程加快，缩短了脱氮周期。所以，好氧反硝化脱氮技术是当前与以后一段时间内的科学研究的热点。芽孢杆菌属的特点1.细菌呈直杆状，细胞染色大多数在幼龄培养时呈G+，好氧或兼性厌氧，化能异氧菌， 具有发酵或呼吸代谢类型；在条件不利的情况下形成芽孢，将自已保护起来，复活率高。其有耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压等，故以其开发产品有较高的稳定性2.菌体生长营养要求简单。3.有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对污染水体的有机物有较强的降解能力。综上所述，设计出一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，以利于快速分离、 提纯出高效好氧反硝化的芽孢杆菌，以期为生物脱氮作贡献。好氧反硝化菌的分离方法有很多，主要有选择性富集法；稀释法；间歇曝气法。
本发明提供了一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，筛选出具有反硝化水体(水产养殖、与环境污染水体)中硝态氮与亚硝态氮的芽孢杆菌。为实现上述目的本发明采用如下技术方案
一种简易、快速分离筛选好氧反硝化芽孢杆菌的方法，其特征在于选择如土壤、池塘水样、泥样或活性污泥等目标物接种于含有N02_-N/N03—N的富集培养基中，进行间歇增氧富集培养；移取适量富集培养物75-80°C水浴杀除杂菌，稀释后涂布于含N02_-N/N03一N梯度平板培养；然后对培养后的平板进行喷涂N02_-N/N03一N显色液，挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株；接着利用纯培养物菌体在不同N02_-N/N03一N浓度的培养基中，恒温间歇增氧培养，测定其0D600nm吸光度值，以定量的确定芽孢杆菌所适应的N02__N/N03一N浓度范围；在确定的适中的N02_-N/N03一N浓度下，用含有N02__N/N03一N的液体富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，通过测定液体富集培养基中N02_-N/N03一N含量，以求解其去除率，复筛出好氧反硝氧能力强劲的芽孢杆菌。所述的简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，其特征在于所述的富集培养基用的是LB培养基2. 0-200. O mg/lN02_-N/N03—N ;所述的LB培养基(g/Ι):胰蛋白胨
10.0，氯化钠 5.0，酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，灭菌 25_30min。本发明的有益效果
目前现有技术在分离反硝化细菌多用BTB培养基，利用反硝化过程中碱的特性，利用培养基中BTB (溴百里酚蓝)指示剂在PH值> 7. 6显示蓝色，来间接判断有反硝化细菌的有无。其培养基组份较复杂，且营养不全面，富集培养时间长，无针对性快速分离好氧反硝化芽孢菌缺点；利用本发明的方法，具有培养基组成简单(一般的化验室条件均有条件)，营养全面，且有促生长因子故富集培养时间短，用针对性的显色剂喷涂，更直观。初筛中加入水浴环节能有效提高芽孢菌的检出率，大大降低在筛选目标菌株的工作量。应用定性与定量的方法相给合，使得工作效率更快。总之，本发明方法具有简易、快速、直观、高效分离具有好氧反硝化能力芽孢杆菌的的特点，为生物脱氮技术提供了一个新的途径。

养基中，进行间歇增氧富集培养；移取适量富集培养物75-80°C水浴杀除杂菌后，稀释涂布于含N02—-N/N03一N梯度平板培养；然后对培养后的平板进行喷涂N02—-N/N03一N显色液，挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株；接着利用纯培养物菌体在不同N02_-N/N03一N浓度的培养基中，恒温间歇增氧培养，测定其0D600nm吸光度值，以定量的确定芽孢杆菌所适应的N02--N/N03一N浓度范围；在确定的适中的N02--N/N03一N浓度下，用含有N02--N/N03一N的液体富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，通过测定液体富集培养基中N02—-N/ N03—N含量，以求解其去除率，复筛出好氧反硝氧能力强劲的芽孢杆菌。
所述的富集培养基用的是LB培养基+2. 0-200. O mg/lN02_-N/N03一N ;所述的LB培养基(g/Ι):胰蛋白胨 10. 0，氯化钠 5. O,酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，灭菌 25_30min。制作N02—-N/N03一N梯度平板取IOml LB琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。等凝固后，再将平皿平放，再加入含有一定浓度的N02—-N/N03一N的LB琼脂培养基10 ml.凝固后，便得到N02—-N/ N03一N从设定浓度到O逐渐递减的浓度梯度的培养皿。上层培养基越厚，N02—-N/N03一N的浓度越高(也可在培养皿底部用“一”作N02—-N/N03一N浓度递增标识)。N02—-N/N03一N取值
2.0-200. O mg/1，所述的LB琼脂培养基在LB培养基的基础上加入I. 5-2. 0%琼脂粉或琼脂条，121°C，灭菌 25-30min。在制作好的梯度平板上涂布培养目标物14-48hr后，喷涂N02:N/N03一N显色液， 挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株。根据目标菌株所在梯度平板中所在的位置与数量，便可大致知道该菌株的N02N/N03一N的耐受范围。所述的N02二N/ N03-N显色液为
N02一- N显色液(格里斯氏试剂)配制
A液对氨基苯磺酸O. 5 g,稀醋酸(10%左右)150ml B液a-萘胺O. I g,蒸馏水20 ml,稀醋酸(10%左右)150ml 临用前将A、B液混合。所述的N03一- N显色液(二苯胺试剂)配制
取二苯胺O. 5 g溶于IOOml浓硫酸中,用20ml蒸懼水稀释。所述的革兰氏染色法所用试剂
结晶紫染色液
A液结晶紫2. Og, 95%乙醇20ml,
B液草酸铵O. 8g,蒸懼水80ml,
混合A、B液，静置48h后过滤使用，
碘液碘I. 0g，碘化钾2. 0g，蒸馏水300ml。先用少量(3_5 ml)蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘片，待碘片溶解后，加水稀释到300ml。脱色液95%乙醇。O. 5%番红复染液取2. 5%番红乙醇液20ml，蒸馏水80ml，混匀。革兰染色的方法步骤
A制片在一洁净载玻片上加蒸馏水一滴，然后用接种环挑取少许菌苔与水滴涂布混匀，制成薄薄的细菌涂片，而后在酒精灯的火焰上通过3-4次，使细菌固定在载玻片上。B 染色
(O结晶紫染色用结晶紫混合液(加量以覆盖菌膜为度)，染lmin，水洗并除尽水滴。(2)媒染滴加路哥尔氏碘液，染lmin，水洗并吸干水滴。(3)脱色滴加95%乙醇脱色，流滴到洗脱液无色，维持25-30S，立即水洗终止脱色。(4)复染滴加沙黄染色剂，染色lmin，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。C镜检用油镜观察上述涂片菌体深紫色为G+菌；菌体红色G_菌。注意事项当染色结果可疑时，以金色葡萄球菌为G+对照菌；以大肠埃希氏菌 G_对照菌.
芽孢的有无，形状、大小及其在体内的位置均是鉴定细菌的重要依据。本专利选用的孔雀绿染色法(制片一染色一镜检)。芽孢孔雀绿染色法所用试剂5%孔雀绿染色液，O. 5%沙黄染色液芽孢孔雀绿染色法染色步骤(I)制片在一洁净载玻片上加蒸馏水一滴，然后用接种环挑取待染色的纯培养物菌落一环，与水滴混匀，制成薄薄的细力涂片，而后在酒精灯的火焰上通过3-4次，使细菌固定在载玻片上。(2)染色:
A加孔雀绿染色液
加染色液于涂片处(染料以覆盖涂片为度)，然后将玻璃放在搁架上，再将搁架放在三角铁架上，用微火加热至染料冒蒸汽时开始计时，维持5min.在加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。B 水洗
待玻片冷却后，用洗瓶中的自来水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。C 复染
用沙黄液染色2min。D水洗自来水冲洗，吸干。(3)镜检结果芽孢为绿色，菌体与芽孢囊为微红色。将选出的好氧反硝化菌株接种到不同N02__N/N03一N浓度的LB培养基中，恒温间歇增氧培养，测定其吸光度A600，确定其生长不受影响的浓度范围；设计N02_-N/N03一N的降解实验进行衡量检测。在适中的N02__N/N03一N浓度下，用富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，培养24、48、72、96h后分别测定培养液中N02__N/N031含量，以求解其去除率，去除率的求解公式为
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好氧反硝化能力测试培养基配方
LB 培养基+2. 0-200. O mg/1 N02二N/N03一N，PH 7. 0-7. 3，115°C，灭菌 25_30min.
培养条件10-45°C，120-150R/MIN恒温培养14_48hr，振荡器增氧时间间隔为12小时。亚硝态氮(N02一N)检测方法N-(1-萘基)_乙二胺分光光度法(GB7493-87)。硝态氮(N03一N)检测方法紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)。实例2 :养殖池塘底池中好氧反硝化芽孢杆菌的筛选 I、富集培养
将养殖池塘取得的塘池样品混合均匀后接1%的接种量接入含用N02--N/N03 — N浓度为2. Omg/1富集培养基中，培养液为100ml，然后30°C，120-150r/min的摇床中间歇增氧恒温富集培养，间歇增氧时间为12h ;富集48h后将培养物混合均匀，以2%接种量转接到 N02--N/N031浓度20. Omg/1的富集培养基内，培养液为100ml，间歇增氧富集48小时；最后将第二次富集的培养液混均后以5%接种量转接到N02—-N/N03一N浓度200. Omg/1的富集培养基内，培养液为100ml，间歇增氧富集48小时；总共富集培养3代，历时6天。2、初筛
水浴将富集好的培养物混合均匀后取I. 0-2. Oml移入于灭过菌的试管，将其置于75-80°C水浴5-10min，利用芽孢杆菌的芽孢能耐高温的特性，以清除不耐高温的微生物。这样目标性更强，大大减少后面分离目标菌株的工作量。涂布N02__N/N03—N梯度平板将水浴后的富集培养物，进行适当倍数稀释，然后涂布于N02—N/N03—N梯度平板中，涂布后的平板倒置于30°C恒温培养箱中，培养2天；从喷涂显色后的N02—-N/N03一N梯度平板中高N02—-N/N03一N浓度区域挑选挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落根据形态不同加以分类；然后对形态不同的菌落分别加以划线分离，将划线后的平板倒置30°C恒温培养箱中，培养2天，直到所有菌落形态完全一致。染色镜检对提纯后的菌株，选取菌落形态典型者(接种后恒温培养12-18h)进行革兰氏染色后镜检，选取菌体形态一致，呈杆状，革兰氏染色阳性，内生芽孢，无杂菌者加以试管斜面保存，以便复筛之用。3、复筛
富集培养基生长情况测定
设计不同的N02_-N/N03—N浓度富集培养基，分别接入初筛的菌株，培养24h后，测定其在0D600nm吸光度值，以定量地确定每株芽孢杆菌所适应的N02—-N/N03一N浓度范围。好氧反硝化能力的测定
在适中的N02_-N/N03一N浓度下，用富集培养基，分别培养不同的好氧反硝化芽孢杆菌， 培养24、48、72、96h后分别测定培养液中N02—-N/N03一N含量，计算出其去除率。结果初筛得4株芽孢菌，复筛得到I株96h能将100mg/l N02—-N降解为Omg/1 N02—-N的好氧反硝化芽孢菌。实例3
养殖池塘水样中好氧反硝化芽孢杆菌的筛选 I、富集培养
将养殖池塘水下50cm处取得的池水样品混合均匀后接1%的接种量接入含用N02_-N/ N03一N浓度为2. Omg/1富集培养基中，培养液为100ml，然后在37°C恒温，120_150r/m的摇床中间歇增氧富集培养培养，间歇增氧时间为12h ;富集48h后将培养物混合均匀，以2% 接种量转接到N02—-N/N03一N浓度20. Omg/1的富集培养基内，培养液为100ml，间歇增氧富集48小时；最后将第二次富集的培养液混均后以5%接种量转接到N02_-N/N03一N浓度 200. Omg/1的富集培养基内，培养液为100ml，间歇增氧富集48小时；总共富集培养3代， 历时6天。2、初筛
水浴将富集好的培养物混合均匀后取I. 0-2. Oml移入于灭过菌的试管，将其置于 75-80°C水浴5-10min，利用芽孢杆菌的芽孢能耐高温的物性，以清除不耐高温的微生物。这样目标性更强，大大减少后面分离目标菌株的工作量。涂布N02__N/N03一N梯度平板将水浴后的富集培养物，进行适当倍数稀释，然后涂布于N02_-N/N03一N梯度平板中，涂布后的平板倒置于37°C恒温培养箱中，培养2天后； 从喷涂显色液后的平板中高N02_-N/N03—N浓度区域选挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落根据形态不同加以以分类；然后对不同菌落类型的菌落分别加以划线分离，将划线后的平板倒置30°C恒温培养箱中，培养2天，直到菌落形态完全一致。镜检对提纯后的菌株，选取菌落形态典型者(接种后恒温培养12-18h)进行革兰氏染色后镜检，选取菌体形态一致，内生芽孢，无杂菌者加以试管斜面保存，以便复筛之用。3、复筛
富集培养基生长情况测定
设计不同的N02_-N/N03—N浓度富集培养度基，分别接入初筛的菌株，培养24h后，测定其在0D600nm吸光度值，以定量的确定每株芽孢杆菌所适应的N02__N/N03一N浓度范围。好氧反硝化能力的测定
在适中的N02_-N/N03一N浓度下，用富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，培养24、48、72、96h后分别测定培养液中N02—-N/N03一N含量，以求解其去除率。结果初筛得2株芽孢菌，复筛得到I株能在96h内将40mg/l N02:N降解为Omg/ I N02—-N的好氧反硝化芽孢菌。


本发明公开了一种分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，对目标物取样进行间歇增氧选择性富集培养，然后对富集培养物进行水浴后，稀释涂布梯度NO2--N/NO3—N平板，以利用NO2--N/NO3—N与相应的显色剂显色的特点，从喷涂显色液后的平板中高NO2--N/NO3—N浓度区域选取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，快速筛出好氧反硝化菌；通过划线法得到纯培养菌株，接着对纯培养物进行染色镜检，以初筛选出具有好氧反硝化能力的芽孢杆菌；最后根据纯菌株在不同NO2--N/NO3—N浓度的富集培养基的生长情况以确定适宜的NO2--N/NO3—N浓度，设计好氧反硝化降解试验复筛出高效好氧反硝化能力的菌株。本发明方法具有快速分离、提纯出高效好氧反硝化的芽孢杆菌的特点，为生物脱氮技术提供了一个新的途径。