专利名称：检测同型半胱氨酸代谢相关snp位点的试剂盒及其扩增方法和检测方法同型半胱氨酸(HCY)，或称为高半胱氨酸或同半胱氨酸，是从S-腺苷基甲硫氨酸透过两个反应步骤途径形成，并能回转成甲硫氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸或牛磺酸。缺乏维他命如叶酸、VB6或VB12，HCY水平都会上升。补充叶酸、VB6、VB12或三甲基甘氨酸会减少血液内的HCY的浓度。高水平的HCY与心脑血管疾病，胎儿发育异常，肿瘤发生等密切相关。叶酸，HCY的代谢中相关酶基因的突变将导致酶活性的降低，使HCY水平上升。MTHFR编码的四氢叶酸还原酶是叶酸和HCY代谢过程中关键酶，能将5，10-亚甲基四氢叶酸装变为5-甲基四氢叶酸，从而参与甲硫氨酸代谢循环和DNA甲基化。正常的MTHFR活性能保持叶酸和甲硫氨酸循环的有效性，维持体内HCY的正常水平，C677T多态使酶活性显著降低，导致5-甲基四氢叶酸生成障碍，引起HCY血症。MTR编码的5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶，是一种维生素B12依赖的甲硫氨酸合酶，催化甲硫氨酸生物合成的最后一步，由进入细胞内的5-甲基四氢叶酸提供甲基，催化HCY再甲基化生成甲硫氨酸，MTR基因2756A/G突变导致919位氨基酸由天冬氨酸转为甘氨酸，引起MTR功能障碍，导致HCY再甲基化途径受阻，体内HCY水平和甲硫氨酸循环异常。MTRR基因是甲硫氨酸合成酶的辅助因子，催化甲钴胺再生，其常见的多态性66A/G会导致甲硫氨酸被异亮氨酸所取代，因此对于维持甲硫氨酸和四氢叶酸及HCY在体内正常水平有重要作用。CBS是磷酸吡哆醛酶，是体内HCY分解代谢的关键酶，在其催化下与丝氨酸缩合成胱硫醚，进一步代谢为半胱氨酸和α -酮丁酸随尿液排出体外，T833C位点突变是其最常见突变位点，使异亮氨酸代替278位的苏氨酸，引起CBS结合位点的构象变化，造成CBS缺陷，进而影响体内HCY的代谢，导致HCY的升高。
同型半胱氨酸代谢相关酶MTHFR、MTR、MTRR和CBS的基因遗传多态性直接或间接影响同型半胱氨酸在体内的代谢过程。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒及其扩增方法和检测方法。 本发明采用的技术方案:一种检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒，所述试剂盒能同时对MTHFR基因rsl801133 SNP位点、MTR基因rsl805087 SNP位点、MTRR基因rsl801394 SNP位点和CBS基因rs5742905SNP位点的四个SNP位点进行分型检测检测。所述试剂盒包括检测MTHFR基因rsl801133位点的两个正向引物及一个反向引物、检测MTR基因rs 1805087 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测MTRR基因rsl801394 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物和检测CBS基因rs5742905 SNP位点的两个正向引物所述检测MTHFR基因rsl801133位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型弓I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG正向突变型弓I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA反向共用弓 I 物:TGCTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCC所述检测MTR基因rsl805087位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGT正向突变型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGC反向共用引物:CCAGTCCCTTCTTTGGCTTGTGCAG所述检测MTRR基因rsl801394位点的引物喊基序列如下所不:正向野生型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAT正向突变型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAC反向共用引物:TGTGGCTCAAGTTTTGTTCAGGTTCTTG所述检测CBS基因rs5742905位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAA正向突变型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAG反向共用引物:TTGGGTTTCTCATCCTGCCTCTGAGG。所述的检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对4个目的片段和I个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是:内对照733bp，MTRR rsl801394515bp, MTR rsl805087 319bp, CBS rs5742905 193bp, MTHFR 基因 rsl801133 123bp ;扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断4个SNP位点的基因型。所述的检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤:预变性由I次循环构成,其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94°C，时间为30秒；退火:温度为56 °C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒； 扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对4个包含SNP位点的DNA片段和I个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2X扩增缓冲液，使用者只需加入全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本发明的试剂盒 所提供的野生型和突变型2X扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loadingbuffer,避免人为错误。反向共用引物:TGTGGCTCAAGTTTTGTTCAGGTTCTTG所述检测CBS基因rs5742905位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAA正向突变型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAG反向共用引物:TTGGGTTTCTCATCCTGCCTCTGAGG本发明试剂盒的组分和含量包括:细胞裂解液，野生型2 X扩增缓冲混合液，突变型2 X扩增缓冲混合液，聚合酶，液体石蜡油。本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例检测试剂盒的使用步骤1:全血基因组DNA的提取取受检者外周静脉血300 μ 1，加入700 μ I细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心I分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加Λ 300 μ I双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。步骤2 =PCR扩增反应1、配置野生型反应体系:PCR管内加入细胞裂解悬液4.8 μ 1、加入5 μ 12Χ野生型扩增缓冲液和0.2 μ I聚合酶(2.5U/ μ I)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，最后沿管壁轻轻加入20 μ I液体石蜡油封闭体系，具体见下表:


本发明公开了一种利用多重PCR技术结合SNP敏感性分子开关技术检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的检测试剂盒及其扩增方法和检测方法。所述试剂盒对同型半胱氨酸代谢相关的四个SNP位点进行分型，包括MTHFR基因rs1801133 SNP位点、MTR基因rs1805087 SNP位点、MTRR基因rs1801394SNP位点和CBS基因rs5742905 SNP位点。所述试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶、细胞裂解液和甘油，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述四个SNP位点的分型，从而了解受试者同型半胱氨酸代谢能力和叶酸、VB12和VB6需求。