专利名称：治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法心脑血管疾病如冠心病心绞痛是中老年人的常见病、多发病。系指冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉供血不足，心肌急剧的暂时的缺血缺氧引起的胸骨后疼痛。属于中医的“胸痹”、“心悸”、“真心痛”等范畴。本病常反复发作，缠绵难愈，严重危害着人们的身体健康。为了达到防治目的，许多发明人及药品企业做了大量的研究，也提供了一些治疗的产品；如本申请人申请名称为“治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法和应用”的专利申请，它采用了红花、灯盏细辛有效部位配伍用于治疗心脑血管方面的疾病有确切的疗效；但是在深入研究中发现，采用有效部位的脂质体制剂更适合于生物体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是脂质体作为药物载体，具有靶向性，从而减小药物剂量，降低毒性，减少副作用等。
本发明的目的在于提供一种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法和应用；本发明针对现有技术，根据心脑血管疾病如冠心病、脑血栓、老年性痴呆等均因血管窄缩、血流量减少等原因致使供血不足引发疾病的原理，在实验筛选的基础上，采用灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体配伍做成制剂，优选出最佳的组方及工艺；得到的产品，特别是注射制剂产品能起到活血化淤、通脉舒络、改善血循环和代谢作用。例如冠心病是冠状动脉粥样硬化导致心肌缺血，缺氧而引起心脏病，两药合用，可起到改善心肌代谢作用、增加冠状动脉血流，改善心肌的血供以缓解心绞痛的作用。本发明对于治疗心脑血管疾病如冠心病、心绞痛、心律失常、脑血栓、老年性痴呆等有较好的疗效。而且本发明为脂质体作为药物载体，具有靶向性，从而减小药物剂量，降低毒性，减少副作用，其不良反应小、可供病人长期使用。本发明是这样构成的按照重量百分比计算，它是由灯盏细辛总黄酮脂质体或前体脂质体1～99％和红花总黄酮脂质体或前体脂质体99～1％和适当的辅料制作而成。优选为按照重量百分比计算，它是由灯盏细辛总黄酮脂质体或前体脂质体20～80％和红花总黄酮脂质体或前体脂质体80～20％和适当的辅料制作而成。准确的说按照重量百分比计算，它是由灯盏细辛总黄酮脂质体或前体脂质体40～60％与红花总黄酮脂质体或前体脂质体60～40％和适当的辅料制作而成。所述组方中的灯盏细辛总黄酮脂质体或前体脂质体可以是在灯盏醇提取物、灯盏水提取物、灯盏水提醇沉提取物、灯盏半仿生提取物、灯盏超临界萃取物或者以上各提取物的精制品的基础上制得；红花总黄酮脂质体或前体脂质体可以是在红花醇提取物、红花水提取物、红花水提醇沉提取物、红花半仿生提取物、红花超临界萃取物或者以上各提取物的精制品的基础上制得。所述的制剂可以是药剂学上任何可以接受的剂型直接用于注射给药的注射液、直接供静脉滴注的静脉输液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液和用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得的注射用无菌粉末和无菌块状物以及片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、丸剂、软胶囊剂、口服液体制剂、口腔崩解片、舌下片或分散片剂。按照重量百分比计算，灯盏细辛总黄酮中总黄酮的含量不低于50％，红花总黄酮中总黄酮的含量不低于50％，脂质体包封率不低于60％。所述脂质体的制备方法是红花总黄酮脂质体和灯盏细辛总黄酮脂质体是采用薄膜法、硫酸铵梯度法、逆相蒸发法、溶剂注入法、去污剂分散法、钙融合法、冻结融解法、主动包封法、冷冻干燥法、复乳法、离心法、前体脂质体法、制备脂质体气雾剂中的一种或几种方法制得的。
所述制剂中的脂质体这样制备按主药∶卵磷脂＝1∶10的比例取卵磷脂，按主药∶磷脂酰甘油＝1∶1.2的比例取磷脂酰甘油，溶于氯仿一异丙醇的混合溶液中；另取红花总黄酮溶于pH5-8的磷酸盐缓冲液中，两相混合，水浴式超声8min后，于旋转蒸发仪中除去有机溶剂即得脂质体混悬液，同法制备灯盏细辛总黄酮脂质体混悬液，与红花总黄酮脂质体混悬液混合后以不同的方法制成各种制剂。
所述制剂中的前体脂质体这样制备取磷脂和辅料加一定量无水乙醇溶解，在恒温搅拌的条件下以一定速度注入灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液中，继续恒温搅拌，降至室温，匀浆，膜过滤，灌装，充氮气，封口；将所得脂质体放入液氮中，冷冻后取出；室温使之溶，重复一次即得灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮前体脂质体，将灯盏细辛总黄酮前体脂质体和红花总黄酮前体脂质体混合后以不同的方法制成各种制剂。
所述制剂中的分散片这样制备取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，按主药∶辅料＝1.4∶1的比例加入磷酸钙，按主药∶辅料＝1.2∶1的比例加入微粉纤维素，以及按主药∶辅料＝3∶1的交联聚乙烯吡咯烷酮，混和均匀，用70％乙醇适量制软材，过20目筛制颗粒，55℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量滑石粉、微粉硅胶，混和均匀，压片，即得分散片。
与现有技术相比，本申请人进行过大量实验研究，筛选出治疗冠心病心绞痛等疾病的处方为灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体，最佳配伍比例为灯盏细辛总黄酮脂质体40％～60％与红花总黄酮脂质体60％～40％。采用本发明的工艺制备产品外观良好、质量稳定。
为证明本发明提供的药物具有有效的效果，申请人进行了一系列实验实验例1对不同配比药效学比较研究我们通过抗血小板聚集试验、抑制小鼠尾血栓形成试验，对不同比例的处方进行了系统的筛选试验，结果如下

由实验结果可知，灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体最佳配伍范围为红花总黄酮脂质体40～60％与灯盏细辛总黄酮脂质体60～40％。
实验例2脂质体制备方法研究2.1脂质体的制备方法的考察2.1.1逆向蒸发法取大豆卵磷脂100mg，胆固醇60mg溶于20mL乙醚中，置于锥形瓶中。以pH5-8的磷酸盐缓冲液为溶剂配制1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，电磁搅拌下，将1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液15mL缓缓滴入锥形瓶中，搅拌使与乙醚形成乳浊液，减压蒸馏1h将乙醚蒸除，得脂质体。
2.1.2乙醚注入法以pH5-8的磷酸盐缓冲液为溶剂配制1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，取15mL于锥形瓶中。将大豆卵磷脂100mg、胆固醇60mg溶于6mL乙醚中。电磁搅拌下，缓缓将乙醚溶液用五号针头(针尖在液面以下)均匀后加热65℃，挥发除去乙醚，得脂质体。
2.1.3薄膜法大豆卵磷脂100mg，胆固醇60mg溶于20mL乙醚中，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，在梨形瓶中形成均匀的磷脂膜，加15mL含1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮的pH5-8的磷酸盐缓冲液，浸泡，搅拌洗脱脂质膜，可得脂质体。
2.1.4硫酸铵梯度法取大豆卵磷脂100mg，胆固醇60mg溶于20mL乙醚中，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，在梨形瓶中形成均匀的磷脂膜，于真空干燥箱中干燥后，加入20mL硫酸铵溶液浸泡洗脱脂质膜。将制备的空白脂质体用探头超声细胞破碎器破碎后，装入透析袋中(约10mmol·L-1)，放入0.9％氯化钠溶液中透析48h，取出透析后的空白脂质体，加入15mL1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，置于60℃水浴中孵化10min，得脂质体。
2.2包封率测定采用透析法测定脂质体包封率。各取上述几种方法制备的脂质体5mL置于透析袋中，分别置50mL烧杯中，精密加入磷酸缓冲液45mL浸泡，每隔2h搅拌15min。12h后取浸泡液2.5mL置于25mL容量瓶中，加pH5-8磷酸盐缓冲液定容。以pH5-8磷酸盐缓冲液为空白在274nm处测吸收度。同步，取5mL1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液于透析袋中透析，作为空白药物对比，采用包封率计算公式包封率＝(C总-C游离)/C总×100％其中C总为脂质体混悬液中总药量，C游离为未包入脂质体中药物量。结果见下表。

结果由实验结果可知，灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体采用逆向蒸发法的包封率较高，因此确定逆向蒸发法为本制剂的脂质体制备方法。
实验例3制剂药效学实验大鼠冠状动脉结扎引起心肌梗死的影响取雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组，即假手术对照组、模型对照组、灯盏细辛总黄酮-红花总黄酮注射液0.3g/kg组、本发明口服液0.3g/kg组、本发明注射剂0.3g/kg组，每组10只，各组分别给药，每日1次连续3天。末次给药后1h，以戊巴比妥麻醉，气管插管，人工呼吸。于第3～4肋间开胸，距冠状动脉出口5mm处结扎冠状动脉左前降支，造成闭塞性冠脉区心肌梗死。于4h后用电磁流量计测定冠状动脉血流量，并测定梗死区面积百分比。结果见下表，用药组的冠脉流量显著增加，并且梗死区面积明显减小。

由实验结果可知，本发明药物制剂对冠状动脉闭塞引起心肌缺血情况可以显著增加冠脉流量，明显减小心肌梗死区面积，并且在大大降低用量的情况下，疗效仍然优于灯盏细辛总黄酮、红花总黄酮普通注射液。
具体的实施方式实施例1灯盏细辛总黄酮脂质体50g红花总黄酮脂质体50g取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，将混悬液置于-20℃冰箱中预冻12h，最后经冷冻干燥后即得冻干粉针剂。静脉注射，一日一次，一次一支。
实施例2灯盏细辛总黄酮脂质体40g 红花总黄酮脂质体60g取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，滤过，加注射用水，分装到安剖瓶，封口灭菌，即得注射液和注射用浓溶液。
实施例3灯盏细辛总黄酮脂质体60g红花总黄酮脂质体40g取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，将所得混悬液填充在软胶囊中，即得软胶囊。
实施例4灯盏细辛总黄酮脂质体80g红花总黄酮脂质体20g取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，将所得混悬液与预胶化淀粉混合，用聚乙吡咯烷酮的乙醇液为粘合剂制粒，干燥后整粒，再与适量聚乙二醇6000混合均匀，压片即为片剂。
实施例5灯盏细辛总黄酮脂质体20g红花总黄酮脂质体80g
取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，按主药∶辅料＝1.8∶1的比例加入磷酸钙，按主药∶辅料＝1.5∶1的比例加入微粉纤维素，以及按主药∶辅料＝3∶1的交联聚乙烯吡咯烷酮，混和均匀，用70％乙醇适量制软材，过20目筛制颗粒，55℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量滑石粉、微粉硅胶，混和均匀，压片，即得分散片。
实施例6灯盏细辛总黄酮脂质体1g 红花总黄酮脂质体99g取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，加入2.5倍量淀粉，0.4％的甜菊甙，1.4％的微粉纤维素，用适量乙醇溶液制软材，制粒，65℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。
实施例7灯盏细辛总黄酮脂质体99g红花总黄酮脂质体1g取灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体混合，将与主药比例是1.6∶1的硬脂酸钠置不锈钢容器内，混合均匀，加热至80-85℃，待全部熔融后，70-75℃保温，机械高速搅拌15min至均匀，转移至贮液瓶中，70～75℃保温，调节滴液阀门，滴入30～35℃的煤油中，滴距5～6cm，滴速40～45滴/分，将形成的滴丸沥尽并擦除煤油，包装，即得滴丸剂。
实施例8以上灯盏细辛总黄酮脂质体、红花总黄酮脂质体可以是市售的或是用以下方法制备的(1)逆向蒸发法取大豆卵磷脂100mg，胆固醇60mg溶于20mL乙醚中，置于锥形瓶中。以pH5-8的磷酸盐缓冲液为溶剂配制1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，电磁搅拌下，将1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液15mL缓缓滴入锥形瓶中，搅拌使与乙醚形成乳浊液，减压蒸馏1h将乙醚蒸除，得脂质体；(2)溶剂注入法(乙醚注入法)以pH5-8的磷酸盐缓冲液为溶剂配制1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮，取15mL于锥形瓶中。将大豆卵磷脂100mg、胆固醇60mg溶于6mL乙醚中。电磁搅拌下，缓缓将乙醚溶液用五号针头(针尖在液面以下)注入灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液中。搅拌均匀后加热至65℃，挥发除去乙醚，得脂质体；(3)薄膜法大豆卵磷脂100mg，胆固醇60mg溶于20mL乙醚中，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，在梨形瓶中形成均匀的磷脂膜，加15mL含1％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮的pH5-8的磷酸盐缓冲液，浸泡，搅拌洗脱脂质膜，可得脂质体；(4)硫酸铵梯度法取大豆卵磷脂100mg，胆固醇60mg溶于20mL乙醚中，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，在梨形瓶中形成均匀的磷脂膜，于真空干燥箱中干燥后，加入20mL硫酸铵溶液浸泡洗脱脂质膜。将制备的空白脂质体用探头超声细胞破碎器破碎后，装入透析袋中(约10mmol·L-1)，放入0.9％氯化钠溶液中透析48h，取出透析后的空白脂质体，加入15mLl％灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，置于60℃水浴中孵化10min，得脂质体；(5)冻结融解法取磷脂和辅料加一定量无水乙醇溶解，在恒温搅拌的条件下以一定速度注入灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液中，继续恒温搅拌，降至室温，匀浆，膜过滤，灌装，充氮气，封口。将所得脂质体放入液氮中，冷冻后取出。室温使之溶，重复一次即得；(6)冷冻干燥法取豆磷脂2.0g，胆固醇0.5g用适量乙醇在80℃熔融，加入pH5-8磷酸盐缓冲液，待乙醇自然挥尽后转移至组织捣碎机中，高速搅拌10min，过滤，火菌，超声15min，在无菌条件下，加入灭菌灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮注射原料1.0g及灭菌甘露醇2.0g溶解，灌装于安瓶中，冷冻干燥成冻干脂质体；(7)钙融合法7umol的磷脂酰丝氨酸(PS)制成薄膜后，用1.5ml生理盐水水合，超声波处理5min。取出0.25ml加入到20mmol/L的等量的氯化钙溶液中混合，37℃孵育80min。生成的卷桶状物1800g离心10min，取沉淀加入灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液后孵育15min。随后加入45mmol/L含有EDTA的生理盐水缓冲液0.25ml孵育50min，即得脂质体；(8)主动包封法以pH为4的300mmol/L枸橼酸水溶液为介质，采用逆相蒸发法或薄膜法制备空白脂质体。用1mol/L的氢氧化钠或碳酸钠溶液调节空白脂质体混悬液的pH至7.8，使脂质体膜内外形成质子的梯度，即得到脂质体膜的内部为酸性，外部为碱性的脂质体。将灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液pH5-8的磷酸盐缓冲液溶解，65℃孵育。在65℃孵育条件下，将脂质体混悬液与灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液混合并轻摇，孵育12min即得；(9)复乳法按摩尔比为7∶2.2∶1.5取磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Ch)和磷脂酸(PA)，将它溶于有机溶剂，加入一定的灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，置高速组织捣碎机(10000r/min)乳化10min，再加入磷酸盐缓冲液(pH5-8)，再一次高速乳化(8000r/min)，得乳状液。在减压通氮条件下，除去有机溶液，即得；(10)离心法将80mg磷脂溶于5ml二丁醚中，加入灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液的氯化钠溶液0.2ml。超声处理得透明溶液，移置有20ml相同渗透压的氯化钠溶液的离心管中，用3000r/min离心30min，除去上层有机溶剂，下层则为含有脂质体的氯化钠溶液。经大孔树脂吸附未包封的灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮，即得脂质体；
(11)制备脂质体气雾剂5ml灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液，280mg/ml卵磷脂乙醇液及6.0g的二氯二氟甲烷混合成有机相，含有7％乙醇50ml水为水相，每次阀门放出50ul有机相及水相，即得。
实施例9以上灯盏细辛总黄酮前体脂质体、红花总黄酮前体脂质体可以是市售的或是用以下方法制备的(1)冻融法取磷脂和辅料加一定量无水乙醇溶解，在恒温搅拌的条件下以一定速度注入灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮溶液中，继续恒温搅拌，降至室温，匀浆，膜过滤，灌装，充氮气，封口。将所得脂质体放入液氮中，冷冻后取出。室温使之溶，重复一次即得；(2)喷雾干燥法将精确称取的灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮、大豆磷脂和胆固醇共同溶于氯仿中，过滤，滤液收集于圆底烧瓶中，旋转蒸发挥去氯仿成薄膜，真空干燥后，加入pH5-8的磷酸盐缓冲液，浸泡2-8h，然后在氮气流保护下高速搅拌，一定时间后，向其中缓慢滴加同样缓冲液溶解的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和蔗糖溶液，继续搅拌，并补足缓冲液至150mL，然后将脂质体混悬液用微孔滤膜过滤，滤液在氮气保护下罐封，即得灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮脂质体。采用喷干法，实验条件为进风温度125℃，进料速度60mL/min，旋风分离器压差55mmH20，雾化盘转速2700r/min；(3)旋转蒸发法分别称取卵磷脂、胆固醇、VE，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等溶于适量氯仿并收集于茄形烧瓶中，置水浴上，用旋转蒸发器减压挥去氯仿成膜后加灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮磷酸缓冲液。浸泡薄膜后。在频率35kHz、强档工作状态下超声，即得灯盏细辛总黄酮或红花总黄酮脂质体混悬液。取甘露醇等置于150ml茄形烧瓶中，持续减压蒸发至干燥，取出置于真空干燥器中室温减压过夜，彻底干燥后氮气下分装，即得。
实施例10灯盏细辛总黄酮、红花总黄酮可以是市售的，或是用以下方法制备的(1)灯盏细辛药材，加入5～15倍体积50～80％乙醇回流提取1～4次，每次0.5～2.5小时，合并提取液，减压回收溶剂至60℃时测定相对密度为1.05～1.15，加入1～4倍量乙酸乙酯，振摇萃取1～8次，合并乙酸乙酯液，减压回收溶剂至60℃时测定相对密度为1.05～1.15，干燥得灯盏细辛总黄酮；(2)灯盏细辛药材，加入5～15倍体积50～80％乙醇回流提取1～4次，每次0.5～2.5小时，合并提取液，减压回收乙醇至60℃时测定相对密度为1.05～1.15，加入1-5倍药材体积的水加热溶解，过滤，滤液以0.3-0.8ml/g药材.min的速度过AB-8型大孔吸附树脂，依次用1-10倍树脂体积水和1-6倍树脂体积5-15％乙醇冲洗杂质，然后用1-7倍树脂体积的30-70％乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇至60℃时测定相对密度为1.05～1.15，干燥得灯盏细辛总黄酮；(3)红花加5-15倍水煎煮1-4次，每次0.5-2.5小时，收集提取液，过滤，滤液浓缩至60℃时测定相对密度为1.05～1.15，加入1～5倍体积乙酸乙酯，萃取1～6次，合并乙酸乙酯液，减压回收溶剂至60℃时测定相对密度为1.05～1.15，干燥得红花总黄酮；(4)红花加5-15倍水煎煮1-4次，每次0.5-2.5小时，收集提取液，过滤，滤液以0.3-0.8ml/g药材.min的速度过聚酰胺层析柱，用3-8倍树脂体积水和2-6倍树脂体积5-25％乙醇洗脱杂质，然后用2-7倍树脂体积40-70％乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇至60℃时测定相对密度为1.10～1.20，得红花总黄酮。


本发明提供了治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法，它用灯盏细辛总黄酮脂质体或前体脂质体、红花总黄酮脂质体或前体脂质体与辅料制作成注射制剂或口服制剂。与现有技术相比，本发明采用灯盏细辛总黄酮和红花总黄酮的脂质体或前体脂质体作为药物载体，具有靶向性，药物用量少，毒性低，副作用小。