专利名称：尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)在西方发达国家是导致终末期肾衰 (end-stage renal disease, ESRD)的首要病因。在我国，DN也是仅次于肾小球疾病而导致 ESRD的第二位病因。DN的发病机制目前尚未完全阐明。足细胞是一类附着于肾小球基底膜上的高度分化的上皮细胞，参与维持滤过屏障的完整性。最近大量研究证实，足细胞损伤在DN发病及进展过程中发挥极为重要的作用。足突融合、足细胞肥大、凋亡、脱落，以及足细胞上皮间充质转分化都是可能参与DN发展的机制。因此，检测足细胞特异性表达的蛋白及基因已成为研究DN的一种方法。目前，肾穿刺以及免疫组化技术是研究足细胞标志分子的常规方法，然而肾穿刺作为一项创伤性检查，具有穿刺后出血、感染等不可避免的操作风险，且无法对患者进行连续动态观察。因此，需求无创、动态监测患者足细胞特异分子表达改变的技术成为研究热点ο实施荧光定量PCR(real-time quantitive PCR)作为一项成熟可靠的技术以其高灵敏度、高特异性及稳定性而广发用于各项分子生物学研究。尿液中蕴藏着大量生物学信息且具有无创收集、标本处理相对简便的优势，而目前尚无基于real-time PCR技术检测尿液足细胞特异性mRNA方法构建的报道。
本发明提供一种基于STOR GREEN I实时荧光定量PCR技术的尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法。本发明利用STOR GREEN I实时荧光定量PCR技术，建立尿液足细胞相关 mRNA (podocalyxin, CD2-AP)的检测方法，评估其检测范围及稳定性。本发明技术解决方案如下一种尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法，构建步骤为步骤1、尿液标本的收集留取晨尿200-300ml，将晨尿置于离心机上并在离心力为3000g、温度4°C 下，离心30分钟，弃上清，细胞沉渣重新悬浮于Iml焦碳酸二乙酯-PBS缓冲液(焦碳酸二乙酯与PBS缓冲液按体积比1 1000配制)，得到悬浮液，将悬浮液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4°C下，离心5分钟，弃上清，剩余沉渣中加入Iml RNAiso Plus，充分混勻，得到沉渣与RNAiso Plus的混合液；步骤2、总RNA提取步骤步骤2. 1将所述沉渣与RNAiso Plus的混合液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4°C下，离心5分钟，吸取上清液，转入新的离心管；步骤2. 2向由步骤2. 1获得的上清液中加入200ul氯仿，盖紧离心管，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化且分层现象消失后，再室温静置5分钟，得到混悬液；步骤2. 3将步骤2. 2得到的混悬液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4°C 下，离心5分钟；步骤2. 4取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；步骤2. 5向由步骤2. 4得到的上清液中加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混勻后，在15-30°C 下静置10分钟，得到混合液；步骤2. 6将步骤2. 5得到的混合液置于离心机上并在离心力为12000g、温度4°C下，离心5分钟；步骤2. 7弃去上清，沿离心管壁加入体积浓度为 75%的乙醇1ml，上下颠倒洗涤离心管，置于离心机上并在离心力为12000g、温度4°C下， 离心5分钟后弃去乙醇，得到RNA沉淀；步骤2. 8室温干燥RNA沉淀2_5分钟，加入30ul Rnase-free水，用移液枪吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度；步骤3、逆转录反应体系lug步骤2. 8所述的RNA溶液，4ul 5X PrimeScriptTM Buffer,Iul PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I,Iul Oligo dT Primer,Iul Random 6mers, dH20混勻至20ul，将反应体系升温至37°C，反应15分，再继续升温至85°C， 反应5秒，逆转录生成的cDNA置于-20°C保存；步骤4、引物设计与合成p0d0CalyXin forward 5’ -CTTGAGACACAGACACAGAG, reverse 5’ -CCGTATGCCGCACTTATC ；CD2-AP forward 5，-AGGCTGGTGGAGTGGAAC,，reverse 5’ -CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG ； β -actin forward 5，-TGGCACCCAGCACAATGAA, reverse 5，-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA ；步骤 5、实时荧光定量 PCR 反应PCR 反应体系2ul 由步骤 3 得到的 cDNA，10ul SYBR Premix Ex TaqTM, 0. 4ul 正义引物，0. 4ul反义引物，0. 4ul ROX Reference dye 以及6. 8ul dH20，采用两步法进行 PCR扩增①将PCR反应体系加热至95°C，反应30s，②在95°C下反应k后降温至60°C反应31s，并以95°C下反应k后降温至60V反应31s为一个循环，如此扩增40个循环，最后建立熔解曲线(dissociation curve, DC)并鉴定产物特异性；步骤6、准标准品制备及准标准曲线制作将步骤5获得的反应产物进行10倍梯度稀释后得到不同浓度的准标准品，将不同浓度的准标准品作为模板分别加入PCR反应体系进行PCR扩增，用准标准品浓度和Ct 值制作准标准曲线；步骤7、如果准标准曲线的线性相关系数大于0. 99，则将准标准品作为标准品，并进入8，否则，返回步骤6 ；步骤8、将待检测尿液进行步骤1 3的处理，得到待测cDNA，再分别对待测cDNA和步骤7得到的标准品进行步骤5所述的实时荧光定量PCR反应，制作标准曲线并根据标准曲线计算待测cDNA中各基因的含量，并与待测cDNA内参基因含量进行校正，最终得出各基因表达量。 发明的优点本发明可无创、动态检测糖尿病肾病患者尿液足细胞特异性mRNA， 且该方法标准品构建简便快速，灵敏度、特异性高，稳定性可靠。产生此优点的原因与以下因素有关1、标本的获得尿液标本可无创获得，收集处理过程简便，且尿液中含有大量来源于肾脏及泌尿道的脱落细胞，为研究提供了素材；2、本发明利用标准曲线法对待测基因进行相对定量。理论上待测样品总RNA、cDNA以及已知相对稀释度的DNA都可作为该定量方法的标准品。目前绝大部分研究采用的标准品来源为模板cDNA以及纯化的普通PCR产物。以模板cDNA倍比稀释作为标准品可能会受限于检测范围较小，而纯化PCR产物操作步骤较多且涉及到致癌试剂溴化乙锭的使用等。本发明标准品来源于预先扩增的目的基因的产物，较之目前常用标准品制备所需的琼脂糖电泳以及DNA回收提纯等操作步骤，具有快速简便的特征，并避免接触致癌试剂溴化乙锭；3、基于STOR GREEN I的实时荧光定量PCR 技术自身灵敏度及特性型高，稳定性好。图1为本发明的流程图。图2 为 podocalyxin 熔解曲线。图3为⑶2-AP熔解曲线。图4为β -actin熔解曲线。图5为podocalyxin检测范围及标准曲线。Podocalyxin在IO2-IO11倍稀释范围内标准曲线的斜率为-3. 52，相关系数r = 0. 9958。图6为⑶2-AP检测范围及标准曲线。⑶2-AP在IO3-IOki倍稀释范围内标准曲线的斜率为-3. 81，相关系数r = 0. 9992。图7DN患者及健康对照尿液podocalyxin水平差异比较。图8DN患者及健康对照尿液⑶2-AP水平差异比较
表1. podocalyxin及CD2-AP标准品批内变异。podocalyxin相对高浓度及低浓度标准品批内变异系数分别为0. 68%,0. 65% ；CD2-AP相对高浓度及低浓度标准品批内变异系数分别为0. 23%,0. 78% ；


一种尿足细胞特异信使核糖核酸聚合酶链反应检测方法的建立，其特征在于构建步骤为尿液标本的收集；总RNA提取及浓度纯度检测；逆转录；引物设计与合成；real-timePCR反应；标准品制备及标准曲线制作；待测样本及标准品real-time PCR反应。本发明具有快速简便的特征，且可获得优异的定量直线相关系数(R2＞0.99)。同时，所建立的方法检测浓度范围广，podocalyxin及CD2-AP分别跨10个及8个数量级，两种基因最低检测浓度所对应的Ct值分别可达35、33.2286。此外，利用该方法检测两种基因高浓度及低浓度模板Ct值的组间及批间差异均小于3％，提示该方法稳定性高，可重复性好。该方法的建立为快速、简便检测尿液足细胞特异性mRNA提供了稳定的技术平台。