专利名称：硫酸化岩藻半乳聚糖隆解酶基因的制作方法 褐藻包含多种含有硫酸化岩藻糖的多糖。例如，已知包含硫酸化岩藻糖的多糖例如(1)由岩藻糖和硫酸基团组成的硫酸化岩藻聚糖；(2)包含葡糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和硫酸基团的硫酸化岩藻葡糖醛甘露聚糖，例如WO 97/26896中描述的包含硫酸化岩藻糖的多糖-U(组成糖的大致摩尔比是岩藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸基团＝10∶7∶4∶5∶20；下文称为U-岩藻多糖)；和(3)由岩藻糖和半乳糖组成的硫酸化岩藻半乳聚糖，如WO 97/26896中描述的包含硫酸化岩藻糖的多糖-F(组成糖的大致摩尔比是岩藻糖∶半乳糖＝10∶1；下文称为F-岩藻多糖)，或者WO 00/50464中描述的包含硫酸化岩藻糖的多糖-G(组成糖的大致摩尔比是半乳糖∶岩藻糖＝2∶1；下文称为G-岩藻多糖)。几乎所有这些包含硫酸化岩藻糖的多糖都是大分子阴离子。因此，它们在各种纯化步骤中的化学行为和物理行为相似，使得难以将它们相互分离。由于这个原因，来自褐藻的包含硫酸化岩藻糖的多糖常常在未将它们相互分离的情况下测定生物活性。因此，难以鉴定出观察到生物活性的包含硫酸化岩藻糖的多糖。目前，已知以下多糖的活性与分子之间的相关关系如Agricultural and Biological Chemistry，44(8)1965-1966(1980)中所述的具有抗凝血活性的硫酸化岩藻聚糖部分，以及如WO 97/26896中所述的引起细胞凋亡诱导活性(对抗肿瘤细胞)的U-岩藻多糖。已经研究过使用硫酸化岩藻聚糖部分来取代肝素作为抗凝血剂。然而，为了将硫酸化岩藻聚糖用作药物，避免未预见到的活性引起的副作用，需要获得高纯度的硫酸化岩藻聚糖。因此，需要寻求用于此目的的方法。至于U-岩藻多糖，为了将其制备成药物，利用其细胞凋亡诱导活性对抗肿瘤细胞，相似地需要方便地获得高纯度的包含硫酸化岩藻糖的多糖-U。因此，需要寻求用于此目的的方法。一般地说，酶降解是多糖结构分析和寡糖生产所使用的最有效方法。此外，使用下面方法，从相互难以分离的多糖混合物中仅能容易地去除一种多糖。使用特异性降解待除去的多糖的酶将所述多糖转化为一种更小的分子。随后对所述混合物进行分子量分级分离，例如超滤。已有报道鲍鱼、扇贝、海胆、海洋微生物等生产降解包含硫酸化岩藻糖的多糖的酶。然而，在生物体中一般仅包含痕量的所述酶。此外，由于所述生物体具有多种包含硫酸化岩藻糖的多糖的降解酶，为获得一种酶需要各种纯化步骤。例如，使用酶活性作为指标，分离如WO 00/50464中所述的硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶，虽然还不清楚该酶是否被分离为单一蛋白。如上文所述，难以纯化和收集大量的单一并且天然存在的硫酸化岩藻糖的降解酶。此外，为了从海洋微生物中获取硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶，有必要在培养物中加入硫酸化岩藻半乳聚糖或包括硫酸化岩藻半乳聚糖在内的包含硫酸化岩藻糖的多糖。因此，存在培养程序复杂化和费用增高的问题。另外还存在以下问题。假如不能如上文所述获得足量的天然存在的硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶蛋白，那么几乎不可能获得有关该酶的氨基酸序列或核苷酸序列的信息。由于在N末端封闭酶蛋白，即使能够得到足量的所述酶蛋白，也无法获知关于N末端氨基酸序列的信息。此外，可能存在以下未曾预料到的问题。即使能够获得编码所述酶的基因，所述基因可能不被表达，或者由于所述基因与表达启动子或宿主之间的不匹配而导致表达水平低下。或者，由于形成内含体，可能无法获得保留酶活性的重组酶。
发明目的本发明的主要目的是提供编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因，所述多肽用作糖技术的试剂，用于对包含硫酸化岩藻糖的多糖的结构分析，或者用于从所述多糖制备更小的分子，以及提供使用遗传工程技术产生所述多肽的方法以及通过所述方法获得的多肽。
发明简述本发明的发明人为了揭示褐藻中包含的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的氨基酸序列和核苷酸序列，对来自微生物的产生硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶的基因进行了深入研究。结果本发明的发明人揭示来自黄杆菌属(flavobacterium)细菌的至少两个基因的存在并测定所述基因的核苷酸序列，所述基因编码各自具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。本发明的发明人还揭示所述多肽的氨基酸序列。此外，本发明的发明人已成功开发出具有工业价值的使用所述基因生产各种具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的方法。由此，本发明得以完成。
本发明的第一方面涉及具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽，所述多肽选自(a)包含SEQ ID NO28或30氨基酸序列或其一部分的多肽；
(b)具有在SEQ ID NO28或30氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽；和(c)具有与SEQ ID NO28或30氨基酸序列有至少30％同源性的氨基酸序列的多肽。
本发明的第二方面涉及编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的核酸，所述核酸选自以下(a)编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO28或30氨基酸序列或其部分；(b)编码多肽的核酸，所述多肽具有在SEQ ID NO28或30氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的氨基酸序列；(c)包含SEQ ID NO27或29核苷酸序列的核酸；(d)由在SEQ ID NO27或29核苷酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个核苷酸的核苷酸序列组成的核酸；(e)在严格条件下能够与(a)至(d)中任一项的核酸或它们的互补链杂交的核酸；和(f)具有与SEQ ID NO27或29核苷酸序列有至少50％同源性的核苷酸序列的核酸。
根据所述第二方面，提供具有下面活性的多肽转化硫酸化岩藻半乳聚糖成为更小分子，释放至少一种选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的化合物

其中R是H或SO3H。
本发明的第三方面涉及包含所述第二方面的核酸的重组DNA。
本发明的第四方面涉及以微生物、动物细胞或植物细胞作为宿主细胞的表达载体，在所述表达载体中插入所述第三方面的重组DNA。
本发明的第五方面涉及用所述第三方面的重组DNA或所述第四方面的表达载体转化的转化子。
本发明的第六方面涉及用于生产具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的方法，所述方法包括培养所述第五方面的转化子；然后从所述培养物收集具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。
本发明的第七方面涉及通过培养大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pEA101(FERM BP-8149)或大肠杆菌BL21(DE3)/pEB101(FERM BP-8150)可以获得的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。
本发明的第八方面涉及通过将具有所述第一或第七方面的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖而可以获得的更小分子。
本发明的第九方面涉及从硫酸化岩藻半乳聚糖生产更小分子的方法，所述方法包括使具有第一或第七方面的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖。
根据所述第九方面，提供用以使具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于脱乙酰硫酸化岩藻半乳聚糖的方法。
本发明的第十方面涉及筛选编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因的方法，所述方法包括使用所述第二方面的基因或其部分作为探针，筛选编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因。
本发明的第十一方面涉及分析多糖结构的方法，所述方法包括使所述第一方面或第七方面具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖。
发明详述下面将详细解释本发明。
本文所用的硫酸化岩藻半乳聚糖指如WO 00/50464所述的包含硫酸化岩藻糖的多糖。所述硫酸化岩藻半乳聚糖主要包含半乳糖和岩藻糖作为组成糖，这两种组成糖的摩尔比是1∶1至6∶1。所述硫酸化岩藻半乳聚糖的例子包括包含的半乳糖和岩藻糖的摩尔比为2∶1的硫酸化岩藻半乳聚糖。所述硫酸化岩藻半乳聚糖是硫酸化多糖，根据例如HPLC凝胶过滤法测定，其平均分子量约130,000(分子量分布约100,000至约200,000)。根据用于生产所述硫酸化岩藻半乳聚糖的原材料的收获时间、用于干燥所述原材料的方法以及用于贮存所述原材料的方法，所述硫酸化岩藻半乳聚糖的分子量、糖组成、乙酰基团含量以及硫酸基团含量可能有所不同。此外，根据用于提取所述硫酸化岩藻半乳聚糖的加热条件、pH等，这些指标也可能有所不同。例如，可以用酸水解所述硫酸化岩藻半乳聚糖。因此，本文所述的硫酸化岩藻半乳聚糖的分子量、分子量分布、糖组成、乙酰基团含量或硫酸基团含量仅作例示，根据用于提取所述硫酸化岩藻半乳聚糖的条件，上述指标可能容易变化。例如，假如使用本文所述的U-岩藻多糖降解酶和F-岩藻多糖降解酶制备硫酸化岩藻半乳聚糖，则获得具有如上文所述糖组成和分子量的硫酸化岩藻半乳聚糖。因此，可以使用适当选定的制备条件制备具有任何分子量、分子量分布、糖组成、乙酰基团含量或硫酸基团含量的硫酸化岩藻半乳聚糖。例如，在所述硫酸化岩藻半乳聚糖的六个主要组成糖中，含有约五个硫酸基团残基。一般地说，通过酯键连接到糖上的硫酸基团在化学上不稳定，容易用酸、碱或热将其解离。例如，在酸性条件或碱性条件下加热会降低硫酸基团含量。也就是说，可以有意地对所述硫酸化岩藻半乳聚糖进行脱硫酸化。通过适当选择脱硫酸化时酸或碱的类型和/或浓度以及温度和/或加热时间，能够控制要解离的硫酸基团的量。同样，可以用相似方式解离通过酯键连接的乙酰基。因此，本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖包括所有那些来自褐藻的具有上文所述特征的硫酸化岩藻半乳聚糖或通过本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的作用转化为更小分子的硫酸化岩藻半乳聚糖。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的主要骨架由以下通式(V)所示。所述硫酸化岩藻半乳聚糖包括所述通式所示的硫酸化岩藻半乳聚糖，其中n为1或1以上的整数，例如1至1000，优选是1至500。
其中R是H、SO3H或COCH3。
可以用于制备本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的褐藻的例子包括但不限于Kjellmaniella crassifolia、裙带菜(Undaria pinnatifida)、海带(Laminaria japonica)、Eisenia bicyclis、Ecklonia cava、昆布(Ecklonia kurome)、Lessonia nigrescence、giant kelp和durvillaea。虽然不意味着限制本发明，但例如来自Kjellmaniella crassifolia的岩藻多糖包含U-岩藻多糖、F-岩藻多糖和G-岩藻多糖。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的盐可以采用药学上可接受的盐。所述盐的例子包括碱金属例如钠和钾的盐、碱土金属例如钙和镁的盐、过渡金属例如锌的盐以及铵盐。
本文所用的来自硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子指在还原端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖，可以通过使本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖而获得。
下文将更详细地描述本发明。
(1)具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽本文所用的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽(本文也简称为硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶)指这样的多肽所述多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖或脱乙酰基硫酸化岩藻半乳聚糖，转化所述硫酸化岩藻半乳聚糖成为更小分子，并产生在还原端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖。WO 97/26896描述的能降解包含硫酸化岩藻糖的多糖-F的内切型含硫酸化岩藻糖的多糖的降解酶的酶并不能降解本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。
本发明的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的一个例子是依照本发明分离和纯化的产自黄杆菌SA-0082的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。所述硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶是一种以内切方式降解硫酸化岩藻半乳聚糖内D-硫酸化半乳糖或乳糖和D-硫酸化半乳糖或乳糖之间的β1-6键和β1-4键的酶。
生产本发明的降解硫酸化岩藻半乳聚糖的酶的菌株的例子是WO 97/26896中描述的黄杆菌SA-0082。黄杆菌SA-0082于1995年3月29日保藏于国际专利生物保藏单位National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM P-14872，以及保藏于国际专利生物保藏单位NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，保藏号为FERM BP-5402(要求传送到国际保藏单位的日期1996年2月15日)。
本发明的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的例子是如下产自黄杆菌属细菌的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽(I)作用于包含1∶1至1∶6摩尔比的半乳糖和岩藻糖作为组成糖的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐，将所述硫酸化岩藻半乳聚糖转化为更小分子，并产生在其还原端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；(II)最适pH为约7至9；和
(III)最适温度为约25至45℃。
本发明的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽不仅包括天然存在的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶，而且包括具有由于天然存在的氨基酸序列内某氨基酸的缺失、取代、插入或添加而获得的修饰氨基酸序列并具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。所述天然存在的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的例子包括但不限于产自黄杆菌属细菌的酶，以及产自例如其它细菌、酵母、丝状真菌、子囊菌和担子菌的微生物及植物和动物的酶，只要它们具有与本发明的酶的氨基酸序列或核苷酸序列同源的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的多肽包括这样的多肽具有在SEQ ID NO28或30氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的氨基酸序列，并且具有在功能上等价的活性，只要其表现出降解硫酸化岩藻半乳聚糖的活性。
本文所用的具有在功能上等价的活性的多肽指以下多肽。
在天然存在的蛋白中可能产生氨基酸序列内的突变，例如氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代。所述突变可能由于多态性或编码所述蛋白的基因的突变产生，或者由于体内修饰反应或者在蛋白合成后的纯化过程中的修饰反应产生。已知所述突变蛋白可能仍然表现与未突变蛋白在实质上等价的生理活性或生物学活性。具有在功能上等价的活性的多肽指这样的多肽尽管存在结构上的差异，但在功能上没有鉴定出显著差异。
这适用于所述突变被人工引入其氨基酸序列的蛋白。在这种情况下，有可能产生更多不同的突变。只要所述突变多肽表现出与不经突变的多肽实质等价的生理活性，就可认为所述突变多肽是具有在功能上等价的活性的多肽。
例如，据说在许多情况下，通过甲硫氨酸氨肽酶的作用可以除去大肠杆菌表达的蛋白中N末端的甲硫氨酸残基，而且根据所述蛋白的类型，可以既产生具有甲硫氨酸残基的蛋白又产生不具有甲硫氨酸残基的蛋白。在许多情况下，所述甲硫氨酸残基的存在不影响所述蛋白的功能。此外，已知其人白介素-2(IL-2)氨酸序列中半胱氨酸残基被丝氨酸残基所取代的多肽保留白介素-2的活性(Science，2241431(1984))。因此，尽管存在氨基酸取代，目的活性仍能表现出来。
在许多情况下，具有在功能上等价的活性的多肽相互同源。因此，与本发明多肽同源并且具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽包括在本发明内。
可以使用例如计算机程序DNASIS-Mac(Takara Shuzo)，计算机算法FASTA(版本3.0；Pearson，W.R.等，Pro.Natl.Acad.Sci.，852444-2448，1988)或计算机算法BLAST(版本2.0；Altschul等，NucleicAcids Res.，253389-3402，1997)测定同源性。
与本文公开的氨基酸序列(SEQ ID NO28或30)有30％或更高氨基酸序列同源性、优选40％或更高氨基酸序列同源性、更优选50％或更高氨基酸序列同源性、最优选59％或更高氨基酸序列同源性的多肽，只要其具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性，都包括在本发明中。
只有在任何含有包含硫酸化岩藻糖的多糖的组分中含有的硫酸化岩藻半乳聚糖，才能够使用本发明的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽将其转化成为更小的分子。因此，使用所述多肽以及分子量分级分离，能够选择性除去硫酸化岩藻半乳聚糖。例如，已经报道包含硫酸化岩藻聚糖的组分具有各种生物学功能，例如抗凝血活性、抑制癌转移活性以及抑制病毒感染活性。从褐藻获得的含有硫酸化岩藻聚糖的组分包含硫酸化岩藻聚糖和其它多糖。利用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶，可以从包含硫酸化岩藻聚糖的组分中除去硫酸化岩藻半乳聚糖。因此，可以获得高纯度的硫酸化岩藻聚糖。
此外，例如已经报道硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖具有诱导细胞凋亡以对抗肿瘤细胞的活性。利用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶，可以容易地除去从褐藻获得的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖中混杂的硫酸化岩藻半乳聚糖。因此，可以方便地获得高纯度的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
例如，使用除去硫酸化岩藻半乳聚糖的方法，制备包含硫酸化岩藻半乳聚糖的材料在水性溶剂中的溶液。所述的包含硫酸化岩藻半乳聚糖的材料可按常规方法溶解。所述的包含硫酸化岩藻半乳聚糖的材料可以最大浓度溶解于所述溶液中。然而，通常要考虑操作性和需要使用的酶的效价以选定所述浓度。根据不同目的，用于溶解硫酸化岩藻半乳聚糖的溶剂可以选自水、缓冲剂等。通常所述溶液的优选pH近乎中性。然后将本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶或固定化有所述酶的物质或者上述二者加入所述包含硫酸化岩藻半乳聚糖的材料的并与之溶液反应，以将硫酸化岩藻半乳聚糖转化为更小的分子。所述酶反应通常在约30℃下进行。根据随后步骤中分子量分级分离的能力，可以合适地调整用酶量和反应时间等。对得到的混合物进行分子量分级分离，可以容易地制备去除了来自硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子的目的产物。可以应用进行分子量分级分离的常规方法，例如凝胶过滤和利用分子量分级分离膜的超滤。
由于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖，因此可以将其应用于对硫酸化岩藻半乳聚糖的结构分析。
此外，使用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶，可以从包括硫酸化岩藻半乳聚糖在内的包含硫酸化岩藻糖的多糖的混合物中，选择性地去除硫酸化岩藻半乳聚糖成分。例如，从中去除硫酸化岩藻半乳聚糖成分的高纯度硫酸化岩藻聚糖或硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖可以优选用作药物的原材料。
(2)编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的酶编码具有在功能上等价的活性的多肽的基因在许多情况下是相互同源的。因此，本发明包括能够在严格条件下与根据本发明使用的基因杂交且编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因。
可以使用计算机程序DNASIS-Mac或计算机算法FASTA(版本3.0)或BLAST(版本2.0)测定核苷酸序列之间的同源性。
本发明的核酸是编码本发明多肽的核酸。具体地说，本发明的核酸包括(1)编码如下多肽的核酸所述多肽包含SEQ ID NO28或30氨基酸序列，或者具有在SEQ ID NO28或30氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的氨基酸序列且表现出硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性；(2)包含SEQ ID NO27或29核苷酸序列的核酸；或(3)能够在严格条件下与(1)或(2)的核酸杂交的核酸，或者具有与(1)或(2)的核苷酸序列有50％或更高同源性、优选60％或更高同源性、更优选65％或更高同源性、最优选69％或更高同源性的核苷酸序列并编码表现出硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的核酸。
本文所用的核酸指单链或双链DNA或RNA。例如，假如上文(2)的核酸是RNA，该核酸就用在SEQ ID NO27核苷酸序列中用U取代T的核苷酸序列代表。
例如，可以如下获得本发明的核酸。
可以如下分离上文(2)包含SEQ ID NO27或29核苷酸序列的核酸。根据常规方法，从产生具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的微生物、植物、动物等制备基因组DNA。用所述基因组DNA构建DNA文库。可以从所述DNA文库分离所述核酸。同样，通过以所述基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)中扩增包含SEQID NO27或29核苷酸序列的核酸，可以获得所述核酸。
此外，在本发明提供的编码本发明多肽的核酸的核苷酸序列(如SEQ ID NO27或29核苷酸序列)的基础上，可以获得编码与本发明多肽具有相似硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的核酸。具体地说，使用编码本发明多肽的核酸或所述核苷酸序列的一部分作为杂交探针，由从细胞提取的DNA或由使用所述DNA作为模板获得的PCR产物等，可以筛选编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的DNA。或者，使用在上文提到的核苷酸序列基础上设计的引物，应用基因扩增方法例如PCR，可以扩增编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的DNA。此外，可以化学合成编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的DNA。可以根据所述方法获得上文(1)或(3)的核酸。
可以根据上文提到的方法获得仅包含目的核酸的一部分的核酸片段。在这种情况下，可以如下获得完整的目的核酸。检查获得的核酸片段的核苷酸序列，确认所述片段是目的核酸的一部分。使用所述核酸片段或其部分作为探针进行杂交。或者，使用在所述核酸片段的核苷酸序列基础上合成的引物进行PCR。
假如所述核苷酸序列已知，可以使用计算机程序例如OligoTM引物分析软件(Takara Shuzo)，设计对于要使用的目的、条件或环境有最佳序列的探针或引物。
“在严格条件下杂交”指能够在如T.Maniatis等(主编)，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)中描述的条件下杂交，例如在以下条件下杂交。简要地说，固定有核酸的膜与探针在含0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400和0.01％变性鲑鱼精子核酸的6×SSC(1×SSC0.15M NaCl，0.015 M柠檬酸钠，pH7.0)中50℃下温育12至20小时。温育后，37℃下在含0.5％SDS的2×SSC中洗涤膜，同时将SSC浓度降至0.1x，将温度升至50℃，直到固定化核酸的信号能够与背景区分开来，然后检测探针。可以根据如上文所述方法测定如此获得的新型核酸编码的蛋白的活性，由此确认所述核酸是否是所需的核酸。
假如使用寡核苷酸探针，那么“严格条件”指，例如在含6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt’s和0.01％变性鲑鱼精子核酸的溶液中在[Tm-25℃]的温度下温育过夜，虽然这并不是限制本发明。
可以根据例如以下方程确定寡核苷酸探针或引物的TmTm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中N是所述寡核苷酸探针或引物的链长；％G+C是所述寡核苷酸探针或引物中鸟嘌呤残基和胞嘧啶残基的含量。
假如所述寡核苷酸探针或引物的链长短于18个核苷酸，那么可以Tm估计为例如A+T(腺嘌呤和胸腺嘧啶)残基数目乘以2的乘积(℃)与G+C残基数目乘以4的乘积(℃)之和[(A+T)×2+(G+C)×4]。
如上文所述，能够在严格条件下与编码本发明多肽的核酸杂交的核酸，只要能编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽，即使它不具有与本文公开的核苷酸序列相同的核苷酸序列，都包括在本发明中。
一旦选定包含目的DNA片段的载体，可以根据常规方法例如双脱氧法(Proc.Nat.Acad.Sci，U.S.A.，745463(1977))，确定插入所述载体的目的DNA片段的核苷酸序列。有可能获得关于所述DNA片段中基因结构和所述基因编码的多肽的氨基酸序列的信息。通过将已确定的核苷酸序列与已经分析的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的N末端、一种或多种部分氨基酸序列、分子量等进行比较，可以获得上述信息。
使用在所述硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶部分氨基酸序列的基础上制备的寡核苷酸，可应用PCR方法获得编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因。具体地说，应用使用盒DNA(TakaraShuzo)的PCR方法，在关于氨基酸序列的少量信息基础上，短时间内就可以获得适用于杂交的目的基因片段。
例如，用合适限制酶消化根据常规方法从培养的黄杆菌SA-0082细胞提取的基因组DNA，然后与具有已知序列的合成DNA(盒DNA)连接。通过使用所述连接混合物作为模板，应用在上文关于所述部分氨基酸序列的信息基础上设计的基因特异性寡核苷酸引物以及与所述盒DNA互补的寡核苷酸引物(盒引物)进行PCR，可以扩增目的DNA片段。例如，可以使用得自Takara Shuzo的DNA作为所述盒DNA或所述盒引物。所述盒DNA优选包含对应于两个盒引物的序列。使用下面程序是有效的使用对应于接受连接的限制酶位点远端的序列的引物进行第一次PCR，然后使用所述第一次PCR的部分反应混合物作为模板以及使用对应于内部序列的引物，进行第二次PCR。至于所述基因特异性寡核苷酸引物，通过设计并合成两个邻近的基因特异性寡核苷酸引物，使用上游引物进行第一次PCR，下游引物进行第二次PCR，可以增加对所述基因的特异性以及特异性扩增目的DNA片段的可能性。
用于连接所述盒DNA的限制酶位点不一定位于适于由编码所述部分氨基酸序列进行PCR扩增反应的距离，因为目的基因的核苷酸序列是未知的。因此，有必要检查盒DNA对于各种限制酶位点的应用。此外，在例如Erlich，H.A.(主编)PCR Technology，Stockton Press，1989中描述的通用条件下，可以进行PCR。然而，有必要根据所要使用的合成寡核苷酸长度或者与编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶活性的多肽的基因的互补性，选择最佳条件，以使非特异性扩增带最小化。通过检查退火温度、循环次数、镁浓度、抗热性聚合酶浓度等，可以完成所述选择。
所述PCR反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳以确认扩增的DNA片段。在根据常规方法提取和纯化所述片段的核苷酸序列并将其插入常规克隆载体(如pUC18或pUC19)后，可以根据例如双脱氧法分析所述片段的核苷酸序列。或者，可以使用用于所述PCR的所述盒引物直接分析回收的扩增DNA片段的核苷酸序列。假如分析揭示除获得所述引物序列外，还获得编码以前确定的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶部分氨基酸序列的DNA片段，那么就获得编码所述酶的基因片段或与其同源的基因。
假如通过上文所述DNA印迹杂交法或PCR方法获得的DNA片段是编码目的基因的一部分，那么可以如下获得包含编码目的酶的完整基因的DNA片段使用所述DNA片段作为探针，通过杂交筛选基因组文库，或者使用在所述DNA片段核苷酸序列基础上制备的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用如此获得的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶基因或其部分作为引物，通过DNA印迹杂交法分析得自黄杆菌SA-0082的基因组DNA。然后根据检测到的带的位置，可以获得有关包含编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因的黄杆菌SA-0082基因组DNA限制片段的大小的信息。此外，根据检测到的带的数目，可以估计编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因或者与其有互补性的基因的数目。可以根据上文所述的方法分离包含所述基因的DNA片段。
有可能如下确认如此获得的DNA片段是否包含编码目的酶的基因构建包含所述最后分离的DNA片段的表达载体，用所述载体转化宿主，培养转化子，确定所表达的多肽降解硫酸化岩藻半乳聚糖的活性。
(3)转化子，所述转化子包含编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因通过将编码本发明多肽的核酸(如具有SEQ ID No27或29核苷酸序列的核酸)连接到合适载体，可以构建重组DNA。对于用于构建重组DNA的载体没有具体限制。例如，可以使用质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。可选择适于重组DNA既定用途的合适载体。
此外，通过将重组DNA引入合适宿主，可以产生转化子。对用于产生转化子的宿主没有具体限制。可以使用微生物例如细菌、酵母和丝状真菌，以及来自动物、植物、昆虫等的培养细胞。通过培养所述转化子以在培养物中产生本发明的多肽，可以大量产生本发明的多肽。
可以从用包含本发明核酸(如具有SEQ ID NO27或29核苷酸序列的核酸)的重组DNA转化的转化子获得本发明的多肽。分别从具有SEQ ID NO27和29核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO28和30氨基酸序列的多肽。
本发明将在下文以黄杆菌SA-0082为例更具体地描述。
指示为黄杆菌SA-0082的微生物按照布达佩斯条约保藏于国际专利生物保藏单位National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology，保藏号为FERM BP-5402。
例如，可以利用杂交方法、PCR方法或它们的组合，获得编码黄杆菌SA-0082产生的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因。所述方法需要能够与所述基因杂交的探针或者能够用于通过PCR方法扩增所述基因或其部分的引物。然而，由于该菌株产生的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的氨基酸序列或编码该多肽的基因的结构完全未知，因此不可能制备可以用作探针或引物的合成寡核苷酸。因此，首先确定该微生物产生的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的部分氨基酸序列，以检查可以用作探针或引物的合成寡核苷酸的制备。
培养黄杆菌SA-0082，然后从培养物分离和纯化该微生物产生的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶。然后获得关于所纯化的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的部分氨基酸序列的信息。例如，如下确定部分氨基酸序列根据常规方法，通过Edman降解直接对所述硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶进行氨基酸序列分析，确定所述硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的N末端氨基酸序列。例如，可以使用蛋白质序列分析仪476A(Applied Biosystems)进行所述分析。由于从黄杆菌SA-0082纯化的所述酶的多肽N末端被封闭，无法获得关于N末端氨基酸序列的信息。在这种情况下，通过用高度特异性的蛋白水解酶(如无色杆菌(Achromobacter)蛋白酶I、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶)作用于所纯化的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶，对所述硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶进行有限蛋白水解。使用反相HPLC分离和纯化获得的肽片段。由此，通过对所纯化的肽片段进行氨基酸分析，可以获得关于氨基酸序列的大量信息。
在选定的关于如上文所述获得的所述硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶特异性的部分氨基酸序列的信息的基础上，设计和合成具有简并核苷酸序列的寡核苷酸。有必要合成具有低简并性的长寡核苷酸，即对编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因具有高度特异性的寡核苷酸。所述寡核苷酸的设计是克隆编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因的一个重要因素。
其次，有必要检查所述合成寡核苷酸与编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖活性的多肽的基因之间使用DNA印迹杂交方法进行特异性杂交所使用的条件。
例如，来自黄杆菌SA-0082的基因组DNA，根据常规方法用合适的限制酶完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后印迹转移到尼龙膜等上。如下进行杂交。例如，将所述尼龙膜在含6×SSC(1×SSC在1升水中含8.77g氯化钠和4.41g柠檬酸钠的溶液)，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml鲑鱼精子DNA和5×Denhardt’s(含0.1％浓度的牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)的预杂交溶液中65℃下温育几小时进行封闭。然后在其中加入所述合成寡核苷酸(例如用32P标记)后，在42℃下温育过夜。所述尼龙膜在含0.1％SDS的1×SSC中42℃下洗涤30分钟，然后通过放射自显影检测与所述合成寡核苷酸探针杂交的DNA片段。根据与编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因的互补性或者所使用的合成寡核苷酸的长度，检查温育温度、洗涤溶液的盐浓度等以选择最佳条件是有效的。
可以如下获得检测到的包含编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因的DNA片段。从凝胶上提取和纯化对应于所检测到的条带的位置的DNA片段，将其插入用于常规宿主-载体系统的载体以制备文库。然后在与DNA印迹杂交方法所使用的条件相似条件下，进行集落或噬菌斑杂交，筛选和分离包含目的DNA片段的克隆。或者，将用合适限制酶消化的来自黄杆菌SA-0082的基因组引入用于常规宿主-载体系统的载体制备文库，通过杂交方法相似地从所述文库直接筛选和分离包含目的DNA片段的克隆。
通过将如此获得的核酸与合适载体连接，可以构建重组DNA。对用于构建所述重组DNA的载体没有具体限制。例如，可以使用质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。可选择适于所述重组DNA的既定用途的合适载体。此外，通过将所述重组DNA引入合适宿主，可以产生本发明的转化子。对用于产生所述转化子的宿主没有具体限制。可以使用微生物例如细菌、酵母和丝状真菌，以及来自动物、植物、昆虫等的培养细胞。
(4)用于产生本发明多肽的方法可以使用已知的宿主-载体系统。例如，可以使用用于大肠杆菌宿主的质粒载体(如pUC18或pUC19)或噬菌体载体(如λ噬菌体)，但这并不意味着限制本发明。可以使用所述宿主-载体系统常用的类型或处理方法(例如，如J.Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中所述)。
当一种蛋白使用遗传工程技术生产时，它通常被表达为融合蛋白。例如，可以将来自另一蛋白的N末端肽链加入目的蛋白的N末端，以增加目的蛋白的表达水平。或者，可以在目的蛋白的N末端或C末端添加合适的肽链，以促进通过使用对所述添加的肽链有亲和性的载体对表达的目的蛋白的纯化。
此外，可以如下表达目的蛋白将编码在目的蛋白的N末端或C末端缺失几十个氨基酸的蛋白的基因插入表达载体。
在许多情况下，即使目的蛋白氨基酸序列中缺失、添加、插入和/或取代一个或多个氨基酸残基，多肽仍然可能具有与目的蛋白在功能上等价的活性。所述多肽或编码所述多肽的基因，不论它是天然存在的分离物或人工产生的，都包括在本发明中。
众所周知，每个氨基酸分配有一个至六个密码子(一个密码子是三个碱基的组合)，所述一个到六个密码子定义基因中的一个氨基酸。因此，许多基因可能编码一个特定氨基酸序列，虽然这取决于氨基酸序列。基因在自然界中不一定是稳定的。在核酸中产生突变并非不常见。在基因中产生突变可能不改变所编码的氨基酸序列(称为沉默突变)。在这种情况下，可以说产生了编码同一氨基酸序列的不同基因。因此，不可否认，在包含编码一种特定氨基酸序列的分离基因的生物的传代过程中，可能产生编码同样氨基酸序列的不同基因。此外，假如人们使用各种遗传工程技术，那么人工产生编码同样氨基酸序列的不同基因并不困难。
例如，假如在编码目的蛋白的原始基因中使用的密码子是在用以使用遗传工程技术产生所述蛋白的宿主中使用率低的密码子，那么所述蛋白的表达水平可能低下。在这种情况下，将所述密码子人工转变成为在所述宿主中经常使用的密码子，同时不改变所编码的氨基酸序列，旨在提高目的蛋白的表达水平。当然，如上文所述，可以人工产生编码一种特定氨基酸序列的各种基因。因此，所述人工产生的不同多核苷酸，只要它编码本文公开的氨基酸序列，都包括在本发明中。已知一些多肽具有对它们的活性并非不可缺少的肽区。例如，所述肽区的例子有分泌到细胞外的多肽中的信号肽和蛋白酶前体中的原序列或前原序列。翻译后或转化成为活性多肽后，大多数所述肽区被去除。虽然所述多肽具有不同的一级结构，但它最后表现出等价的功能。所述信号肽、原序列或前原序列可能抑制活性肽的表达。在这种情况下，通过从所述多肽的N末端缺失几个氨基酸残基至几十个氨基酸残基，可以增加所述活性肽的产量。
从培养其中引入本发明质粒(pEA101或pEB101)的转化子获得的培养物中，可以纯化本发明的多肽。
对转化宿主没有具体限制。所述宿主的例子包括在重组DNA领域常规使用的那些宿主，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酵母、丝状真菌、植物、动物、植物培养细胞和动物培养细胞。
例如，本发明的多肽可以如下在培养细胞中表达。在常规培养条件下，例如在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，5g/l NaCl，pH7.2)中37℃下培养大肠杆菌细胞直到对数生长期，所述大肠杆菌细胞携带这样的质粒，即质粒中本发明的核酸连接到T7噬菌体启动子的lac启动子的下游。然后在所述培养物中加入异丙基β-D-硫代吡喃型半乳糖苷至1mM的终浓度，继续在37℃下培养细胞。此外，可能表达在所述肽的N末端有缺失的多肽。例如，本发明肽sfgA和sfgB的表达水平可以通过从全长氨基酸序列的N末端分别缺失23个和30个氨基酸残基而得以提高。
培养后通过离心收集细胞，超声破碎，离心收集上清液，作为无细胞提取物。所述无细胞提取物表现出硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性。可以使用已知方法，例如离子交换色谱、凝胶过滤、疏水色谱和硫酸铵沉淀，可从所述无细胞提取物中纯化本发明的多肽。自然地，在上述纯化过程中获得的部分纯化产物也表现硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性。
(5)筛选编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因的方法例如，通过使用本发明基因的核苷酸序列进行的杂交，可以应用下面方法获得编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性或在功能上等价的活性的多肽的基因。
依照常规方法，将从目的基因来源获得的染色体DNA或用逆转录酶从mRNA制备的cDNA与质粒或噬菌体载体连接。将所述连接混合物引入宿主，制备文库。在平板上培养所述文库，将长出的集落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。通过变性，将所述DNA固定化到所述膜上。所述膜在含有探针(例如用32P标记)的溶液中温育，在所述膜上的DNA和所述探针之间形成杂种。可以使用编码包含SEQ ID NO28或30氨基酸序列或其部分的氨基酸序列的核苷酸序列(如SEQ ID NO27或29核苷酸序列或其部分)作为探针。例如，在含6×SSC、1％SDS、100μg/ml鲑鱼精子DNA和5×Denhardt’s的溶液中，具有所述固定化DNA的膜与探针在65℃下杂交20小时。杂交后，洗去非特异性吸附的探针，通过放射自显影等鉴定与所述探针形成杂种的集落。重复该程序，直到获得单一的杂交集落。将编码目的多肽的基因插入如此获得的集落。
测定所述基因的核苷酸序列，例如按下文所述进行测定，确认所述基因是否编码具有目的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性或等价功能活性的多肽。假如所述转化子是用质粒转化的大肠杆菌细胞，那么如下测定所述核苷酸序列。将所述转化子在试管等中进行培养，根据常规方法提取质粒。用一种限制酶(或多种限制酶)切割所述质粒，获得所述插入片段。将所述片段亚克隆进M13噬菌体载体等。然后，根据双脱氧方法测定所述核苷酸序列。假如所述重组子使用噬菌体载体，那么可以使用基本相似的步骤测定核苷酸序列。从培养到核苷酸序列测定的基本实验方法在例如J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory 1989中描述。
为证实所述基因是否编码具有目的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性或在功能上等价的活性的多肽，将测定的核苷酸序列或编码的氨基酸序列与SEQ ID NO27或29核苷酸序列或者SEQ ID NO28或30氨基酸序列进行比较。
假如获得的基因不包含编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性或在功能上等价的活性的多肽的完整区，那么可以如下测定与本发明基因杂交的所述完整编码区的核苷酸序列使用基于所获得的基因制备的合成DNA引物，通过PCR扩增缺失的区，或者使用所述基因片段作为探针，进一步筛选DNA文库或cDNA文库。
或者，可以根据本发明基因的核苷酸序列设计用于PCR的引物。通过使用所述引物进行PCR，可以检测与本发明基因高度同源的基因片段，或者可以获得所述完整的基因。
表达所述基因，测量所述基因产物的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性，以确定所述基因的功能。
如上文所述，本发明提供具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的一级结构以及编码所述多肽的基因的结构。此外，现在有可能使用遗传工程技术产生具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性或在功能上等价的活性的多肽。
通过使用应用本发明遗传工程技术的生产方法，有可能以低成本获得具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性或在功能上等价的活性的高纯度多肽。
在一种通过培养生产硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的黄杆菌属细菌生产硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的方法中，同时还产生蛋白酶和其它多糖降解酶。因此，有必要将所述目的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶与所述非常麻烦的酶分离和纯化开来，以分离目的酶。现在有可能根据本发明以低成本提供具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的高纯度多肽。
例如，可以如下确认由依照本发明的核苷酸序列编码的多肽的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性使用HPLC分析使所述多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖的降解产物，以确定转化成为更小分子的转化率，或者根据常规方法测量产生的还原端。
(6)从硫酸化岩藻半乳聚糖生产更小分子的方法以及生产方法中脱乙酰作用的效应可以如下制备从本发明硫酸化岩藻半乳聚糖获得的更小分子或其盐使本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖或包含硫酸化岩藻半乳聚糖的材料。例如，来自硫酸化岩藻半乳聚糖的部分纯化产物、从褐藻得到的包含硫酸化岩藻糖的多糖的组分、用水性溶剂提取褐藻获得的产物或者褐藻本身可以优选用作包含硫酸化岩藻半乳聚糖的材料。
使本发明基因编码的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖获得的更小分子的例子包括但不限于二糖到六糖。在所述更小分子上硫酸基团的取代位置可能根据制备方法而有所不同。通过本发明硫酸化岩藻半乳聚糖降解多肽作用获得的所有更小分子都包括在本发明的更小分子中。例如，所述更小分子的化学结构用以下通式(I)至(IV)表示。其中，通式(III)应该是硫酸化岩藻半乳聚糖的组成单位。


其中R是H或SO3H。
本发明的所述更小分子在分子内有硫酸基团，这些基团与不同碱反应，形成盐。来自本发明硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子在盐形式下是稳定的。通常采用钠盐和/或钾盐和/或钙盐的形式提供所述更小分子。可以利用阳离子交换树脂如Dowex 50W(Dow Chemical)，从所述来自硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子的盐形式得到其游离形式。可选地进一步用常规盐交换处理所述更小分子的游离形式，将其转化为各种盐中的任何一种目的盐。
本发明来自硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子或其盐可以用作抗原。根据常规方法产生抗体。例如，通过用来自本发明硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子以及一种佐剂免疫动物(如兔)，可以制备多克隆抗体。此外，可以如下制备单克隆抗体将黑素瘤细胞与通过用抗原免疫获得的生产抗体的B细胞融合，选择产生目的抗体的杂交瘤，然后培养所述细胞。所述抗体可用于纯化来自本发明硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子或其盐。此外，识别来自本发明硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子或其盐的抗体可分析抑制受精的作用模式，分析抑制病毒感染的作用模式，分析硫酸化岩藻半乳聚糖、来自硫酸化岩藻半乳聚糖的更小分子或其盐的体内代谢等。
此外，通过用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐(即寡糖)获得的更小分子可以用作糖技术的试剂。可以如下提供作为糖技术试剂非常有用的物质例如，按照如JP-B5-65108中所述的方法用2-氨基吡啶(PA-标记)将所述更小分子酰胺化，制备所述更小分子的PA-衍生物。
根据用于从本发明硫酸化岩藻半乳聚糖生产更小分子的方法，通过将所述硫酸化岩藻半乳聚糖脱乙酰化，可以提高所述更小分子的产量。脱乙酰化方法包括但不限于在碱性水溶液中处理的方法和用脱乙酰酶处理的方法。例如，通过在1N氢氧化钠溶液中25℃下对硫酸化岩藻半乳聚糖脱乙酰24小时，可以提高所述更小分子的产量。因此，根据生产本发明的更小分子的方法硫酸化岩藻半乳聚糖或者脱乙酰硫酸化岩藻半乳聚糖可以优选用作原材料。
实施例下面的实施例进一步详细举例说明本发明，但不应当被解释为限制本发明的范围。
参考实施例1硫酸化岩藻半乳聚糖的制备用装备孔径1mm的筛网的切碎机(Masuko Sangyo)破碎2Kg干燥的Kjellmaniella crassifolia，在20L 80％乙醇中25℃下搅拌3小时，过滤，然后洗涤。得到的残余物悬浮于含50mM氯化钙、100mM氯化钠、10％乙醇和1U内切型的包含硫酸化岩藻糖的多糖的降解酶的20L 30mM咪唑缓冲液(pH8.2)。从如WO 97/26896中所述的交替单胞菌属(Alteromonas)细菌SN-1009(于1996年2月13日保藏在国际专利生物保藏单位National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号是FERM P-15436，以及保藏在国际专利生物保藏单位National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，保藏号是FERM BP-5747(要求传送到国际保藏单位的日期1996年11月15日))培养物中获得所述内切型降解包含硫酸化岩藻糖的多糖的酶。当所述悬浮液在25℃下搅拌2天后，由高分子量的包含硫酸化岩藻糖的多糖产生的高粘度和高弹性完全丧失。所述悬浮液通过孔径32μm的不锈钢筛网过滤，从所述包含硫酸化岩藻糖的多糖中除去更小分子，然后洗涤。得到的残余物悬浮于含100mM氯化钠、10％乙醇和4g褐藻酸盐裂合酶(Nagase Biochemicals)的40L磷酸钠缓冲液(pH6.6)中。所述悬浮液在25℃下搅拌4天，然后离心，获得上清液。使用装备有排阻分子量为100,000的中空纤维的超滤装置将所述上清液浓缩至2L，从所述上清液中包含的褐藻酸中去除更小分子。所述浓缩物的溶剂更换为含10％乙醇的100mM氯化钠。往所述溶液中加入等体积400mM乙酸钙。搅拌后，将沉淀物离心。在得到的上清液中加入1N盐酸，同时在冰上冷却，将pH调至2.0。离心除去形成的沉淀。在得到的上清液中加入1N氢氧化钠，将pH调至8.0。通过超滤将所述溶液浓缩至1L并将溶剂更换为100mM氯化钠。离心除去形成的沉淀。进行以下程序，以除去得到的上清液中的疏水性物质。往所述上清液中加入氯化钠至1M的终浓度。将所述混合物加载到用1M氯化钠平衡的3-L Phenyl-Cellulofine柱(SeikagakuCorporation)，收集流过的组分。各组分用超滤装置浓缩，更换溶剂为20mM氯化钠，然后冻干。冻干产物的重量是29.3g。
将15g所述冻干产物溶于含400mM氯化钠和9U内切型岩藻多糖降解酶的1.5L 50mM tris-盐酸缓冲液。从如WO 97/26896中所述的黄杆菌SA-0082(于1995年3月29日保藏在国际专利生物保藏单位National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号是FERM P-14872，以及保藏在国际专利生物保藏单位National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，保藏号是FERM BP-5402(要求传送到国际保藏单位的日期1996年2月15日))培养物获得所述内切型岩藻多糖降解酶。所述溶液在25℃下反应6天，然后使用蒸发器浓缩至约300ml。将所述浓缩物置于排阻分子量为3500的透析管中，完全透析，以从硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖中除去更小分子。将保留在透析管内的溶液加载到用50mM氯化钠平衡的4-L DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso Corporation)。用50mM氯化钠充分洗涤后，用50至650mM氯化钠梯度进行洗脱。用650mM氯化钠进一步从柱子完全洗脱。收集用650mM氯化钠洗脱的组分，作为硫酸化岩藻半乳聚糖组分，用排阻分子量为100,000的超滤装置进行浓缩，用10mM氯化钠进行溶剂交换后，冻干，获得0.85g硫酸化岩藻半乳聚糖组分的冻干产物。分析所述组分的糖组分。如Journal ofBiological Chemistry，175595(1948)所述测定岩藻糖的量。
将所述硫酸化岩藻半乳聚糖的干燥产物溶于1N盐酸至0.5％的终浓度。所述溶液在110℃处理2小时，水解成为组成单糖。用GlycoTAG(Takara Shuzo)和GlycoTAG试剂盒(Takara Shuzo)对水解获得的所述单糖的还原端进行吡啶基-(2)-氨基化(PA-标记)，使用HPLC测定组成糖的比例。如下进行HPLC。
仪器L-6200(Hitachi)；色谱柱Palpak A型(4.6mm×150mm；Takara Shuzo)；洗脱液700mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1；检测使用荧光检测器F-1150(Hitachi)，激发波长310nm，发射波长380nm；流速0.3ml/分钟；和柱温65℃。
如Analytical Biochemistry，4330(1962)所述测定糖醛酸的量。此外，如Biochemical Journal，84106(1962)所述测定硫酸盐的含量。
结果，所述硫酸化岩藻半乳聚糖含组成糖半乳糖和岩藻糖的摩尔比为约2∶1。其中基本不含糖醛酸或其它中性糖。岩藻糖和硫酸基团的摩尔比为约1∶2。
参考实施例2测量硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶活性的方法使用参考实施例1中获得的硫酸化岩藻半乳聚糖组分，如下测量硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性。简要地说，混合60μl50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)、4.8μl 2.5％硫酸化岩藻半乳聚糖组分的溶液、6μl 4M氯化钠、37.2μl水和12μl硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶。37℃下反应3小时后，在100℃下处理所述反应混合物10分钟。离心后，使用HPLC分析100μl上清液，测定转化为更小分子的转化率。作为对照，制备用溶解硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的缓冲液取代所述酶在相似条件下反应获得的反应混合物，以及用水取代硫酸化岩藻半乳聚糖组分进行反应获得的反应混合物，相似地用HPLC分析。
一单位酶定义为在以上提到的反应体系中1分钟内切割1μmol所述硫酸化岩藻半乳聚糖组分内半乳糖苷键的酶量。根据下面方程计算被切割的半乳糖苷键的量。
{(4.8×1000×2.5/100)MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.012)}＝U/ml4.8×1000×2.5/100加入反应体系的硫酸化岩藻半乳聚糖(μg)；MG作为底物的组分中硫酸化岩藻半乳聚糖的平均分子量；M反应产物的平均分子量；(MG/M)-1一分子硫酸化岩藻半乳聚糖中所述酶切割的键的数量；180反应时间(分钟)；和0.012酶溶液体积(ml)。
如下进行HPLC。
仪器L-6200(Hitachi)；色谱柱OHpak SB-806HQ(8×300mm；Showa Denko)；洗脱液含5mM叠氮化钠的50mM氯化钠；检测折射系数检测器(Shodex RI-71，Showa Denko)；流速1ml/分钟；和柱温25℃。
进行下面程序，以测定所述反应产物的平均分子量。使用与上面提到的HPLC分析相同的条件，分析分子量已知的商品支链淀粉(STANDARD P-82，Showa Denko)。将支链淀粉分子量与保留时间之间的关系表示为曲线，使用该曲线作为标准曲线，测定所述酶反应产物的分子量。
参考实施例3硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的制备如下制备在参考实施例2中描述的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶。将黄杆菌SA-0082(FERM BP-5402)接种于600ml培养基，在24℃下培养23小时，制备种子培养物，所述培养基由包含0.1％葡萄糖、1.0％蛋白胨和0.05％酵母膏(pH7.5)的人工海水(JamarineLaboratory)组成并在120℃下灭菌20分钟。在30L小型发酵罐中加入20L培养基，所述培养基由包含0.2％来自Kjellmaniella crassifolia的包含硫酸化岩藻半乳聚糖的多糖组分、2.0％蛋白胨、0.01％酵母膏和0.01％消泡剂(KM70，Shin-Etsu Chemical)的人工海水(pH7.5)组成，在120℃下灭菌20分钟。冷却后，将600ml所述种子培养物接种至所述培养基，在24℃、通气10 l/分钟和搅拌125rpm的条件下培养23小时。培养后，离心所述培养物，收集细胞。
将所述细胞悬浮于1,200ml含0.4M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中，超声破碎，然后离心获得细胞提取物。所述细胞提取物对同样的缓冲液充分透析，离心获得上清液。在所述上清液中加入硫酸铵至90％饱和的终浓度。离心收集形成的沉淀，溶于含50mM氯化钠的150ml 10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，然后对同样的缓冲液充分透析。将离心获得的上清液加载到用同样的缓冲液平衡的500-mL DEAE-Sepharose FF柱(Amersham Pharmacia)。用同样的缓冲液洗涤后，用50mM至600mM氯化钠梯度进行洗脱，收集活性组分。
所述活性组分对含0.1M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)充分透析，然后加载到用同样的缓冲液平衡的100-mL DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso Corporation)。用同样缓冲液洗涤后，用0.1M至0.4M氯化钠梯度进行洗脱，收集活性组分。在所述活性组分中加入氯化钠至4M的终浓度。将所述组分加载到用含4M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的20-mL Phenyl-Cellulofine柱(Chisso Corporation)。用同样的缓冲液洗涤后，用4M至1M氯化钠梯度进行洗脱。用含1M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)进一步进行完全洗脱，收集活性组分。在所述活性组分中加入氯化钠至3M的终浓度。将所述组分加载到用含3M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的10-mL Phenyl-Cellulofine柱(ChissoCorporation)。用同样的缓冲液洗涤后，用3M至0.5M氯化钠梯度进行洗脱。用含0.5M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)进一步进行完全洗脱，收集活性组分，即是纯化的酶。
实施例1硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶基因的克隆(1)基因组DNA的制备黄杆菌SA-0082(FERM BP-5402)是生产硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的菌株。将黄杆菌SA-0082接种于含500ml培养基的2L锥形瓶，在25℃下培养23小时，所述培养基由包含0.25％葡萄糖、1.0％蛋白胨和0.05％酵母膏的人工海水(Jamarine Laboratory)(pH8.0)组成并在120℃灭菌20分钟。培养后，将离心所述培养物收集的细胞的一半悬浮于10ml提取缓冲液(50mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，100mM乙二胺四乙酸(EDTA))。在其中加入1ml含20mg/ml溶菌酶(Sigma)的提取缓冲液溶液。所述混合物在冰浴上温育30分钟。在其中加入10ml蛋白酶K溶液(1mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)，50mMtris-盐酸缓冲液(pH8.0)，100mM EDTA，1％SDS)。所述混合物在50℃下温育2小时。将所述混合物冷却到室温，在其中加入等体积用TE缓冲液(10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，1mM EDTA)饱和的苯酚。温和搅拌所述混合物1小时。在10000rpm下离心20分钟后，收集上层。在所述上层中加入等体积用TE缓冲液饱和的酚/氯仿的1∶1混合液。温和搅拌所述混合物。在10000rpm下离心20分钟后，回收所述上层。再次进行苯酚/氯仿提取。在水相中加入氯化钠至0.1M的终浓度。在所述混合物中进一步加入两体积乙醇以沉淀DNA。使用玻棒缠绕所述DNA，用80％乙醇洗涤，然后轻微风干。将所述基因组DNA溶于20ml含20μg/ml核糖核酸酶A(Sigma)的TE缓冲液溶液。所述混合物在37℃下温育5小时以降解RNA。如上文所述，通过苯酚提取和苯酚/氯仿提取和随后加入乙醇，收集DNA，然后悬浮于5ml TE缓冲液。通过所述程序获得约20mg基因组DNA。
(2)构建基因组DNA文库的构建如下部分消化在实施例1-(1)中制备的100μg基因组DNA用10U限制酶Sau3AI(Takara Shuzo)在37℃处理1分钟40秒。所述混合物用苯酚/氯仿提取处理，然后收集上层。在所述上层中加入1/10倍体积3M乙酸钠水溶液(pH5.0)和2.5倍体积乙醇，沉淀DNA。离心收集沉淀，用80％乙醇洗涤，然后风干。将如此获得的部分消化产物用1.25-5M氯化钠密度梯度超速离心进行大小分级分离，然后通过乙醇沉淀从含大小为10到20kbp的DNA的组分中收集DNA。将0.2μg所述基因组DNA的部分消化产物和0.6μg λBlueSTARBamHI Arm(Novagen)混合，然后使用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo)将其相互连接。使用Gigapack II Gold试剂盒(Stratagene)将所述连接混合物包装进λ噬菌体，构建黄杆菌SA-0082基因组DNA文库。
(3)硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶的氨基酸序列的测定将84μg如参考实施例3中所述从黄杆菌SA-0082中获得的纯化的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶蛋白上样到用水平衡的脱盐柱(FastDesalting Column PC 3.2/10，Pharmacia)，用水洗脱以交换缓冲液。将洗脱液收集到玻璃小管中，浓缩到干燥。将包含所述样品的玻璃小管置于含200μl吡啶、40μl 4-乙烯基吡啶、40μl三-N-丁基膦和200μl水的更大玻璃试管中。将所述玻璃试管封口，在100℃下进行吡啶基-乙基化反应7分钟。反应后，取出所述玻璃小管，用水进行几轮共沸蒸馏以除去挥发性成分。
加入30μl含8M尿素的100mM tris-盐酸缓冲液(pH9.2)、30μl100mM tris-盐酸缓冲液(pH9.2)和40pmol无色杆菌属蛋白酶I(Takara Shuzo)，在37℃下过夜，消化如此获得的吡啶基-乙基化的硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶蛋白。使用HPLC系统(SMART System，Pharmacia)从得到的消化产物纯化肽片段。使用μRPC C2/C18 SC2.1/10柱(Pharmacia)，流速为100μg/ml。使用以下线性梯度方法进行洗脱，使用0.1％三氟乙酸水溶液(洗脱液A)和含0.1％三氟乙酸的乙腈(洗脱液B)进行洗脱。进样时洗脱液B的百分率是0％，在100分钟内其百分率提高到40％。在洗脱组分中，对含肽的组分进行氨基酸序列分析。于是，测定了部分氨基酸序列S21(SEQ ID NO1)、S23(SEQ ID NO2)、S39(SEQ ID NO3)、S42(SEQ ID NO4)、S49(SEQ ID NO5)、S162(SEQ ID NO6)和S292(SEQ ID NO7)。
(4)硫酸化岩藻半乳聚糖降解酶基因的核苷酸序列的测定用30 U限制酶BglII、EcoRI、EcoT14I、EcoT22I、HindIII、NcoI、PstI、SpeI或XbaI(全部来自Takara Shuzo)，在37℃下处理1.2μg实施例1-(1)中制备的基因组DNA 5小时。所述消化产物用苯酚/氯仿提取，然后通过乙醇沉淀收集。50ng盒与约0.6μg每种消化产物混合，然后使用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)连接。下面的盒用于各自的消化产物Sau3AI盒用于BglII消化产物；EcoRI盒用于EcoRI消化产物；PstI盒用于EcoT22I消化产物和PstI消化产物；HindIII盒用于HindIII消化产物；XbaI盒用于SpeI消化产物和XbaI消化产物(所有盒DNA都来自Takara Shuzo)。使用两种合成寡核苷酸(SEQ ID NO8和9)制备的NcoI盒与EcoT14I消化产物和NcoI消化产物连接。通过乙醇沉淀收集每种反应混合物，溶于5μl水中，用作使用盒DNA的PCR方法中的模板DNA。
在实施例1-(3)确定的部分氨基酸序列S39(SEQ ID NO3)的氨基酸1到7的序列和氨基酸8到15的序列的基础上，合成与所述氨基酸序列的寡核苷酸序列同一方向的混合寡核苷酸、SFG-391F引物(SEQ ID NO10)和SFG-392F引物(SEQ ID NO11)。此外，合成与所述氨基酸序列的寡核苷酸序列同一方向的混合寡核苷酸、在S42(SEQ ID NO4)的氨基酸6到14的序列的基础上的SFG-421F引物(SEQ ID NO12)，以及在氨基酸6到14序列的基础上的SFG-422F引物(SEQ ID NO13)和SFG-423F引物(SEQ ID NO14)。
将总体积为